实验04 细胞的化学成分观察

实验四细胞的化学成分观察

一、实验原理

（一）细胞内DNA和RNA的原位显示

细胞被甲基绿-哌洛宁混合液染色后，其中的DNA和RNA将呈现不同的颜色，这是由于DNA、RNA的聚合程度不同引起的。DNA聚合程度较高，与甲基绿结合后被染成蓝绿色，而RNA聚合程度较低，与哌洛宁结合后显示红色。

（二）蛋白质

1．细胞内酸性蛋白和碱性蛋白的原位显示

细胞中不同的蛋白质分子所携带的酸性基团和碱性基团的数量不同，造成这些蛋白质在一定的pH溶液中所携带的电荷数也不相同。生理条件下细胞中带负电荷多的蛋白质即为酸性蛋白，而带正电荷多的蛋白质即为碱性蛋白。用三氯醋酸将细胞中的核酸抽提掉，再用不同pH的固绿染液分别染色，则可将细胞内的酸性蛋白和碱性蛋白显示出来。

2．糊粉粒

蛋白质可以贮藏物的形式存在于植物种子内。某些植物种子胚乳细胞中液泡内的贮藏蛋白质因水分丧失而成结晶体，称为糊粉粒(alenronegram)，革兰氏碘液能与糊粉粒作用而呈黄色。

（三）细胞内过氧化物酶的原位显示

在生物体内，细胞代谢过程中会产生对机体有害的过氧化氢。细胞内有过氧化氢酶(catalase)存在，能使有毒的过氧化氢分解，生成水并释放氧气，对机体起保护作用。

（四）碳水化合物的观察

1. 可溶性糖类

单糖和双糖是以溶解状态存在于活细胞中，凡是含有自由醛基(—CHO)、或含α-OH、或多羟基的酮基(C=O)的单糖或双糖，都能在碱性溶液中将二价铜离子(Cu2+)还原成一价铜离子(Cu+)，从而生成砖红色的氧化亚铜沉淀。

2．淀粉

淀粉是植物细胞内贮藏的最重要的碳水化合物，遇碘可变成蓝色或紫色。

二、实验用品

（一）材料：蟾蜍、豚鼠、马铃薯、苹果。

（二）仪器设备：光学显微镜、剪刀、镊子、解剖盘、牙签、吸水纸、载玻片、盖玻片、染色缸。

（三）试剂：70%乙醇、甲基绿-哌洛宁混合液、5%三氯醋酸、0.1%酸性固绿（pH2.2）、

0.1%碱性固绿（pH8.0～8.5）、1%革兰氏碘液、2%菲林试剂。

三、实验步骤与结果

（一）细胞内DNA和RNA的原位显示

1．蟾蜍血涂片的制备：

处死蟾蜍后，打开体腔，剪开心包，小心地在心脏尖剪一小口，血液从心脏流出，用干净载玻片的一端蘸取少许血液，以300～40°紧贴另一载玻片的一端，向玻片的另一端推去，形成较薄的血膜，血涂片制备完成后，室温下晾干备用。

2．固定：

取一张晾干的血涂片，放入70%乙醇中固定5min～10min后取出，室温下晾干。3．染色：

将已经固定的晾干的血涂片放入甲基绿-哌洛宁混合液中染色10min～15min取出，用

吸水纸吸去多余染液后，放在显微镜下镜检观察。

4．实验结果：

在低倍镜和高倍镜下，可以观察到蟾蜍红细胞的细胞质呈现红色，细胞核呈现蓝绿色。

说明DNA主要分布于细胞核；而RNA主要分布于细胞质。

（二）蛋白质

1．细胞内酸性蛋白和碱性蛋白的原位显示

1）固定：

每组取2张已经晾干的蟾蜍血涂片（前面已经制备好），放入70%乙醇中固定5min～10min，取出晾干备用。

2）抽提核酸：

将2张已经固定的晾干后的血涂片放入5%三氯醋酸中抽提核酸15min，该步骤在温度高于60℃（T＞60℃）的水浴箱中进行，取出后用自来水反复冲洗，晾干后进行染色。3）染色：

一张血涂片放入0.1%酸性固绿（pH2.2）中染色10min；另一张血涂片放入0.1%碱性固绿（pH8.0～8.5）中染色40min～60min，取出后用自来水反复冲洗干净后，晾干，置于显微镜下观察。

4）实验结果：

在低倍镜和高倍镜下，可以观察到经0.1%酸性固绿染色的蟾蜍红细胞的细胞质和核仁均被染成绿色，说明酸性蛋白主要分布于细胞质和核仁区域；经0.1%碱性固绿染色的蟾蜍红细胞的细胞核被染成绿色，说明碱性蛋白主要分布于细胞核区域。

2．糊粉粒

取发芽的小麦种子，在其胚芽附近横切一薄片，放于载玻片上，加上革兰氏碘液一滴，盖上盖玻片。在高倍镜下观察，可见种子中部染成蓝色，种皮内有一层略呈方形的细胞中有被染成黄色的颗粒，这就是蛋白质结晶体即糊粉粒。

（三）细胞内过氧化物酶的原位显示

1．准备新鲜马铃薯和熟马铃薯各一小块

2．用刀片分别切取新鲜马铃薯和熟马铃薯各一小块，置于载玻片两端，同时滴加新配制2％过氧化氢溶液2—3滴。

3．实验观察

放置5min后观察反应现象，哪一块周围有气泡生成，为什么?

（四）碳水化合物的观察

1. 可溶性糖类

吸取裴林试剂2滴于载玻片卜，用刀片切取一薄片新鲜苹果，放于溶液中。将载玻片于酒精灯上微微加热，盖上盖玻片后，置低倍镜卜观察，细胞内出现大量砖红色的氧化亚铜颗粒。

2．淀粉

取清洁的载玻片l张，先加1滴清水在载玻片中央，然后加l／2滴1％革兰氏碘液，混匀。再用刀片切取生马铃薯一薄片(越薄越好)放人染液中，盖上盖玻片。置于低倍镜下观察，可见薄壁细胞中充满了大小不等的卵圆形或圆锥形的蓝色颗粒，即为淀粉粒，它是细胞中的一种内含物。移走低倍镜，换高倍镜观察，可见淀粉粒具有层纹结构

[附] 试剂的配制

1．甲基绿-哌洛宁混合液

（1）0.2mol/L醋酸缓冲液（pH4.8）：

冰乙酸1.2ml，加蒸馏水至100ml。

醋酸钠（NaAc·3H2O）2.72g溶于100ml蒸馏水中。

使用时两种液体按照2:3的比例混合。

（2）2%甲基绿染液：去杂质甲基绿粉2.0g溶于100ml 0.2ml/L醋酸缓冲液（pH4.8）中。

甲基绿粉往往混合有影响染色效果的甲基紫，所以必须预先除去，其方法是甲基绿粉溶于蒸馏水，装入分液漏斗中，加足量的氯仿用力振荡，静置，弃去含甲基紫的氯仿，再加入氯仿重复数次，至氯仿中无甲基紫为止，最后放入40℃温箱干燥备用。

（3）1%哌洛宁染液：哌洛宁1.0溶于100ml 0.2mol/L醋酸缓冲液（pH4.8）。

上述各种溶液预先配置完成，使用时将2%甲基绿染液和1%哌洛宁染液以5:2的比例混合即成。该溶液须现配现用，不宜久置。

2．5%三氯醋酸：三氯醋酸5.0g溶于100ml蒸馏水中。

3．0.1%酸性固绿（pH2.2）：固绿0.2g溶于100ml蒸馏水中，制成0.2%固绿液，再取盐酸（比重1:19）0.11ml加蒸馏水至100ml，使用时将0.2%固绿液和上述盐酸稀释液以1:1混合即为0.1%酸性固绿（pH2.2）。

4．0.1%碱性固绿（pH8.0～8.5）：先配制0.2%固绿液（方法同上），再取碳酸氢钠50mg溶于100ml蒸馏水中制成0.05%的碳酸氢钠溶液，使用时将上述两种溶液以1:1混合即成

0.1%碱性固绿（pH8.0～8.5）。

5．裴林试剂

甲液：结晶硫酸铜(CuSQ·5H：0)34．5g，溶于500ml蒸馏水中。

乙液：将酒石酸钾钠173g和氢氧化纳125g，溶于500mi蒸馏水中，临用前将甲溶液和

乙溶液等量混合。

6．革兰氏碘液

碘化钾2g，碘1g，溶于300ml蒸馏水中。