实验6 基因芯片数据处理分析与GO分析

1、芯片数据的获取与处理
芯片杂交试验完成后， 借助扫描仪将杂交信号形成 TIF 图像， 通过图像分析软件从中提 取原始杂交信号强度值， 并将其转换成数字文本文件。 但是不同扫描仪产生的数据格式不尽 相同，因此，需要对不同平台的数据进行转换和整合。 1.1、ExpressConverter 数据格式转换 TM4（http://www.tm4.org）的 ExpressConverter 可将其他格式的数据文件转换为 MEV 格式以供后续分析。由于该软件的运行需要 Java 运行环境支持，故第一次使用之前需要预 先安装 Java Runtime Environment（http://www.java.com） 。完成 ExpressConverter 安装后，在 开始菜单中找到 Expressconverter 并打开，出现软件主界面（Figure 6.1） 。
Figure 6.9 点击“Execution”按钮，并按照提示将结果文件保存，选好路径，软件会按照设计的流程 来处理数据。从界面下方“Process Status”处可以查看软件当前的运行情况。运行结束后，可 直接到之前选好的路径下查看结果文件 testdata_MDS.mev， 该文件中的数据已完成过滤和标 准化处理。 建议用 Excel 查看，打开文件后，计算 IB/IA 值（ratio） ，当 ratio=0.5~2.0 表示与探针杂 交时，基因表达没有显著差异。当 ratio>2 或 ratio<0.5 表示基因表达呈显著差异，分别称为 上调或下调。但这种方法比较粗略，不具有统计学意义，一般用于大规模初筛。
Figure 6.2 （3）在界面下方选择“Integrated”，然后在“File”菜单下选择“Start converting”，开始转 换格式，直到界面下方显示“Converting is successful”，完成转换。此时，在原目录中会出现 文件名相同但扩展名不同的.mev 和.ann 文件，它们可用记事本或 Excel（推荐）打开。 .mev 文件包Leabharlann Baidu注释（comments）和数据（data） ，其中以“#”开头的注解部分包括文件版 本号、生成日期、数据的行数等基本信息，数据部分则详细地列出芯片中每个探针的位置、 信号强度等杂交信息（Figure 6.3） 。例如，UID 为探针标识号；IA、IB 分别表示 Cy3（对照） 和 Cy5（样本）的杂交信号强度；R 和 C、MR 和 MC、SR 和 SC 这三对数值指定了探针在 芯片中的位置；其他各列参数分别反映对照（A）和样本（B）的杂交背景、面积、信号强 度的中值等。
Figure 6.10 MeV 支持常见的芯片数据格式，如 mev、geo、gpr 以及表格格式等。这里以表格格式 的数据文件为例说明，介绍使用 MeV 进行聚类分析和差异表达基因的筛选。 （ 1 ）选择数据格式：在软件界面的 “Multiple Array Views” 窗口中选择 “File—>Load Data”，弹出“Expression File Loader”窗口（Figure 6.11） 。其中表格格式为默认设置，如采用 其他数据格式，需要在“Select File Loader”菜单中指定，另作调整。
Figure 6.12 （3）显示基因表达情况：通过 Multiple Array Viewer 窗口看热图（Heat map） ，了解每 个基因在不同样本中的相对表达量（Figure 6.13） 。
Figure 6.13
（4） SAM 参数设置： SAM 是差异表达分析的一种算法。 单击常用工具栏上的“Statistics” 按钮， 选择“Significance Analysis for Microarrays”,弹出“SAM Initialization”窗口 （Figure 6.14） 。 根据以下 5 个数据分别设置参数：两组不成对（Two-class unpaired） 、两组成对（Two-class paired） 、多组（Multi-class） 、一组（One-class） 、Censored Survival。本例选择两组不成对数 据，在“Group Assignments”选框中，将 10 个样本分成两组：将 Sample1~ Sample5 设定为 Group A， Sample6~ Sample10 设定为 Group B。单击“OK”按钮，完成 SAM 参数设置。
实验六: 基因芯片数据处理和分析、GO 分析
实验目的：
1. 学会使用 TM4 软件集对芯片数据进行处理和分析，学会使用 Cluster 进行聚类分析 3. 学会 GO 语义及其相关注释的浏览与搜索，学会使用 DAVID 进行基因集功能富集分析
实验内容：
一、基因芯片数据处理和分析
基因芯片或称微阵列（microarray）能够平行、高通量地检测成千上万基因转录本的表 达水平， 应用芯片技术可以比较正常和异常细胞中的表达， 帮助识别疾病相关基因和药物作 用靶标，分析复杂疾病的致病机制，也可以揭示基因间的表达调控关系。基因芯片数据处理 包括芯片杂交实验芯片数据采集（扫描）数据基本处理提交数据库生物信息学分析 等步骤，涉及很多不同的实验类型。这里介绍 TIGR 中心开发的 TM4 软件包，应用 MeV、 Cluster 和 TreeView 等软件对相关基因表达谱进行聚类分析和差异表达基因的筛选。
Figure 6.15 （6）结果分析图：主界面左侧的导航栏 SAM(1)查看或导出结果（Figure 6.16） 。有四 种不同类型：Expression Images、Centroid Graph、Expression Graphs、Table Views，并根据
基因表达的显著性将其分成显著正向表达基因（Positive Significant Genes） 、显著负向表达 基因（Negative Significant Genes） 、正负向均为表达差异显著基因（All Significant Genes） 、 Non-significant Genes（正负向均为表达差异不显著基因）四种情况。
Figure 6.3
.ann 文件是一个芯片注释文件，用于存储每个探针的注释信息。其中 UID 表示探针的 标识号，R 和 C 分别表示探针在芯片中的位置，Name 和 ID 分别表示探针所代表的基因名 和检索号（Figure 6.4） 。
Figure 6.4 1.2、MIDAS 数据过滤和标准化 芯片杂交试验所产生的原始数据需要对低质量数据作过滤处理， 即表达水平是负值或很 小的数据或明显的噪音数据， 凡杂交信号值低于阈值的探针应予剔除， 使其对应的基因不再 进入下游的分析。由于芯片数据一般呈偏态分布，因此还需要对数据进行标准化处理，同时 还要消除实验操作造成的系统误差。 在 TM4 中 ， 数 据 的 过 滤 标 准 化 通 过 MIDAS 软 件 完 成 ， 下 载 地 址 为 ： http://www.tm4.org/midas.html。此软件免安装，下载后解压即可使用。进入该软件所在文件 夹，双击 Midas.bat 文件，便出现 MIDAS 软件主界面（Figure 6.5） 。
Figure 6.14 （5）统计图绘制：在弹出的“SAM Graph”窗口中（Figure 6.15） ，可拖动滑块位置设置 不同阈值， 从而改变两条平行虚线之间的距离， 图中上虚线以上和下虚线以下区域分别表示 上调和下调基因， 而上下虚线中间区域表示表达差异不显著的基因。 这里我们选中“Use Fold Change”选框，使用默认值 2.0，单击“OK”按钮。
Figure 6.5 这里以 ExpressConverter 转换产生的 testdata.mev 为例，介绍使用 MIDAS 进行双色（双 通道）芯片的数据处理过程。 （1）数据读取：点击常用工具栏中左起第 5 个“Read Single Data File”的图标 ，然后 在右侧参数（Parameters ）窗口的“Data File Name” 项的 “Value”栏中指定读取 testdata.mev （Figure 6.6） ，并同时勾选 A 和 B 两个通道背景校正选项“ChannelA Background Checking” 和“ChannelB Background Checking”，信噪比阈值（Signal/Noise Threshold）设定为 2。通常 筛选差异表达基因时，只有当探针杂交的信号值大于背景值时，才能进入下游分析；如杂交 信号值低于阈值，其探针会被过滤。
2、差异表达基因筛选与聚类分析
2.1、MeV 芯片数据分析的图形化显示 MutgiExperiment Viewer（MeV）是 TM4 软件包的子软件之一，其主要功能是实现芯片 数据分析的图形化显示。MeV 的最新版本在 TM4 主页（http://www.tm4.org/mev.html）下获 取。此软件免安装，解压后即可使用。 解压后进入该软件所在的文件夹， 双击 TMEV.bat 文件打开软件的主界面 （Figure 6.10） ， 由两个窗口组成，上方为应用程序窗口，下方为数据处理窗口。通过应用程序窗口可以新建 许多数据处理窗口从而实现多任务分析过程。
Figure 6.1
ExpressConverter 可以读取 Genepix、ImaGene、ScanArray、ArrayVision、Agilent、TAV、 Customized、Gal 等格式的数据并将其转换成 TM4 能够使用的 MEV 格式。这里以 Genepix 文件转换为例，说明 ExpressConverter 的使用过程。 （1）在”Input Format”菜单中选择“GenePix”，指定它为读入文件格式。 （2）在“File”菜单中选择“Select input files”，选定一个或多个需要转换的 GenePix 文件 （扩展名为.gpr） 。本例从该软件的默认安装目录下，即 C:\ExpressConverter\samples\中选择 testdata.gpr 文件（Figure 6.2） 。
Figure 6.6 ，在流程窗口中显示过滤强度 （ 2 ）数据过滤：点击常用工具栏中第 14 个图标 “Intensity Filter”图标（Figure 6.7） 。然后，在“Parameter”窗口中选择 Cy5 与 Cy3 的信号强度 阈值，默认值为 10000。
Figure 6.7 （3）数据标准化：分别点击常用工具栏中第 9 个 和第 13 个图标 ，在流程窗口中 显示“Locfit Normalization（Lowess）”和“Standard deviation regularization”图标（Figure 6.8） ， 这两个数据标准化步骤均采取默认参数。
Figure 6.8 （4） 结果文件： 点击常用工具栏中最后 1 个图标 ， 在流程窗口中显示写入数据“Write
Data”图标（Figure 6.9） ，这是将整个处理流程写到结果文件中。右侧的“Parameter”窗口有两 种选择： 勾选“Virtual Trim”表示结果文件中保留被过滤的探针， 但其信号值用零表示； 反之， 不保留被过滤的探针。勾选“Output Trimmed Data”则表示以单独文件列出被过滤的探针；反 之，则不单独列出。
Figure 6.11 （ 2 ） 数 据 导 入 ： 点 击 “Browse” 按 钮 ， 打 开 软 件 自 带 的 表 达 量 数 据 文 件 ：
TDMS_format_sample.txt ， 样 本 数 据 便 自 动 加 载 到 “Expression File Loader” 窗 口 下 方 的 “Expression Table”栏（Figure 6.12） 。实验数据类型有两个选项：双色芯片（Two-color Array） 和单色芯片（Single-color Array） ，本例选择双色芯片。单击“Load”按钮将数据导入。