肿瘤干细胞培养技术
肿瘤的细胞培养实验研究
肿瘤的细胞培养实验研究引言：细胞培养实验是现代生物医学研究中不可或缺的实验手段之一，它为了研究和分析生物体的细胞行为和生理过程提供了一种可控、可重复的实验环境。
在肿瘤方面，细胞培养实验可以帮助科研人员更深入地了解肿瘤细胞的生长、分化、生理功能以及药物对肿瘤细胞的影响。
本文将介绍肿瘤的细胞培养实验研究的基本过程、方法和应用。
一、肿瘤细胞培养实验的基本过程肿瘤细胞培养实验的基本过程主要包括细胞的收集、传代培养、细胞的鉴定和使用。
1.细胞的收集：肿瘤细胞可以通过肿瘤组织切片、原发培养物或小鼠移植瘤等方式收集。
为了避免细胞外污染，收集的过程需要在无菌条件下进行。
2.传代培养：收集到的肿瘤细胞需要在适当的培养基中进行传代培养，以保证细胞的生长和繁殖。
培养基中通常含有人工合成的营养物、生长因子和其他必需的成分。
3.细胞的鉴定：细胞的鉴定通常包括细胞学形态学观察、免疫细胞化学染色和细胞分子学鉴定等。
这些方法可以帮助科研人员确认培养的细胞是否为肿瘤细胞。
4.使用肿瘤细胞：经过鉴定的肿瘤细胞可以用于研究肿瘤发生机制、药物筛选、肿瘤模型制备以及其他科学研究。
二、肿瘤细胞培养实验的方法在肿瘤细胞培养实验中，常用的方法包括传统的贴壁培养法和悬浮培养法。
1.贴壁培养法：贴壁培养是最常见和最简单的肿瘤细胞培养方法。
在此方法中，肿瘤细胞会附着到培养皿的底部，并在培养基中生长繁殖。
这种方法适用于肿瘤细胞具有附着性的类型，如肺癌细胞、结肠癌细胞等。
2.悬浮培养法：悬浮培养法适用于肿瘤细胞具有悬浮生长的类型，如白血病细胞、淋巴瘤细胞等。
在此方法中，肿瘤细胞会悬浮在培养基中，并通过摇床等设备进行培养。
三、肿瘤细胞培养实验的应用肿瘤细胞培养实验在肿瘤研究中有着广泛的应用。
以下是其中的几个方面：1.研究肿瘤发生机制：通过细胞培养实验，科研人员可以对肿瘤细胞进行生长、增殖、分化、凋亡等方面的研究，从而深入了解肿瘤发生的机制。
2.筛选抗肿瘤药物：通过细胞培养实验，科研人员可以在体外模拟人体内的环境，研究不同药物对肿瘤细胞的毒性和治疗效果，从而筛选出潜在的抗肿瘤药物。
肿瘤干细胞的分离培养及其在肿瘤治疗中的应用
肿瘤干细胞的分离培养及其在肿瘤治疗中的应用随着医学技术的不断前进，对肿瘤治疗的研究也越来越深入。
其中，肿瘤干细胞的研究备受关注。
肿瘤干细胞是指在肿瘤中所存在的一小部分细胞，能够不断分裂增殖，并给予肿瘤再生的可能性。
因此，肿瘤干细胞的分离与培养以及在肿瘤治疗中的应用，成为了当今医学研究的热点话题。
一、肿瘤干细胞的分离方法目前，分离肿瘤干细胞的方法主要包括紫杉醇浸润法、细胞表面标记法、限制稀释法等。
其中，限制稀释法是较为常用的一种。
限制稀释法是将单个肿瘤细胞样本通过连续的稀释、培养与观察，逐渐筛选出肿瘤干细胞。
它通过观察单个细胞的生长、分裂、增殖情况，来得出大量肿瘤细胞当中的干细胞。
虽然这种方法过程复杂、费时费力，但是它能够筛选出更加纯度高的肿瘤干细胞。
二、肿瘤干细胞的培养方法早期肿瘤干细胞的培养，主要采用血清补充的液体培养基进行细胞的培养。
但是在这种培养条件下，肿瘤干细胞很容易分化。
因此，近年来，越来越多的实验室采用无血清培养条件进行肿瘤干细胞的培养，以维持肿瘤干细胞的稳定状态。
无血清培养条件下，需要选择不同种类的培养基，添加多种生长因子与细胞基质，来模拟肿瘤干细胞自身的生长环境。
同时，还需注意对细胞的密度、温度、pH 值、CO2浓度等生理性因素的控制。
三、肿瘤干细胞在肿瘤治疗中的治疗应用肿瘤干细胞的研究在肿瘤治疗中，具有重要的应用价值。
首先，肿瘤干细胞作为肿瘤治疗的靶点，开启了新的临床治疗途径。
其次，肿瘤干细胞可以用于评估肿瘤药物的治疗效果，这一评价标准能够更为准确反映药物的实际效果。
此外，肿瘤干细胞还可以用于评估肿瘤的预后情况，帮助医生选择更加有效的治疗方式。
总之，肿瘤干细胞的研究在肿瘤治疗研究领域，具有非常重要的价值。
分离肿瘤干细胞、培养肿瘤干细胞以及开展针对肿瘤干细胞的治疗策略，将有助于提高肿瘤治疗的效果，为患者带来更好的治疗效果。
肿瘤干细胞培养条件与方法
肿瘤干细胞培养条件与方法
肿瘤干细胞培养条件和方法可能因不同的肿瘤类型和研究目的而有所差异。
以下是一般的肿瘤干细胞培养条件和方法的概述：
1. 肿瘤组织获取：从患者或动物模型中获取肿瘤组织样本。
2. 肿瘤细胞分离：使用适当的方法，如酶消化或机械破碎，将肿瘤组织分离成单个细胞。
3. 细胞筛选：通过特定的标志物或功能特性，如表面标志物表达、干细胞特性等，筛选出肿瘤干细胞。
4. 培养条件：肿瘤干细胞通常需要特殊的培养条件，如无血清或低血清培养基、特定的生长因子和细胞因子、合适的气体环境等。
5. 细胞培养：将筛选出的肿瘤干细胞接种到培养容器中，并提供适当的培养条件，包括温度、湿度、气体环境等。
6. 监测和鉴定：定期观察肿瘤干细胞的生长情况、形态和功能特性，通过免疫荧光染色、流式细胞术等技术鉴定其干细胞特性。
需要强调的是，肿瘤干细胞的培养和研究是一个复杂的领域，需要专业的技术和设备。
肿瘤细胞培养
37℃静置2-4h 6、翻正培养瓶进行培养 7、原代细胞生长
肿瘤个人精准医疗
二、肿瘤细胞的培养
1、原代培养
这种方法采用前述的组织消化分散法，将妨碍细胞生长的细胞间质包括基 质、纤维等去除，使细胞分散，形成悬液，易于从外界吸收养分和排出代 谢产物，可以很快得到大量活细胞，细胞也可能在短时间内生长成片。适 用于培养大量组织，原代细胞产量高；但步骤繁琐、易污染，一些消化酶 价格昂贵，实验成本高。
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二、肿瘤细胞的培养
2、传代培养
肿瘤细胞的传代是人们利用培养肿瘤细胞作为进一步研究的靶材料。细胞 性状的好坏直接影响研究的结果。常见肿瘤细胞的传代多指细胞系的传代， 大致分为两种：一种是贴壁型细胞传代；另一种是悬浮型细胞传代。
注意事项：1、细胞没有生长到足以覆盖瓶底壁的大部分表面以前（80%）， 不要急于传代。
肿瘤细胞的培养
一、肿瘤细胞培养技术 二、肿瘤细胞的培养 三、体外培养肿瘤细胞的生物学检测 四、肿瘤细胞的冻存、复苏与运输 五、总结
肿瘤个人精准医疗
一、肿瘤细胞培养技术
1、取材
肿瘤细胞培养材料主要来源于外科手术或活检的瘤组织。取材部位非常重要 体积较大的肿瘤组织中央常有退变或坏死区，取材时应去掉坏死组织，故应 去瘤体的周围瘤组织做培养，癌性转移的淋巴结或癌性胸腹水是较好的培养 材料。取材后应尽快进行培养，如因故不能立即培养，可按正常组织储存方 法保存，将组织剪成1mm3左右的小块，放入培养液中，置4℃保存，但存放 时间不宜超过24h。取材时应注意无菌操作。
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二、肿瘤细胞的培养
干细胞技术在肿瘤治疗中的应用
干细胞技术在肿瘤治疗中的应用随着科学技术的不断进步，干细胞技术已开始被应用于临床治疗中，尤其是在肿瘤治疗中。
干细胞是一类未分化的细胞，具有自我更新和分化成多种细胞类型的潜能，因此被广泛研究并用于临床治疗。
本文将介绍干细胞技术在肿瘤治疗中的应用，包括干细胞移植、干细胞免疫治疗和干细胞治疗耐药性肿瘤等方面。
一、干细胞移植在干细胞移植中，一种或多种类型的未分化干细胞被通过手术移植到患者的体内，以代替已经损坏或死亡的细胞并恢复组织的功能。
这是一种广泛应用于肿瘤治疗中的治疗方法，可用于恢复因癌症治疗而导致的非造血细胞的缺陷和免疫系统的功能，通过提高治疗的效果和减少治疗后的不良反应，以改善患者的生存率和生存质量。
在干细胞移植中，研究人员通常使用的干细胞类型是造血干细胞和淋巴细胞。
造血干细胞可以分化成一个或多个血细胞系列的血细胞，包括白细胞、红细胞和血小板。
淋巴细胞则是免疫系统的主要细胞组成部分，可以分化成效应细胞和记忆细胞，以激发和保持免疫反应。
二、干细胞免疫治疗干细胞免疫治疗是应用干细胞的一种新型治疗方法，旨在改善免疫系统对肿瘤的反应。
在干细胞免疫治疗中，研究人员通常使用的干细胞类型是免疫干细胞和肿瘤干细胞。
免疫干细胞可以从患者或捐赠者体内获取，并在实验室中培养和扩增。
此后，这些免疫干细胞可以重新注入到患者体内，以增加免疫系统对肿瘤的反应。
肿瘤干细胞则是从患者或捐赠者体内获取的未分化细胞，这些细胞具有分化成多种细胞类型的潜能，可以通过适当的刺激和诱导分化成免疫干细胞。
在肿瘤干细胞分化后，它们可以被使用在干细胞免疫治疗中，以增强免疫系统的对肿瘤的反应。
三、干细胞治疗耐药性肿瘤肿瘤的耐药性是指肿瘤细胞在作用于其上的化疗、放疗、免疫治疗等治疗手段后不再受治疗影响，导致治疗的难度加大。
干细胞的优势在于它们可以定向分化成给定细胞类型，并因此用于治疗耐药性肿瘤。
研究人员利用干细胞为药物输送增加了非常有前途的传递方式，如包括导向药物输送、控制释放、检测和修复损伤组织等。
那些肿瘤干细胞的研究套路-序章与实验方法介绍
那些肿瘤⼲细胞的研究套路-序章与实验⽅法介绍近年来，肿瘤⼲细胞（Cancer stem cells，CSCs）逐渐成为肿瘤研究中的热点，2014年以来发表在⾼影响因⼦的各领域顶级期刊上的⽂章超过了数百篇。
再来看看2018年的国⾃然基⾦项⽬，肿瘤⼲细胞的项⽬也有37项之多，不管肿瘤⼲细胞的概念过去存在多少争议，越来越多的SCI⽂章都在发表肿瘤⼲细胞相关的研究，本系列将以⼏个篇幅详细介绍⼀下肿瘤⼲细胞的基本概念、研究思路、实验⽅法和论⽂套路。
序章肿瘤⼲细胞是指⼀类具有⼲细胞的特征，包括休眠、DNA修复机制激活、ABC药物转运蛋⽩⾼表达、以及对细胞凋亡的天然抗性的⼀群特殊的肿瘤细胞。
这群特殊的肿瘤细胞还具有以下⼏个特征，第⼀是⾃我更新能⼒，即可以产⽣与亲代完全相同的⼦代细胞；第⼆是分化潜能，即可以分化成不同亚群的肿瘤细胞；第三是⾼成瘤性，即很少量的肿瘤⼲细胞就⾜以在体内起始肿瘤发⽣。
研究表明肿瘤⼲细胞在肿瘤的发⽣起始，转移以及耐药的过程中发挥着重要作⽤，下⾯着重介绍⼀下肿瘤⼲细胞的实验⽅法和⼤体研究思路。
1) 肿瘤⼲细胞分离⽬前主要采⽤FACS（流式细胞分选术）和MACS（磁珠分选）技术，FACS能够通过肿瘤⼲细胞表⾯特殊表⾯标志物的表达（如CD133，CD24，CD44等）进⾏肿瘤⼲细胞的分离，MACS则⼀般利⽤CD133作阳性选择分离细胞。
（附表1：不同肿瘤⼲细胞表⾯标志物）表1 不同肿瘤细胞表⾯标志物2) 肿瘤⼲细胞体外培养采⽤肿瘤⼲细胞微球Oncosphere体系对常规肿瘤细胞系或者病⼈来源的肿瘤⼲细胞进⾏培养： Oncosphere即⼲细胞成球，通过⽆⾎清的⼲细胞培养基在低吸附的培养板上对肿瘤细胞进⾏培养可以得到悬浮的球状细胞团（图1），细胞处于⽆⾎清培养基及超低黏附培养板中，在这种培养条件下，分化的肿瘤细胞渐渐死亡，肿瘤⼲细胞则会存活并增殖形成细胞微球。
图1 肿瘤⼲细胞sphere培养体系观察以乳腺癌与结肠癌为例，Oncosphere培养体系如下：乳腺癌CSC培养体系结直肠癌CSC培养体系DMEM/F-12DMEM/F-12B27 1X B27 1X20ng/ml EGF20ng/ml EGF20ng/ml bFGF20ng/ml bFGF0.4% BSA Penicillin/Streptomycin5ug/ml InsulinPenicillin/Streptomycin3) 肿瘤⼲细胞的鉴定和⼲细胞特性检测除了前述提到的染⾊肿瘤⼲细胞特异性表⾯marker并通过流式细胞术鉴定CSC外，成球能⼒也是肿瘤⼲细胞体外鉴定和反应⼲细胞特性的重要指标。
肿瘤细胞的培养方法
肿瘤细胞的培养方法
肿瘤细胞对培养基的要求不如正常细胞严格，一般常用RPMI、DMEM、McCoy-5A等培养基，血清浓度不高，10%即可，建议最好在原代培养时能加入生长因子或原患者血清（1%~2%）以利细胞生长。
培养方法很多，主要有组织块法、酶消化法、钽网法、脱落细胞法等。
1．组织块法
将取得的瘤组织去除脂肪、结缔组织及坏死部分，在平皿中用Hanks液洗3次，剪碎组织，切成1~2mm3小块，接种于事先涂有鼠尾胶原的培养瓶（或皿）中，37℃、5%CO2或加盖并塞在普通恒温箱中培养。
2．酶消化法
在上述的碎组织块中加入0.25%胰蛋白酶或2000U/ml胶原酶，在37℃水浴中消化30min或更长一些，去除消化液，用洗液洗3次，培养基洗1次后，用完全培养基悬浮，并用吸管吹打分散制成细胞悬液，计数。
以（5~10）x108个/L细胞浓度，在含有10%小牛血清的RPMI、EagleMEM或DMEM中，在37℃、5%CO2下分瓶（或皿）中培养。
3．钽网法
在一张面积约为1cm2的钽网上放入上述剪碎的一块或几块肿瘤组织块（1~2mm3大小），用镊子轻压，使其粘于网上，再把但网放入培养皿中，使网下的组织块与皿壁紧紧接触，于37℃、5%CO2下培养，每隔2~3天换液一次，5天后可见有上皮细胞从网上移出，并能在相当于肿瘤组织部位形成纯净的单层上皮细胞。
4．脱落细胞法
将新鲜的肿瘤组织去除脂肪和结缔组织，洗液洗2次后，用刀片将肿瘤组织切成细薄片，在切割的同时有许多上皮细胞脱落下来，脱落细胞经洗涤后，加入完全培养基，便可获得较纯的上层细胞，于培养瓶（或皿）中，37℃、5%CO2下培养，每隔2~3天换液一次，7~10天上皮细胞逐渐长成单层。
肿瘤干细胞培养技术
肿瘤干细胞培养技术随着干细胞生物学以及肿瘤学研究得不断深入,肿瘤干细胞已成为当前肿瘤研究得热点、肿瘤干细胞得体外培养在肿瘤干细胞研究领域具有不可替代得重要地位,通过分离、纯化及培养肿瘤干细胞可以对其生物学特性如异质性、肿瘤得演化、转移与抗药性等进行研究,为肿瘤得早期诊断与治疗提供了新得思路与策略。
肿瘤干细胞得体外培养多采用无血清培养基(serｕｍｆree meｄium, SF Ｍ),根据不同得细胞类型加入适当得细胞因子联合培养以防止其分化。
肿瘤细胞系或者就是临床肿瘤组织联合采用机械与胶原酶消化肿瘤组织得到单细胞悬液,经过流式细胞仪或者免疫磁珠分选得方法得到肿瘤干细胞使用无血清培养基在饱与湿度得条件下进行体外培养,但值得注意得就是临床肿瘤组３7℃,５％CO２织得获取应该越新鲜越好,最好就是在外科手术后１小时内进行处理否则将影响肿瘤干细胞细胞得活性,不利于体外培养。
无血清培养基有很多种,针对不同得细胞类型有专门得无血清营养液出售。
无血清培养基具有以下得优点:各批产品之间成分相对明确、质量相对一致;便于控制培养得生理环境;特殊细胞类型得优化配方有利于提高细胞得稳定性,使不同类型得细胞能在最有利于各自生长得环境中持续传代培养;依据不同类型得细胞、甚至不同得细胞系(株)都可能有各自得无血清培养基。
总得来说可以分为基础营养基及附加成分两大部分［1］。
基础培养基一般采用人工合成得培养基主要有DMEM、DMEM/F12、UltraＣULTURETM、神经干细胞专用无血清培养基、黑色素瘤专用培养基等其中以DMEＭ/F１2(1:1,Iｎｖitｒoｇen)最为常用。
附加成分就是指在基础培养基中加入各种不同细胞生长所需得营养成分,包括①营养因子:胰岛素、转铁蛋白与亚硒酸钠、牛血清白蛋白、B27、Ｌ—谷氨酰胺;②细胞因子:白血病抑制因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、血小板衍化生长因子等。
使用无血清培养基培养得细胞经胰酶消化传代后不使用血清终止胰酶得作用,可使用０.1％－0.5%大豆胰酶抑制剂(sｏｙbeaｎ trypsin inhi ｂiｔｏr)。
肿瘤细胞培养方法及步骤
肿瘤细胞培养方法及步骤
一、机械刮除法
1．标记：镜下观察，用不脱色笔在培养瓶皿的背面圈下生长肿瘤细胞的部位。
2．刮除：弃掉培养液，把无菌胶刮伸入瓶皿中，肉眼或显微镜窥视下，刮除无标记空间。
3．用Hanks液冲清洗一两次，洗除被刮掉的细胞。
4．注入培养液继续培养，如发现仍有成纤维细胞残留，可重复刮除至完全除掉为止。
二、反复帖壁法
1．待细胞生长达一定数量后，倒出旧培养液，用胰酶消化后，Hanks冲洗2次，加入不含血清的培养液，吹打制成细胞悬液。
2．取编号为A、B、C三个培养瓶。
首先把悬液接种入A培养瓶中，置温箱中静止培养5～20分钟后，轻轻倾斜培养瓶，让液体集中瓶角后慢慢吸出全部培养液，再接种入B培养瓶中后，向A瓶中补充少许完全培养液置温箱中继续培养。
3．培养B瓶中细胞5～20分钟后，按处理A的方法，把培养液注入C培养瓶中，再向B瓶补加完全培养基。
三、消化排除法
1．先是用0.5％胰蛋白酶和0.02％EDTA（1：1）混合液漂洗培养基细胞一次，然后再换成新的混合继续消化，并在倒置显微镜下窥视和不时摇动培养瓶，到半数细胞脱落下来后，便立即停止消化。
2．把消化液吸入离心管中，离心去上清，吸入另瓶中，加培养液置温箱中培养，向原瓶内也补加新的培养液继续培养。
用此法处理后，成纤维细胞比肿瘤细胞易先脱落，经过几次反复处理，可能把成纤维细胞除净。
四、胶原酶消化法
1．可用0.5mg/ml的胶原酶消化处理，边消化边在倒置显微镜下窥视，当发现成纤维细胞被除掉后，即终止消化。
2．用Hanks洗涤处理一次后，更换新培养液，继续培养，可获纯净肿瘤细胞。
如成纤维细胞未被除净，可再次重复。
肿瘤干细胞实验方法
肿瘤干细胞实验方法肿瘤干细胞是一种新型细胞，具有自我更新，自我修复，多向分化和肿瘤形成的潜能。
它们在肿瘤的形成、发展和复发过程中扮演着重要的角色，因此对肿瘤干细胞的实验研究具有重要的意义。
本文将介绍肿瘤干细胞实验的基本方法。
1. 肿瘤干细胞培养肿瘤干细胞可通过单细胞克隆形成球体的方式进行培养，这种方法又被称为肿瘤球体培养。
其步骤如下：1) 确定肿瘤细胞株中的肿瘤干细胞含量。
2) 将肿瘤细胞株悬浮在无血清培养基中，添加必须的生长因子如EGF和FGF等，使其形成肿瘤球体。
3) 观察肿瘤球体的形成和生长情况，并进行维持和分离。
肿瘤球体与普通二维培养方式相比，具有较高的肿瘤干细胞含量，并具有良好的体外模拟肿瘤生长和浸润的特性。
此外，肿瘤球体可直接用于药物筛选和肿瘤干细胞信号机制的研究。
肿瘤干细胞的鉴定是肿瘤干细胞研究的重要环节。
主要通过以下两种方法进行：1) 流式细胞术通过肿瘤干细胞表面标志物表达的差异，通过流式细胞仪的分析来鉴定和筛选肿瘤干细胞。
常用的肿瘤干细胞表面标志物有CD133、CD44、CD24和ESA等。
2) 功能性鉴定法此方法是通过肿瘤干细胞的自我更新和多向分化的特性来进行鉴定。
肿瘤干细胞应该具有自我更新的能力，同时还具有多向分化的潜能，可以分化成多种类型的细胞。
通过上述方法鉴定出的肿瘤干细胞，需要进一步进行分选。
常用的方法有磁珠分选、流式细胞术和细胞筛等。
磁珠分选法是利用与表面标志物相关的磁珠对肿瘤干细胞进行筛选和富集。
流式细胞术，是利用表面标志物和细胞生物学特性进行筛选和富集。
细胞筛法是根据肿瘤干细胞的体积和生长特性进行富集。
4. 肿瘤干细胞治疗效果评价1) 体内治疗将肿瘤干细胞或肿瘤球体种植到动物体内，并进行药物治疗，以评价药物对于肿瘤干细胞的杀伤效果。
例如, 免疫缺陷小鼠移植瘤模型。
2) 体外药物筛选3) 分子生物学方法通过单细胞的特异性PCR和实时荧光PCR等分子生物学方法，检测肿瘤干细胞相对于肿瘤非干细胞的基因差异，从而评价治疗效果。
肿瘤干细胞名词解释
肿瘤干细胞名词解释肿瘤干细胞是一种特殊类型的细胞，可以通过不同方式来发展成其它类型的细胞，从而为肿瘤细胞提供利用或被肿瘤细胞所利用的能力。
其广泛应用于肿瘤研究，为肿瘤研究和治疗提供了新的方法。
肿瘤干细胞是细胞培养技术的重要组成部分，广泛用于生物医学研究的各个领域，如癌症研究、细胞生物学和细胞分子生物学等，已成为肿瘤研究的一个主要部分。
肿瘤干细胞具有多重特性，基本上可以被归纳为三类：肿瘤母细胞、肿瘤前体细胞和肿瘤细胞。
肿瘤母细胞是指能够自动复制的细胞，可被肿瘤细胞长期利用的细胞。
它们有着复杂的分子和结构特征，通常具有自我重组和自我复制的能力，比肿瘤细胞更加强大。
比起肿瘤细胞，肿瘤母细胞更加稳定。
它们可以被肿瘤细胞长期利用，作为攻击身体细胞的“坦克”而被肿瘤细胞利用。
肿瘤前体细胞是指生成肿瘤细胞的细胞，是肿瘤发展的最初状态。
肿瘤前体细胞具有两个重要特征：一是非常脆弱，易受损害，可以被抗癌药物破坏；二是它们具有某种能力，可以与其它细胞融合，形成新的细胞，肿瘤细胞也是其中一种。
肿瘤细胞是最重要的肿瘤细胞，是肿瘤的核心，它们可以通过一系列的过程来复制自身，并向周围组织繁殖，最终形成肿瘤组织。
具有特殊的生物学特性，如具有强大的抗药性和耐受性，很难被抗癌药物抑制。
肿瘤干细胞在肿瘤研究中有着重要的作用，可以对肿瘤细胞的功能和生长进行有效控制。
在诊断阶段，它们可以帮助评估患者的疾病状态和治疗效果；在治疗阶段，它们可以用于新型抗肿瘤治疗的开发，为肿瘤的治疗提供有力的支持。
总之，肿瘤干细胞是肿瘤研究的重要组成部分，具有自我复制能力和肿瘤细胞长期利用的特性，可以用于诊断和治疗肿瘤，成为新型抗肿瘤疗法研究的有力支持。
肿瘤干细胞的研究和应用，有助于我们更好地理解肿瘤病理生物学，更有效地治疗肿瘤。
微球体培养富集肿瘤干细胞及其潜在的临床应用
微球体培养富集肿瘤干细胞及其潜在的临床应用付欣;王珂【摘要】肿瘤干细胞假说是近年来提出的关于肿瘤的新理论，该理论认为肿瘤干细胞在肿瘤发生、发展和转移等过程中起着决定性的作用，肿瘤干细胞理论的提出给肿瘤治疗提供了新的思路和策略。
但是，肿瘤中只有一小部分细胞为肿瘤干细胞，因此鉴定并富集这些细胞以进一步研究是众多科研人员面临的巨大挑战。
微球体培养技术是近年发展起来的一种有效富集肿瘤干细胞的技术，该技术的应用使肿瘤干细胞的研究变得更加容易，并使临床应用这些细胞来评价肿瘤进展及患者预后成为可能，本文将对该技术及其与微系统的整合进行详细的阐述。
%Cancer stem cell hypothesis has become a new theory. According to this theory, cancer stem cells play a decisive role in car-cinogenesis, progression, and metastasis. This theory offered new ideas and strategies for cancer treatment. However, only a small fraction of cells in a tumor were cancer stem cells. Therefore, the identification and enrichment of these cells are significant challenges for numerous researchers conducting further study. Micro-sphere culture has been an effective tumor stem cell enrichment technolo-gy in recent years. The application of this technique makes the cancer stem cell research process easy. In addition, it makes the evalua-tion of tumor progression and prognosis of patients in clinical possible. This article will focus on the applications of this technology, and microsystem integration will be described in detail.【期刊名称】《中国肿瘤临床》【年(卷),期】2017(044)003【总页数】6页(P136-141)【关键词】肿瘤干细胞;微球体培养;生物标记;微系统【作者】付欣;王珂【作者单位】天津医科大学肿瘤医院妇瘤科，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市肿瘤防治重点实验室天津市300060;天津医科大学肿瘤医院妇瘤科，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市肿瘤防治重点实验室天津市300060【正文语种】中文肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC）假说认为在异质性的肿瘤中只有一小部分细胞具有干细胞的特性，可促进肿瘤生长，并对放化疗有着更强的耐受性［1］。
肿瘤干细胞培养技术分享
肿瘤干细胞培养技术肿瘤干细胞起源：最初形成肿瘤的不一定是肿瘤干细胞（Cancer stem cells, CSCs），尽管肿瘤起始细胞有时能和CSCs互换；CSCs的存在最早是在40年前被提出来的，支持CSCs 存在的最佳证据来源于对恶性血液疾病急性白血病的研究；CSCs也被很多学者称之为肿瘤传播细胞（Tumor propagating cells, TPCs）；图中显示：CSCs不仅可以来源于正常干细胞的突变，还可以由祖细胞分化的细胞获得无限增殖潜力而形成、由分化的细胞去分化后突变形成。
肿瘤干细胞特征：1、CSCs的迁移对肿瘤远处转移的影响：CD133+胰腺癌细胞具有形成肿瘤的能力；这些细胞能够进行连续传代，说明其具有自我更新能力（Self-renewal capacity），且能够通过制造分化的、非致瘤的子代从而产生肿瘤异质性；临床生存分析也表明CD133和肿瘤患者的无疾病生存和总生存率相关；还发现，经历上皮间充质转化（EMT）的肿瘤细胞呈现CSC特性。
2、CSCs具有一些干细胞的特征，如休眠、DNA修复机制激活以及对细胞凋亡的天然抗性等。
3、CSCs对治疗耐受；Ref: Drug Discov Today, PMID: 24819719其耐受的主要机制包括：药物外排，最经典的耐药机制为ABC（ATP-binding cassette）转运蛋白、抗凋亡通路、干扰细胞分化、乙醛脱氢酶、缺氧环境等等。
肿瘤干细胞的分离：荧光激活细胞分选（FACS）和磁珠细胞分选（MACS）是分选CSCs的主要技术；FACS是通过细胞水平特殊蛋白表达、细胞培养、表观遗传学变化以及细胞标志物CD44、CD133等的表达方式来分离细胞；MACS是肿瘤干细胞分选的标准方法，根据特殊的肿瘤干细胞标志物，如CD133的表达来分离细胞。
图中是FACS和MACS常用的仪器流式细胞仪和免疫磁珠分选装置。
肿瘤干细胞标志物：Tumor type Cell surface markerAcute myeloid leukemia (AML) CD34+, CD38-Breast cancer EPCAM(ESA)+, CD44+, CD24-, ALDH, CD29, CD133 Ovarian cancer CD133+, CD44+, CD117+, CD24+Glioblastoma CD133+, CD15+Medulloblastoma CD133+, CD15+Small cell and none-small cell lungCD133+cancerHepatocellular carcinoma CD45−, CD90+Colon cancer CD133+, CD44+, CD26+, ALDHTumor type Cell surface markerMelanoma CD20+, CD271+Pancreas adenocarcinoma CD44+, CD24+Renal carcinoma CD133+Head and neck squamous cell carcinomaCD44+, ALDH1(HNSCC)LUNG CD133+, CD90, CD117, ALDH1 Prostate cancer CD44+, CD133+, CD49表中是各类肿瘤的CSC标志物，如急性髓系白血病干细胞呈现CD34阳性、CD38阴性；乳腺癌干细胞呈现ESA、CD44和ALDH阳性以及CD24阴性；卵巢癌干细胞呈现CD133、CD44、CD117和CD24阳性等。
肿瘤干细胞的分离和鉴定技术研究
肿瘤干细胞的分离和鉴定技术研究肿瘤干细胞是指一种具有自我更新能力的细胞，同时又可以分化成某些或所有肿瘤细胞的一种细胞。
它是肿瘤形成、生长、传播过程中至关重要的组成部分。
因为肿瘤干细胞具有高度的分化潜能和无限的增殖潜能，所以它们可以在充分的核苷酸切片的条件下自我更新、维持和增殖。
而且在化疗和放疗的过程中，肿瘤干细胞可以存活，这是导致肿瘤治疗失败以及肿瘤复发的原因之一。
因此，寻求分离和鉴定肿瘤干细胞的方法和技术至关重要。
目前分离和鉴定肿瘤干细胞的主要方法包括：1. 流式细胞仪流式细胞仪是一种可以对细胞进行分类、鉴定和计数的仪器。
通过标记分子，可以分离出具有肿瘤干细胞表型的细胞，如CD133、CD44、CD24和EpCAM。
但是，CD133和CD44等标记分子也可表达于非肿瘤干细胞，因此在使用流式细胞仪时需要结合其他的标记分子和鉴定方法，以提高分类和准确性。
2. 磁珠分选法磁珠分选法是一种通过对细胞表面标记抗原进行特异性结合和隔离的方法。
一般来说，将抗CD133的磁珠与肿瘤细胞混合，并在磁力场中分离，从而分离出肿瘤干细胞。
这种方法具有操作简单、高通量等优点，但仍然需要结合其他标记分子和方法以提高准确性。
3. 单细胞培养单细胞培养是一种将肿瘤组织显微切片后，将细胞分散到培养皿中，以培养单个肿瘤干细胞为主要目标的方法。
这种方法可以更加准确地分离出肿瘤干细胞，但是操作复杂、耗时长。
4. 体内鉴定体内鉴定是通过将标记细胞注射到小鼠等实验动物体内，观察肿瘤形成和生长的过程，进而鉴定出肿瘤干细胞。
这种方法可以检测到复杂的细胞肿瘤形成，但由于其时间和成本等原因，常常被用作其它方法的验证和分析。
需要注意的是，肿瘤干细胞的分离和鉴定不仅要依赖于单一的标记分子和方法，还需要结合多项标记分子和细胞生物学特征、分布情况等进行综合鉴定，以提高准确性和可靠性。
肿瘤干细胞的分离和鉴定技术对于肿瘤治疗、预防和管理具有重要意义。
通过分离和鉴定肿瘤干细胞，可以有效地评估肿瘤的潜在危险性、筛选出更加有效的治疗方法，更好地指导临床治疗、降低肿瘤复发率和死亡率。
肿瘤干细胞的分离纯化及其特性研究
肿瘤干细胞的分离纯化及其特性研究肿瘤干细胞是指在肿瘤中具有自我更新和多向分化能力的一群细胞。
相对普通的癌细胞而言，肿瘤干细胞具有更强的免疫逃逸能力和耐药性，是导致肿瘤复发和转移的主要原因。
因此，肿瘤干细胞的分离纯化及其特性研究显得尤为重要。
一、肿瘤干细胞的分离1. 流式细胞分选法流式细胞分选是一种通过免疫荧光标记、单细胞悬浮、电子流斑点分选等操作，获取纯度较高细胞子群的方法。
在肿瘤干细胞研究中，常使用CD133、CD44等标记来区分干细胞和非干细胞群体。
2. 磁珠分选法磁珠分选法通过将特定的抗体与磁珠结合，然后用磁场对悬浮液进行分选。
相对于流式细胞分选法，磁珠分选法步骤简单、分选速度较快、操作成本也较低。
3. 原位培养法原位培养法是指将组织样本或细胞直接接种在动物体内，然后等待形成新生物。
在肿瘤干细胞研究中，原位培养法常用于筛选具有干细胞特性的细胞亚群。
二、肿瘤干细胞的特性1. 自我更新能力肿瘤干细胞具有自我更新能力，能够持续不断地分裂并产生新的干细胞，从而保证细胞群体的不断扩增。
2. 多向分化能力肿瘤干细胞可以分化成多种类型的肿瘤细胞，并具有较强的分化潜能。
这种特性使得肿瘤干细胞成为肿瘤治疗中需要被重点关注的对象。
3. 耐药性肿瘤干细胞对于化疗及放疗等常规治疗方式常常具有较高的耐药性。
这是因为肿瘤干细胞能够通过增强细胞自我修复能力等机制，来应对化疗及放疗等治疗方式所带来的损伤。
三、肿瘤干细胞的临床意义1. 提高肿瘤治疗效果肿瘤干细胞因其特殊的生物学特性，成为肿瘤治疗中值得关注的对象。
临床研究表明，针对肿瘤干细胞进行治疗可以提高肿瘤的治疗效果，并减少肿瘤复发的风险。
2. 防止肿瘤转移由于肿瘤干细胞具有特殊的自我更新和多向分化能力，它们常常是肿瘤转移的罪魁祸首。
因此，针对肿瘤干细胞的治疗，可以减少肿瘤转移的风险。
3. 指导个体化治疗针对不同病人的肿瘤，其肿瘤干细胞数量及特性也有很大的差异。
因此，通过测定病人体内肿瘤干细胞的数量和特性，可以为个体化治疗提供依据。
一种应用于肿瘤细胞和干细胞共培养的新方法[发明专利]
![一种应用于肿瘤细胞和干细胞共培养的新方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/1a16662515791711cc7931b765ce050876327566.png)
[19]中华人民共和国国家知识产权局[12]发明专利申请公布说明书[11]公开号CN 101186899A[43]公开日2008年5月28日[21]申请号200710059929.1[22]申请日2007.10.18[21]申请号200710059929.1[71]申请人天津医科大学地址300070天津市和平区气象台路22号[72]发明人赵秀兰 倪春生 赵学铭 刘易欣 古强孙涛 王星辉 王欣 戚红 张文治 孙保存 [51]Int.CI.C12N 5/06 (2006.01)权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 2 页[54]发明名称一种应用于肿瘤细胞和干细胞共培养的新方法[57]摘要本发明一种应用于肿瘤细胞和干细胞共培养的新方法，主要通过基于transwell的间充质干细胞与恶性黑色素瘤细胞的非接触式共培养，观察到共培养中间充质干细胞形态变化，检测Ⅷ因子和CD34两种指标免疫组织化学染色结果，并分析免疫组织化学染色的差异。
实验结果显示：非接触式共培养中部分间充质干细胞变化为多角形或短梭形；对比观察单独培养和非接触式共培养在Ⅷ因子和CD342种指标免疫组织化学染色结果，统计分析表明两培养方法间的间充质干细胞在Ⅷ因子和CD342种指标上有显著差异。
本发明通过体外单独培养和非接触式共培养的比较，明确非接触式共培养可以应用于间充质干细胞和恶性黑色素瘤细胞之间相互作用的研究。
200710059929.1权 利 要 求 书第1/1页1.本新方法要基于transwell(0.4μm孔径)建立肿瘤细胞与间充质干细胞的非接触式共培养模型并观察两种细胞的表型变化，从而明确该非接触式共培养模型可以应用于两种细胞之间相互作用的研究。
2.根据权利要求1所述，利用transwell(0.4μm孔径)建立恶性黑色素瘤细胞与间充质干细胞的非接触式共培养模型并观察两种细胞的表型变化，利用免疫组织化学与免疫荧光检测其VIII因子和CD34表达。
肿瘤细胞的培养及其实验的方法
肿瘤细胞的培养及其实验的方法肿瘤细胞的培养及其实验的方法肿瘤细胞在组织培养中占有核心的位置，首先癌细胞是比较容易培养的细胞。
当前建立的细胞系中癌细胞系是最多的。
另外肿瘤对人类是威胁最大的疾病。
肿瘤细胞培养是研究癌变机理、抗癌药检测、癌分子生物学极其重要的手段。
肿瘤细胞培养对阐明和解决癌症将起着不可估量的作用。
一、组织培养肿瘤细胞生物学特性肿瘤细胞与体内正常细胞相比，不论在体内或在体外，在形态、生长增值、遗传性状等方面都有显著的不同。
生长在体内的肿瘤细胞和在体外培养的肿瘤细胞，其差异较小，但也并非完全相同。
培养中的肿瘤细胞具以下突出特点：（－）形态和性状培养中癌细胞无光学显微镜下特异形态，大多数肿瘤细胞镜下观察比二倍体细胞清晰，核膜、核仁轮廓明显，核糖体颗粒丰富。
电镜观察癌细胞表面的微绒毛多而细密，微丝走行不如正常细胞规则，可能与肿瘤细胞具有不定向运动和锚着不依赖性有关。
（二）生长增殖肿瘤细胞在体内具有不受控增殖性，在体外培养中仍如此。
正常二倍体细胞在体外培养中不加血清不能增殖，是因血清中含有很细胞增殖生长的因子，而癌细胞在低血清中（2％～5％）仍能生长。
已证明肿瘤细胞有自泌或内泌性产生促增殖因子能力。
正常细胞发生转化后，出现能在低血清培养基中生长的现象，已成为检测细胞恶变的一个指标。
癌细胞或培养中发生恶性转化后的单个细胞培养时，形成集落（克隆）的能力比正常细胞强。
另外癌细胞增殖数量增多扩展时，接触抑制消除，细胞能相互重叠向三维空间发展，形成堆积物。
（三）永生性永生性也称不死性。
在体外培养中表现为细胞可无限传代而不凋亡（Apoptosis）。
体外培养中的肿瘤细胞系或细胞株都表现有这种性状，体内肿瘤细胞是否如此尚无直接证明。
因恶性肿瘤终将杀死宿主并同归于尽，从而难以证明这一性状的存在。
体外肿癌细胞的永生性是否能反证它在体内时同样如此？也尚难肯定。
从近年建立细胞系或株的过程说明，如果永生性是体内肿瘤细胞所固有的，肿瘤细胞应易于培养。
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肿瘤干细胞培养技术随着干细胞生物学以及肿瘤学研究的不断深入，肿瘤干细胞已成为当前肿瘤研究的热点。
肿瘤干细胞的体外培养在肿瘤干细胞研究领域具有不可替代的重要地位，通过分离、纯化及培养肿瘤干细胞可以对其生物学特性如异质性、肿瘤的演化、转移和抗药性等进行研究，为肿瘤的早期诊断与治疗提供了新的思路和策略。
肿瘤干细胞的体外培养多采用无血清培养基(serum free medium, SFM)，根据不同的细胞类型加入适当的细胞因子联合培养以防止其分化。
肿瘤细胞系或者是临床肿瘤组织联合采用机械和胶原酶消化肿瘤组织得到单细胞悬液，经过流式细胞仪或者免疫磁珠分选的方法得到肿瘤干细胞使用无血清培养基在37℃，5％CO2饱和湿度的条件下进行体外培养，但值得注意的是临床肿瘤组织的获取应该越新鲜越好，最好是在外科手术后1小时内进行处理否则将影响肿瘤干细胞细胞的活性，不利于体外培养。
无血清培养基有很多种，针对不同的细胞类型有专门的无血清营养液出售。
无血清培养基具有以下的优点：各批产品之间成分相对明确、质量相对一致；便于控制培养的生理环境；特殊细胞类型的优化配方有利于提高细胞的稳定性，使不同类型的细胞能在最有利于各自生长的环境中持续传代培养；依据不同类型的细胞、甚至不同的细胞系(株)都可能有各自的无血清培养基。
总的来说可以分为基础营养基及附加成分两大部分[1]。
基础培养基一般采用人工合成的培养基主要有DMEM、DMEM/F12、UltraCULTURETM、神经干细胞专用无血清培养基、黑色素瘤专用培养基等其中以DMEM/F12(1:1，Invitrogen)最为常用。
附加成分是指在基础培养基中加入各种不同细胞生长所需的营养成分，包括①营养因子：胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸钠、牛血清白蛋白、B27、L－谷氨酰胺；②细胞因子：白血病抑制因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、血小板衍化生长因子等。
使用无血清培养基培养的细胞经胰酶消化传代后不使用血清终止胰酶的作用，可使用0.1％－0.5%大豆胰酶抑制剂(soybean trypsin inhibitor)。
一、肿瘤干细胞培养中几种常见的细胞因子(一)白血病抑制因子LIF(leukemin inhibitory factor,LIF) 是白介素6(IL-6)细胞因子家族中的一员，是典型的多功能生长因子，具有多种生物学功能：对细胞生长、增殖与分化有着广泛的作用，抑制分化促进干细胞增殖。
胚胎干细胞的体外培养需要添加LIF以抑制其分化，维持其多能性。
LIF可抑制成纤维细胞生长因子(Fibroblast Growth Factor ,FGF)、β转移生长因子(β-transforming GrowthFactor ,TGFβ)和叶酸(Retinoic Acid ,RA)诱导的细胞分化。
(二)干细胞因子(stem cell factor,SCF) 又称肥大细胞生长因子(MGF)，Kit配体(KL)及Steel因子(SLF)，SCF可以诱导干和祖细胞增生。
SCF主要由脑、肝脏、骨髓、胎盘等组织(尤其骨髓)中的基质细胞、成纤维细胞、内皮细胞、肝细胞产生。
SCF是一种作用于最早期造血干祖细胞的造血细胞因子，在维持造血及肥大细胞存活、促进造血细胞增殖和分化、调控各系造血细胞的生长发育过程中起着重要作用。
(三)表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF) 是含有53个氨基酸的多肽, 早期研究中发现其有剌激表皮细胞生长的作用,是表皮细胞培养的最常用的添加因子之一。
EGF可显著促使细胞分裂、增殖，在一定浓度范围内(5~20ng/ml),随EGF浓度提高,效应加强。
(四)碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF) 1975年Gospodarowicz 及其同事从牛大脑和垂体中分离纯化出一种分子量为16-18kD由146个氨基酸组成的阳离子多肽，并将其命名为成纤维细胞生长因子。
bFGF具有多种生物学功能，可以促进和调节血管内皮细胞、上皮细胞、和神经胶质细胞等多种起源于中胚层、神经外胚层源性的许多种细胞的增殖和分化。
二、肿瘤干细胞目前肿瘤干细胞已经在多种肿瘤细胞系以及白血病、脑瘤、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、肝癌、肺癌等多种肿瘤组织中分离鉴定和培养。
不同组织来源的肿瘤特性不同的，培养条件也不完全相同，本章就已有报道的从不同肿瘤细胞系或者肿瘤组织分离的肿瘤干细胞的体外培养体系加以阐述，在实际操作中读者需要经过摸索才能针对不同的肿瘤干细胞建立稳定的体外培养条件。
(一)白血病干细胞ALL急性淋巴细胞白血病干细胞(CD34+/CD10–/CD19–)采用悬浮培养体系培养[2]。
ALL急性淋巴细胞白血病患者来源的骨髓用Ficoll分离得到单个核细胞(MNC)，使用IMDM(Gibco)添加50% FCS(Gibco)和10% DMSO 二甲基亚砜(Manor Park Pharmaceuticals)冻存液将分离得到的MNC在液氮中备用。
培养时以5×105个/mL密度接种在IMDM无血清培养基中，添加了10μg/mL 人胰岛素，200μg/mL转铁蛋白( Sigma-Aldrich)和2% HAS。
使用时以下两组生长因子任选其一：①20ng/mL重组人Fms样酪氨酸激酶3 (rhFlt3) 配体、20ng/mL 重组人白介素3 (rhIL-3)、20ng/mL rhIL-6、20ng/mL rhGM-CSF、20ng/mL rhG-CSF 和50ng/mL SCF。
②20ng/mL rhIL-3、10ng/mL rhIL-7和50ng/mL SCF (R&D Systems)。
每周半量换液一次，培养6周后收集细胞用于细胞遗传学和形态学分析。
(二)乳腺癌干细胞乳腺癌干细胞培养多参考Max Wicha及其同事建立的人乳腺上皮干/祖细胞体外悬浮培养体系[3]，在无血清培养基中乳腺上皮干细胞呈悬浮非分化形式生长，我们称之为乳腺干细胞球。
原代培养时在超低粘附板(Corning)以20000个/mL活性细胞传代时以1000个/mL密度进行培养。
无血清培养基选择无血清乳腺上皮生长培养基MEGM(BioWhittaker)，添加了B27 (Invitrogen)、20ng/ml EGF、20ng/mLbFGF(BD Biosciences)和4μg/mL肝磷脂(Sigma)，不添加牛垂体浸膏。
乳腺干细胞球培养7－10天后用0.05%胰酶和0.53mM EDTA-4Na 消化10分钟(Invitrogen)，收集细胞到离心管中800rpm离心。
离心后得到的细胞需通过40μm滤膜并且在显微镜下观察是否为单个细胞。
10000个单细胞悬液中两个相连、三个相连、多个细胞相连的团块数量应该在30到150之间，如果细胞团大于>100需要重复进行消化和过滤的步骤。
外科手术得到乳腺癌实体瘤中乳腺癌干细胞(CD44 +/ CD24− /low)的培养需要在手术后30分钟内对乳腺癌标本进行处理，在胶原酶(Roche)和透明质酸(Sigma)按1:1比例配成的消化液中37℃消化2小时后通过30μm滤膜后得到单细胞悬液。
以1000个/mL无血清DMEM-F12 (Cambrex), 添加10ng/mL bFGF、20ng/mL EGF、5μg/mL胰岛素和0.4%牛血清白蛋白(Sigma)。
细胞在上述培养基中呈悬浮球状细胞团生长，每隔3天使用胰酶－EDTA消化2分钟后传代[4]。
乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231中分离得到乳腺癌干细胞(CD24− /low /CD44+)，收集细胞500g离心5分钟,使用Hanks’缓冲盐溶液洗涤后以1000个/mL重悬于无酚磺酞的DMEM –F12 (Cellgro) 添加0.4%牛血清白蛋白BSA(Sigma)、5μg/mL牛胰岛素(Sigma)、20ng/mL bFGF ( Sigma)和10ng/mL EGF (Sigma) ，每三天换液一次[5]。
(三)脑胶质瘤临床获得的肿瘤标本使用lympholyte-M (Cedarlane)去除红细胞，在充氧的人工脑脊液中使用胰酶消化成单细胞悬液，总的来说，每份肿瘤标本大概可以获得2－5×106个细胞。
肿瘤细胞使用TSM(tumor sphere medium)肿瘤细胞球培养基，添加20 ng/ml重组人EGF (Sigma)、20ng/ml bFGF (Upstate)、10ng/ml LIF(Chemicon)、1×神经元存活因子NSF(Clonetics)和60μg/ml N－乙酰半胱氨酸(Sigma), 使用60-mm细胞培养板进行培养确保活细胞数量为3 ×106。
原代培养三天后免疫磁珠分选得到CD133+脑胶质瘤干细胞，使用上述细胞培养基培养[6]。
也有学者从临床肿瘤组织获得的单个肿瘤细胞悬液在Neurobasal培养基(Invitrogen)，添加2mM L-谷氨酰胺、N2 (Invitrogen)、B27 (Invitrogen)、20ng/ml hrEGF (Invitrogen)、20ng/ml hrbFGF (Invitrogen)和50mg/ml BSA。
实验中使用的细胞应该在4代之内，分选得到的Nestin+/CD133+细胞即为脑肿瘤干细胞[7]。
大鼠胶质瘤细胞系C6采用SP分选的方法得到脑胶质瘤干细胞[8], 在100-mm 培养盘中(Nunc)使用无血清的DMEM培养，添加了10μg/ml牛胰岛素、100μg/ml 人转铁蛋白、100μg/ml BSA、60ng/ml黄体激素、16μg/ml四甲烯二胺、40ng/ml 亚硒酸钠、63μg/ml N－乙酰半胱氨酸、5μM血小板凝集抑制剂forskolin、50units/ml青霉素、50μg/ml链霉素(GIBCO)、10ng/mlbFGF和10ng/ml PDGF。
大鼠胶质瘤细胞系9L，无血清NSC增殖培养基采用DMEM/F12添加20ng/ml EGF(Peprotech)和bFGF(Peprotech)、50ng/ml肝磷脂、1×B27 (Gibco)。
每隔两天换液一次。
当肿瘤细胞球达到100–200个时使用0.1%胰酶和1×EDTA (Gibco) 37°C消化10分钟。
通过25μm细胞滤膜(BD Biosciences) 以1000个/ml 密度接种在添加促有丝分裂剂的NSC培养基中每隔两天换液一次，18天后可以进行细胞的传代，培养的细胞球即为具有化疗抵抗和侵袭能力的肿瘤干细胞样细胞[9]。