草鱼前体脂肪细胞原代_传代培养及鉴定
草鱼凝集素分子的基因克隆与进化分析
米亚双 程传波 河南师范大学草鱼凝集素分子的基因克隆与进化分析分子质量为２９８６８．１，等电点为５．０３，４６￣６８ａａ为跨膜区，１２５￣２５６ａａ为ＣＲＤ。
氨基酸序列上的第１２５、１３６、１５３、２３２、２４７、２５５位置上含有６个高度保守的半胱氨酸残基（三角内），并且该凝集素只有一个ＣＲＤ（下划线部分）。
氨基酸序列还含有一个结合甘露糖的糖识别结合位点即ＥＰＮ基序（椭圆内）和一个作为Ｃ型凝集素重要标志的ＷＩＧＬ序列（矩形内）。
草鱼凝集素的系统进化分析。
用生物信息学ＭＥＧＡ４．０以邻接法（ＮＪ法）构建草鱼，斑马鱼，鲫鱼，雀鳝，原鸡，家鼠，牛，人等Ｃ型凝集素蛋白的系统进化树。
从图２可以看出系统进化树分为三大支，草鱼同斑马鱼，鲫鱼，雀鳝，白斑狗鱼，虹鳟，大西洋鲑进化关系较近，处于一支，说明Ｃ型凝集素在进化过程中，草鱼同硬骨鱼的亲缘关系较近，其中与斑马鱼的关系最近。
草鱼凝集素基因的同源性分析。
用ＤＮＡＭＡＮ对所选物种凝集素的ＣＲＤ进行多序列比对发现，草鱼凝集素ＣＲＤ与斑马鱼凝集素ＣＲＤ的相似度达到９０％，同鲫鱼、雀鳝、大西洋鲑和虹鳟的相似度分别达到８３％、６３％、５３％和５１％。
序列比对结果鱼是我国重要的养殖淡水鱼，其产量以及产值居于鱼类养殖业的前列。
凝集素是一类具有糖结合专一性，并与之非共价可逆结合的非酶、非免疫来源的蛋白质，其中把活性依赖于Ｃａ２＋者称为Ｃ型凝集素。
Ｃ型凝集素都具有一个或多个糖结构识别域（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ－ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ，ＣＲＤ）。
鱼类中所存在的天然凝集素分子在其非特异性免疫中占据重要地位，是鱼类抵御异己物质入侵的一道防线。
材料与方法材料。
在超市购买健康的草鱼，体长大约为３０ｃｍ，体重为１．４７ｋｇ。
方法。
（１）草鱼凝集素基因的克隆：从草鱼组织中提取草鱼ＲＮＡ，并通过ＲＴ－ＰＣＲ技术克隆获得草鱼凝集素基因。
采用反转录试剂盒合成ｃＤＮＡ。
以草鱼的ｃＤＮＡ为模板，根据已设计好的引物，运用ＰＣＲ技术获得草鱼凝集素基因。
脂肪干细胞的提取及鉴定
脂肪干细胞的提取及鉴定一、脂肪干细胞(ASCs)的提取及鉴定1、实验技术及原理:运用细胞培养技术、流式细胞术(体外扩增后ACSs的表型会发生改变，主要体现在细胞表面蛋白和细胞因子表达的变化)，差异离心术(可将基质血管细胞沉淀与悬浮的成熟脂肪细胞分离，沉淀中除ASCs，还包括血细胞、成纤维细胞和内皮细胞，基质血管细胞沉淀可以接种到孰料培养瓶中，基质细胞可贴壁，造血和其他杂质细胞不贴壁，在随后的传代过程中被出去，最终得到的ASCs可再很长时间内保持摸分化状态)。
取C57BL,6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液，0.075%II型胶原酶消化(37?，30分钟)以去除外基质，生理盐水终止胶原酶的消化，离心(1200g,10分钟)，去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DMEM重悬细胞沉淀，0.16mol/L氯化氨溶解剩余红细胞，离心洗涤，过200目铜网，得到单个核细胞。
?镜下计数，按10个细胞/ml种植在培养瓶中，37?5%CO2孵箱培养，24小时后第一次换液，以后3天换液一次，80%融合后0.25% Trypsin,0.02%EDTA消化传代。
细胞镜下作形态学观察及取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期及细胞免疫表型(CD29/CD44)的鉴定。
2、实验用品:2.1 材料:C57BL,6 WT小鼠2.2 试剂:PBS液，0.075%II型胶原酶消化，10%FBS，低糖DME M2.3 仪器设备:超净工作台、恒温培养箱、普通显微镜、倒置显微镜、离心机、离心管、解剖剪、眼科剪、镊子(尖头、平头和有沟镊)、小烧杯，200目铜网过滤器，低糖DMEM、血球计数板、橡皮瓶塞、酒精灯、换药碗3、细胞培养的方法与步骤:3.1无菌操作的要领和要求。
3.2细胞原代培养:3.2.1操作步骤a(培养用品消毒后，安放在超净工作台内，紫外线消毒，做好洗手等准备工作。
b. 取材:取C57BL,6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液。
草鱼前体脂肪细胞的原代培养
第33卷第6期水生生物学报V o l 133,N o 162009年11月ACTA HYDROB I OL OGI CA SI N I CAN ov .,2009收稿日期:2009-03-09;修订日期:2009-08-16基金项目:国家自然科学基金项目(30771667);中国博士后科学基金项目(20080431254);西北农林科技大学青年学术骨干支持计划项目资助通讯作者:吉红(1967)),男,汉族,河南灵宝人;副教授,博士;主要从事水生经济动物营养与饲料学研究。
E -m ai:lji hong @nw s u a.fedu .cn研究简报DO I 号:1013724/SP 1J 1000012009161226草鱼前体脂肪细胞的原代培养吉 红1,2曹艳姿1 林亚秋3 刘 品1 卢荣华1 苏尚顺1 杨公社1 奥宏海4(1.西北农林科技大学动物科技学院,杨凌 712100;2.西北农林科技大学水产科学研究所,杨凌 712100;3.西南民族大学生命科学与技术学院,成都 610041;4.日本国水产养殖研究所,南势 516-0193,日本)PRIM ARY CULTURE OF GRASS CARP PREADIPOCYTE IN VI TROJIHong 1,2,CAO Y a n -Z i 1,L IN Y a -Q i u 3,L IU P i n 1,L U Rong -Hua 1,S U Shang -Shun 1,YANG Gong -she 1a nd OKU H ir o m i4(1.C olle g e of A ni ma l Science and Technol ogy,N orth w estA &F Un i versit y,Yan g lin g 712100,Ch i na ;2.F isheries R esearc h In stit u t e ,N orth w estA &F Un i ve rsit y,Yan g lin g 712100,Ch i na ;3.Colle g e o f L i fe S cie n ce an d T ec hn ology,Sou th w est University for N ationa lities ,C he ngdu 610041,C hina ;4.N ati ona lR ese arc h Institute o f Aqua c u lt ure ,M i na m i -ise ,M ie 516-0193,Japan )关键词:草鱼;前体脂肪细胞;细胞培养K ey words :Grass carp ;Pread i pocyte ;Cell culture中图分类号:Q 813.1 文献标识码:A 文章编号:1000-3207(2009)06-1226-05 构建脂肪细胞体外培养体系,研究脂肪细胞分化过程,是探讨动物脂质代谢规律的重要手段。
课程论文_草鱼中肠粘膜上皮原代细胞的制备与培养
草鱼中肠粘膜上皮原代细胞的制备与培养程辉辉摘要：鱼类细胞培养技术是一项重要且潜力巨大的生物学研究技术手段和方法。
随着生物技术的发展，越来越多的鱼类细胞系（株）被建立。
本试验以草鱼中肠肠道粘膜为试验材料，采用不同消化法和离心转速梯度分离肠道粘膜细胞团，分别试验不同培养液与不同CO2浓度组合、胎牛血清浓度及细胞接种浓度时细胞生长效果，并且观察草鱼原代肠道粘膜细胞生长过程，同时采用3种细胞形态观察法、MTT检测法及相关酶活力系统评价细胞培养效果，以期尝试建立一个规范的、可批量复制的草鱼原代肠道粘膜上皮细胞的操作方法。
关键词：草鱼、中肠、粘膜上皮细胞、原代培养细胞培养作为细胞生物学乃至生物学研究的重要技术,在生物领域中占有重要地位。
动物组织(细胞) 培养开始于20世纪初,发展至今已成为生物、医学研究及应用广泛采用的技术方法。
肠道粘膜上皮细胞（intestinal epithelial cells，IECs）是肠道的主要功能细胞，其参与肠道食物的消化、吸收、免疫屏障等功能，且与肠道内、外分泌功能关系十分密切。
目前，由于饲料物质、药物、病原生物等对肠道粘膜结构与功能影响的研究日益受到重视，所以建立离体的肠道粘膜上皮细胞试验平台在营养学、生理学、病理学等研究中具有重要的意义。
1.材料与方法1.1 材料实验鱼：草鱼体重量为（22.0±5.0）g，来源于湖北省洪湖市红仙喜水产养殖专业合作社池塘养殖区，暂养于华中农业大学水产学院教学实习基地循环水养殖试验系统养殖缸内，在整个试验过程中使用草鱼配合颗粒饲料（粗蛋白含量35.0%、粗脂肪含量3.0%）饲养，每天投喂2次。
水温为（24±1.0）℃、溶解氧＞6mg/L。
材料：原代培养瓶，无菌培养皿，移液管（5 mL），无菌离心管（15 ml），解剖探针，手术剪，眼科剪，眼科镊，手术刀，医用酒精，烧杯（250 mL），废液缸，普镊，酒精灯，打火机，消毒纱布，酒精喷壶，记号笔，橡胶手套，封口膜。
草鱼脂酰辅酶A合成酶4基因全长cDNA分子克隆及表达调控
动物营养学报２０１９，３１（５）：２４４２⁃２４５０ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｉｍａｌＮｕｔｒｉｔｉｏｎ㊀ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００６⁃２６７ｘ．２０１９．０５．０５２草鱼脂酰辅酶Ａ合成酶４基因全长ｃＤＮＡ分子克隆及表达调控韩㊀振㊀高㊀琦㊀许建和㊀易乐飞㊀申㊀欣㊀丁祝进㊀程汉良∗（淮海工学院，海洋生命与水产学院，连云港２２２００５）摘㊀要：本试验采用反转录ＰＣＲ（ＲＴ⁃ＰＣＲ）技术克隆草鱼脂酰辅酶Ａ合成酶４（ＡＣＳＬ４）基因全长ｃＤＮＡ，利用实时荧光定量ＰＣＲ技术研究ＡＣＳＬ４基因在草鱼大脑㊁心脏㊁脾脏㊁肝胰脏㊁肌肉㊁肾脏㊁肠系膜脂肪㊁前肠㊁中肠㊁后肠１０种组织中的表达情况，并对投喂不同淀粉源饲料以及饥饿再投喂０㊁３㊁６㊁１２和２４ｈ后草鱼肝胰脏中ＡＣＳＬ４基因表达情况进行研究㊂结果显示：草鱼ＡＣＳＬ４基因ｃＤＮＡ全长２４１８ｂｐ，其开放阅读框２１２１ｂｐ，共编码７０６个氨基酸；草鱼ＡＣＳＬ４蛋白的氨基酸序列包含１个跨膜结构域㊁１个脂肪酸绑定基序和１个ＡＴＰ／ＡＭＰ绑定基序㊂草鱼ＡＣＳＬ４ｍＲＮＡ在大脑和脾脏中相对表达量较高，显著高于其他组织（Ｐ＜０．０５），在肌肉中相对表达量最低；投喂不同淀粉源饲料对草鱼肝胰脏中ＡＣＳＬ４ｍＲＮＡ相对表达量无显著影响（Ｐ＞０．０５）；饥饿再投喂１２ｈ后，草鱼肝胰脏中ＡＣＳＬ４ｍＲＮＡ相对表达量达到最高值，显著高于其他时间段（Ｐ＜０．０５），２４ｈ后恢复至最初水平㊂本试验从草鱼１０种混合组织中克隆了ＡＣＳＬ４基因全长ｃＤＮＡ，其所编码的氨基酸序列的主要功能性位点脂肪酸绑定基序和ＡＴＰ／ＡＭＰ绑定基序在不同物种间高度保守；草鱼ＡＣＳＬ４基因主要在大脑和脾脏中表达；饲料中淀粉源对草鱼肝胰脏中ＡＣＳＬ４基因的表达无显著影响；在饥饿再投喂１２ｈ后，草鱼肝胰脏中ＡＣＳＬ４ｍＲＮＡ相对表达量达到最高值，随后显著下降至最初水平㊂关键词：草鱼；长链脂酰辅酶Ａ合成酶４；分子克隆；表达调控中图分类号：Ｑ７８５；Ｑ７８６㊀㊀㊀㊀文献标识码：Ａ㊀㊀㊀㊀文章编号：１００６⁃２６７Ｘ（２０１９）０５⁃２４４２⁃０９收稿日期：２０１８－１０－３０基金项目：国家自然科学基金项目（３１２７２６３６）；江苏省自然科学基金项目（ＢＫ２０１２６６４）；江苏省优势学科建设工程项目（ＰＡＰＤ）；江苏省研究生科研与实践创新计划项目（ＳＹ２０１７０１Ｘ）作者简介：韩㊀振（１９９２ ），男，江苏连云港人，硕士研究生，研究方向为水产动物营养与饲料㊂Ｅ⁃ｍａｉｌ：５１３６２０６３８＠ｑｑ．ｃｏｍ∗通信作者：程汉良，教授，硕士生导师，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ＣＨＬ３１３９＠１６３．ｃｏｍ㊀㊀脂酰辅酶Ａ合成酶（ａｃｙｌ⁃ＣｏＡｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ，ＡＣＳ）首先在辅酶Ａ和ＡＴＰ存在情况下催化游离脂肪酸合成脂酰辅酶Ａ，这是外源及内源性脂肪酸进入代谢途径的第１步，而后经过活化的脂肪酸便可参与合成甘油三酯（ＴＧ）㊁神经酰胺，以及进入线粒体进行β－氧化分解供能，因此ＡＣＳ是脂肪酸合成与分解代谢的关键酶㊂ＡＣＳ由多基因家族编码，人ＡＣＳ家族至少存在２６个成员㊂由于催化脂肪酸碳链的长度不同，可将ＡＣＳ分为超长链脂酰辅酶Ａ合成酶（ＡＣＳＶＬ）㊁长链脂酰辅酶Ａ合成酶（ｌｏｎｇｃｈａｉｎａｃｙｌ⁃ＣｏＡｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ，ＡＣＳＬ）㊁中链脂酰辅酶Ａ合成酶（ＡＣＳＭ）以及短链脂酰辅酶Ａ合成酶（ＡＣＳＳ）等［１－３］㊂㊀㊀ＡＣＳＬ主要催化Ｃʒ１２ Ｃʒ２２长链脂肪酸活化成长链脂酰辅酶Ａ，从而参与到细胞的生命活动中［４］㊂目前在哺乳动物中已经发现了５种不同的ＡＣＳＬ家族成员：ＡＣＳＬ１㊁ＡＣＳＬ３㊁ＡＣＳＬ４㊁ＡＣ⁃ＳＬ５㊁ＡＣＳＬ６［５］㊂２００４年，人类基因命名委员会（ＨＧＮＣ）和鼠类基因命名委员会（ＭＧＮＣ）修订了ＡＣＳＬ基因的命名，将原来的ＡＣＳＬ１和ＡＣＳＬ２合并为ＡＣＳＬ１基因，因此，ＡＣＳＬ基因家族中没有ＡＣＳＬ２基因，但最近研究发现，硬骨鱼类ＡＣＳＬ２基５期韩㊀振等：草鱼脂酰辅酶Ａ合成酶４基因全长ｃＤＮＡ分子克隆及表达调控因仍然存在［６］㊂ＡＣＳＬ４主要活化多不饱和脂肪酸，对于二十碳五烯酸（Ｃ２０ʒ５ｎ６）和花生四烯酸（Ｃ２０ʒ４ｎ６）的活化作用要比亚油酸（Ｃ１８ʒ１）的活化作用高５ ６倍［７］㊂ＡＣＳＬ４作为外周膜蛋白存在于线粒体膜和微粒体的过氧化物膜上，通过影响肾上腺以及肝脏来表达其生理功能，它与肥胖㊁脂肪肝等脂质代谢引起的相关疾病有密切联系［８］，同时ＡＣＳＬ４的多态性表达与脂质种类以及含量有明显的关联，在斑马鱼（Ｄａｎｉｏｒｅｒｉｏ）中，ＡＣＳＬ４ａ表达在幼体和成体的消化道中，而ＡＣ⁃ＳＬ４ｂ则表达在成体肝胰脏和肠道中［９－１０］㊂目前，虽然研究学者已经完成了草鱼（Ｃｔｅｎｏｐｈａｒｙｎｇｏｄｏｎｉｄｅｌｌｕｓ）基因组的测序，但由于可变剪接的存在，有些基因的ｍＲＮＡ前体可以通过不同的剪接方式产生不同的ｍＲＮＡ剪接异构体，可变剪接是调节基因表达和产生蛋白质组多样性的重要机制，因此，为有效地探究ＡＣＳＬ４基因的表达情况，基因克隆是识别可变剪接的有效方式㊂㊀㊀草鱼是我国重要养殖鱼类，由于近些年高密度的集约化养殖，鱼类营养性脂肪肝问题日益严重，肝胰脏的损伤病变直接导致机体代谢机能紊乱，降低疾病抵抗力，影响鱼类生长，进而造成经济损失㊂鱼类脂肪的堆积和代谢往往受脂肪代谢调控酶的影响㊂为进一步探究脂肪代谢的分子机理，本试验克隆了草鱼ＡＣＳＬ４基因全长ｃＤＮＡ，分析其在不同组织中的表达情况，并对投喂不同淀粉源饲料以及饥饿再投喂后草鱼肝胰脏ＡＣＳＬ４ｍＲＮＡ的相对表达量进行研究，以期为预防鱼类脂肪肝㊁促进生产㊁研制饲料配方提供参考㊂１㊀材料与方法１．１㊀草鱼ＡＣＳＬ４基因全长ｃＤＮＡ分子克隆㊀㊀试验草鱼来自连云港市赣榆区罗阳镇渔场，挑选３尾湿重在１３００ｇ左右的个体㊂提取草鱼大脑㊁心脏㊁脾脏㊁肝胰脏㊁肌肉㊁肾脏㊁肠系膜脂肪㊁前肠㊁中肠㊁后肠１０种组织总ＲＮＡ，制成混合ＲＮＡ，并以Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１６ＡＰ为引物反转录合成ｃＤＮＡ第１链，作为基因克隆模板㊂㊀㊀根据斑马鱼等的ＡＣＳＬ４保守序列设计２对核心序列兼并引物（表１），ＰＣＲ扩增ＡＣＳＬ４基因２对核心序列，采用１％琼脂糖电泳凝胶检测ＰＣＲ产物，将胶回收纯化目的片段后进行克隆测序；根据测序验证后的核心片段序列设计３ᶄ和５ᶄｃＤＮＡ末端快速扩增（ＲＡＣＥ）特异性引物（表１），３ᶄ和５ᶄ末端序列克隆按照Ｃｈｅｎｇ等［１１］的方法进行㊂㊀㊀使用ＤＮＡＳｔａｒ软件测序，将得到的草鱼ＡＣＳＬ４核心序列㊁３ᶄ和５ᶄ末端序列进行组装拼接，获得草鱼ＡＣＳＬ４基因ｃＤＮＡ全长，并通过ＮＣＢＩ网站进行同源性序列分析，使用ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ网站预测信号肽；使用ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／网站预测糖基化位点㊁磷酸化位点；使用ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｔｅｒｐｒｏ／及ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ／网站预测跨膜结构域；使用ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔ⁃ｐａｒａｍ／网站分析亲疏水性；使用ｈｔｔｐ：／／ｎｐｓａ⁃ｐｂｉｌ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／及ｈｔｔｐ：／／ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ网站进行蛋白质二级结构预测㊂表１㊀本试验所用引物序列及预期产物大小Ｔａｂｌｅ１㊀Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓａｎｄｅｘｐｅｃｔｅｄｐｒｏｄｕｃｔｓｉｚｅｓｏｆｐｒｉｍｅｒｓｕｓｅｄｉｎｔｈｉｓｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ引物名称Ｐｒｉｍｅｒｎａｍｅｓ序列Ｓｅｑｕｅｎｃｅ（５ᶄ ３ᶄ）用途Ｕｓａｇｅ预期产物大小Ｅｘｐｅｃｔｅｄｐｒｏｄｕｃｔｓｉｚｅ／ｂｐ反转录ＰＣＲ引物ＲＴ⁃ＰＣＲｐｒｉｍｅｒｓＡＣＳＬ４⁃Ｆ１ＡＣＳＬ４⁃Ｒ１ＴＧＹＣＴＨＧＧＭＡＣＣＣＧＡＧＡＲＴＧＡＴＧＣＧＲＴＣＣＡＴＫＡＴＴＴ扩增核心序列１８６４ＡＣＳＬ４⁃Ｆ２ＡＣＳＬ４⁃Ｒ２ＴＣＧＧＣＴＡＴＴＣＣＡＣＡＣＣＡＣＣＴＴＧＣＧＲＴＣＷＡＣＡＡＴＹＴＧ扩增核心序列２６９１３ᶄ㊁５ᶄｃＤＮＡ末端快速扩增引物３ᶄａｎｄ５ᶄＲＡＣＥｐｒｉｍｅｒｓ３４４２㊀动㊀物㊀营㊀养㊀学㊀报３１卷续表１引物名称Ｐｒｉｍｅｒｎａｍｅｓ序列Ｓｅｑｕｅｎｃｅ（５ᶄ ３ᶄ）用途Ｕｓａｇｅ预期产物大小Ｅｘｐｅｃｔｅｄｐｒｏｄｕｃｔｓｉｚｅ／ｂｐＯｌｉｇｏ（ｄＴ）１６ＡＰＣＴＧＡＴＣＴＡＧＡＧＧＴＡＣＣＧＧＡＴＣＣ（Ｔ）１６３ᶄＲＡＣＥ反转录合成第１链 ＡＰＣＴＧＡＴＣＴＡＧＡＧＧＴＡＣＣＧＧＡＴＣＣ与ＡＣＳＬ４⁃３⁃Ｆ１或ＡＣＳＬ４⁃５⁃Ｒ１合用 ＲＡＣＥ３⁃ＲＣＴＡＧＡＧＧＴＡＣＣＧＧＡＴＣＣＴＴ与ＡＣＳＬ４⁃３⁃Ｆ２合用ＡＣＳＬ４⁃３⁃Ｆ１ＡＣＳＬ４⁃３⁃Ｆ２ＧＣＧＴＡＴＧＡＴＧＴＴＧＴＣＣＧＴＣＧＧＡＧＧＴＣＣＴＡＡＴＧＴＧ与ＡＰ合用完成３ᶄＲＡＣＥ第１轮与ＲＡＣＥ３⁃Ｒ合用完成３ᶄＲＡＣＥ第１轮８６８ＡＣＳＬ４⁃５⁃ＲＡＣＳＬ４⁃５⁃Ｒ１ＡＣＳＬ４⁃５⁃Ｒ２ＡＧＣＣＡＣＴＧＣＣＴＣＴＴＣＴＣＣＴＧＣＣＡＧＴＣＣＧＣＴＣＣＣＡＡＡＴＧＡＡＧＡＣＴＴＴＣＣＣＡＣＴＣＧ５ᶄＲＡＣＥ反转录合成第１链与Ｏｌｉｇｏ（ｄｔ）１６ＡＰ合用完成５ᶄＲＡＣＥ第１轮与ＡＰ合用完成５ᶄＲＡＣＥ第２轮４２１实时荧光定量ＲＣＲ引物ＲＴ⁃ｑＰＣＲｐｒｉｍｅｒｓｑＡＣＳＬ４⁃ＦｑＡＣＳＬ４⁃ＲＴＴＣＴＧＣＴＧＴＣＣＴＧＴＴＧＧＴＣＡＡＧＧＣＴＣＣＴＡＣＴＣＧＴＣＣＴＧＴＧＣＴＡ目的基因ＡＣＳＬ４定量ＰＣＲ引物９８ｑｅＥＦ１Ａ⁃ＦｑｅＥＦ１Ａ⁃ＲＣＧＣＣＡＧＴＧＴＴＧＣＣＴＴＣＧＴＣＧＣＴＣＡＡＴＣＴＴＣＣＡＴＣＣＣＴＴ内参基因ｅＥＦ１Ａ定量ＰＣＲ引物９８ｑＧＡＰＤＨ１⁃ＦｑＧＡＰＤＨ１⁃ＲＴＧＡＣＣＣＧＴＧＣＴＧＣＴＴＴＣＣＴＴＧＣＣＧＣＣＴＴＣＴＧＣＣＴＴＡ内参基因ＧＡＰＤＨ１定量ＰＣＲ引物９７ｑＲＰＬ１３Ａ⁃ＦｑＲＰＬ１３Ａ⁃ＲＣＴＴＣＴＧＧＡＧＧＡＣＡＧＴＡＡＧＡＧＧＴＡＴＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＧＡＴＧＣＣＡＴＣＡＡＡＧＡＣ内参基因ＲＰＬ１３Ａ定量ＰＣＲ引物９３１．２㊀草鱼ＡＣＳＬ４基因组织表达㊀㊀提取３尾草鱼大脑㊁心脏㊁脾脏㊁肝胰脏㊁白肌㊁肾脏㊁肠系膜脂肪㊁前肠㊁中肠㊁后肠１０种组织总ＲＮＡ，以随机引物反转录合成ｃＤＮＡ第１链，稀释１０倍后作为实时荧光定量ＰＣＲ反应模板㊂根据克隆得到的草鱼ＡＣＳＬ４基因ｃＤＮＡ设计实时荧光定量ＰＣＲ引物（表１），以真核翻译延伸因子１Ａ（ｅＥＦ１Ａ）㊁甘油醛－３－磷酸脱氢酶１（ＧＡＰＤＨ１）和核糖体蛋白Ｌ１３Ａ（ＲＰＬ１３Ａ）为内参基因，参照严媛等［１２］的反应体系和条件分析草鱼ＡＣＳＬ４基因在不同组织中的表达情况㊂１．３㊀不同淀粉源饲料对草鱼肝胰脏中ＡＣＳＬ４基因表达的影响１．３．１㊀试验饲料配方㊀㊀试验用鱼粉及预混料由通辽市岳泰饲料有限公司提供㊂以鱼粉㊁豆粕㊁菜籽粕等为主要蛋白质源，以豆油为主要脂肪源，分别以玉米淀粉㊁马铃薯淀粉和小麦淀粉为淀粉源配制３种试验饲料㊂３种试验饲料中淀粉的添加量均为２５％，其他组分完全相同，其组成及营养水平见表２㊂１．３．２㊀饲养管理㊀㊀试验用鱼购自连云港市赣榆区罗阳镇渔场㊂挑选规格整齐㊁体态健壮的草鱼幼鱼２７０尾，规格为（３９．４ʃ１．６）ｇ／尾，随机分为３组，分别为玉米淀粉组㊁马铃薯淀粉组和小麦淀粉组，每组３个重复，每个重复３０尾，养殖周期１５周㊂试验期间，每天按照鱼体重２％ ４％投喂至饱食，投喂时间分别为０８：００㊁１１：００㊁１４：００㊁１７：００；隔周交替使用二氧化氯和土霉素进行消毒杀菌㊂１．３．３㊀不同淀粉源饲料对草鱼生长性能及肝胰脏中ＡＣＳＬ４基因表达的影响㊀㊀待饲养试验结束，在进食６ｈ后采用ＭＳ－２２２麻醉草鱼并逐条称重；每缸解剖６尾鱼，测量体长和内脏重；取其肝胰脏并提取总ＲＮＡ进行反转录后用于肝胰脏中ＡＣＳＬ４基因定量表达研究㊂生长性能指标计算公式如下：增重率（ＷＧＲ，％）＝［（末重－初重）／初重］ˑ１００；脏体比（ＶＳＩ，％）＝（内脏重／体重）ˑ１００；饲料系数（ＦＣＲ）＝饲料消耗量／（末重－初重）㊂１．４㊀饥饿再投喂对草鱼肝胰脏中ＡＣＳＬ４基因表达的影响㊀㊀饲养试验结束后，将上述小麦淀粉组草鱼饥饿２４ｈ后饱食投喂小麦淀粉组试验饲料，分别在投喂０㊁３㊁６㊁１２和２４ｈ后取３尾，每尾９０ｇ左右，４４４２５期韩㊀振等：草鱼脂酰辅酶Ａ合成酶４基因全长ｃＤＮＡ分子克隆及表达调控解剖取其肝胰脏并提取总ＲＮＡ反转录后用于肝胰脏中ＡＣＳＬ４基因定量表达研究㊂１．５㊀数据分析㊀㊀组织中ＡＣＳＬ４基因相对表达量采用２－әәＣｔ法计算㊂试验数据采用ＳＰＳＳ２５．０软件的单因素方差分析（ｏｎｅ⁃ｗａｙＡＮＯＶＡ）和ＬＳＤ法多重比较进行统计学分析，Ｐ＜０．０５表示差异显著㊂结果采用平均值ʃ标准差表示，使用Ｏｒｉｇｉｎ２０１８进行制图㊂表２㊀试验饲料组成及营养水平（干物质基础）Ｔａｂｌｅ２㊀Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｎｄｎｕｔｒｉｅｎｔｌｅｖｅｌｓｏｆｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｄｉｅｔｓ（ＤＭｂａｓｉｓ）％项目Ｉｔｅｍｓ组别Ｇｒｏｕｐｓ玉米淀粉Ｃｏｒｎｓｔａｒｃｈ马铃薯淀粉Ｐｏｔａｔｏｓｔａｒｃｈ小麦淀粉Ｗｈｅａｔｓｔａｒｃｈ原料Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ进口鱼粉Ｉｍｐｏｒｔｅｄｆｉｓｈｍｅａｌ１５．００１５．００１５．００菜籽粕Ｒａｐｅｓｅｅｄｍｅａｌ２４．７０２４．７０２４．７０豆粕Ｓｏｙｂｅａｎｍｅａｌ２４．００２４．００２４．００血粉Ｂｌｏｏｄｐｏｗｄｅｒ３．００３．００３．００玉米淀粉Ｃｏｒｎｓｔａｒｃｈ２５．００马铃薯淀粉Ｐｏｔａｔｏｓｔａｒｃｈ２５．００小麦淀粉Ｗｈｅａｔｓｔａｒｃｈ２５．００ＤＬ－蛋氨酸ＤＬ⁃Ｍｅｔ０．０８０．０８０．０８Ｌ－赖氨酸Ｌ⁃Ｌｙｓ０．１２０．１２０．１２胆碱Ｃｈｏｌｉｎｅ０．３００．３００．３０磷酸二氢钙Ｃａ（Ｈ２ＰＯ４）２１．８０１．８０１．８０豆油Ｓｏｙｂｅａｎｏｉｌ５．００５．００５．００预混料Ｐｒｅｍｉｘ１）１．００１．００１．００合计Ｔｏｔａｌ１００．００１００．００１００．００营养水平Ｎｕｔｒｉｅｎｔｌｅｖｅｌｓ２）粗蛋白质ＣＰ３５．００３５．００３５．００粗脂肪ＥＥ６．１０６．１０６．１０㊀㊀１）预混料为每千克饲料提供Ｔｈｅｐｒｅｍｉｘｐｒｏｖｉｄｅｄｔｈｅｆｏｌｌｏｗｉｎｇｐｅｒｋｉｌｏｇｒａｍｏｆｄｉｅｔｓ：ＶＡ５０００ＩＵ，ＶＤ２０００ＩＵ，ＶＥ５０ｍｇ，ＶＢ１８ｍｇ，ＶＫ５ｍｇ，ＶＢ２１０ｍｇ，ＶＢ１２０．０３ｍｇ，ＶＢ６８ｍｇ，叶酸ｆｏｌｉｃａｃｉｄ３ｍｇ，泛酸ｐａｎｔｏｔｈｅｎｉｃａｃｉｄ３０ｍｇ，烟酸ｎｉｃ⁃ｏｔｉｎｉｃａｃｉｄ３０ｍｇ，生物素ｂｉｏｔｉｎ０．４ｍｇ，ＶＣ１８０ｍｇ，Ｃｕ４ｍｇ，Ｆｅ１７０ｍｇ，Ｚｎ１５０ｍｇ，Ｍｎ２２ｍｇ，Ｉ１ｍｇ，Ｃｏ０．２５ｍｇ，Ｓｅ０．４ｍｇ，肌醇ｉｎｏｓｉｔｏｌ１００ｍｇ，Ｍｇ３００ｍｇ㊂㊀㊀２）计算值Ｃａｌｃｕｌａｔｅｄｖａｌｕｅｓ㊂２㊀结果与分析２．１㊀草鱼ＡＣＳＬ４基因全长ｃＤＮＡ分子特征㊀㊀草鱼ＡＣＳＬ４基因ｃＤＮＡ全长２４１８ｂｐ（Ｇｅｎ⁃Ｂａｎｋ登录号为ＭＨ８２２３２０），其中开放阅读框２１２１ｂｐ，共编码７０６个氨基酸；ＡＣＳＬ４属于亲水性蛋白，具有１个跨膜结构域，第７ ２９氨基酸位点是跨膜区；对其蛋白质二级结构预测发现，其由α螺旋（Ｈｈ）㊁延伸链（Ｅｅ）和无规则卷曲（Ｃｃ）组成，其中Ｈｈ占２２．６６５％，Ｅｅ占２８．３３％，Ｃｃ占４９．０１％；无信号肽和糖基化位点㊂２．２㊀草鱼ＡＣＳＬ４基因的组织表达㊀㊀将反应模板分别以１０－１稀释５种不同浓度，实时荧光定量ＰＣＲ并制作内参基因标准曲线，根据内参基因筛选原则，选取扩增效率在９９％ １０１％且表达稳定的草鱼ｅＥＦ１Ａ和ＲＰＬ１３Ａ基因组合为内参基因，对草鱼ＡＣＳＬ４基因在大脑㊁心脏㊁脾脏㊁肝胰脏㊁肌肉㊁肾脏㊁肠系膜脂肪㊁前肠㊁中肠㊁后肠１０种组织中的表达情况进行研究，结果见图１㊂ＡＣＳＬ４ｍＲＮＡ相对表达量在大脑和脾脏中较高，分别为４１．８５和４０．６３，显著高于其他组织（Ｐ＜０．０５）；其次是在肝胰脏和前肠中，分别为１４．１４和１１．０３；在肌肉中最低，仅为１．００㊂５４４２㊀动㊀物㊀营㊀养㊀学㊀报３１卷㊀㊀数据柱上标注不同字母表示差异显著（Ｐ＜０．０５），无字母或相同字母表示差异不显著（Ｐ＞０．０５）㊂下图同㊂㊀㊀Ｖａｌｕｅｃｏｌｕｍｎｓｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｅｔｔｅｒｓｍｅａｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（Ｐ＜０．０５），ｗｈｉｌｅｗｉｔｈｎｏｏｒｔｈｅｓａｍｅｌｅｔｔｅｒｓｍｅａｎｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（Ｐ＞０．０５）．Ｔｈｅｓａｍｅａｓｂｅｌｏｗ．图１㊀草鱼ＡＣＳＬ４基因组织表达分析Ｆｉｇ．１㊀ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆＡＣＳＬ４ｇｅｎｅｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｓｓｕｅｓｏｆｇｒａｓｓｃａｒｐ２．３㊀不同淀粉源饲料对草鱼生长性能的影响㊀㊀由表３可知，马铃薯淀粉组和小麦淀粉组的增重率分别为１６２．７％和１５８．３％，显著高于玉米淀粉组（Ｐ＜０．０５）；马铃薯淀粉组和小麦淀粉组的饲料系数分别为１．２０和１．２３，显著低于玉米淀粉组（Ｐ＜０．０５）；此外，马铃薯淀粉组和小麦淀粉组脏体比显著低于玉米淀粉组（Ｐ＜０．０５）；马铃薯淀粉组和小麦淀粉组之间各项生长指标均无显著差异（Ｐ＞０．０５）㊂２．４㊀不同淀粉源饲料对草鱼肝胰脏中ＡＣＳＬ４基因表达的影响㊀㊀由图２可知，投喂不同淀粉源饲料对草鱼肝胰脏中ＡＣＳＬ４ｍＲＮＡ相对表达量无显著影响（Ｐ＞０．０５）㊂２．５㊀饥饿再投喂对草鱼肝胰脏中ＡＣＳＬ４基因表达的影响㊀㊀饥饿再投喂后，草鱼肝胰脏中ＡＣＳＬ４ｍＲＮＡ相对表达量随投喂后时间的延长呈先升高再下降趋势，饥饿再投喂后１２ｈ达到最高值，为２．８７，显著高于其他时间段（Ｐ＜０．０５），饥饿再投喂后２４ｈ显著下降（Ｐ＜０．０５），并恢复至最初水平（图３）㊂表３㊀不同淀粉源饲料对草鱼生长性能的影响Ｔａｂｌｅ３㊀Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｄｉｅｔｓｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｔａｒｃｈｓｏｕｒｃｅｓｏｎｇｒｏｗｔｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｏｆｇｒａｓｓｃａｒｐ组别Ｇｒｏｕｐｓ初重Ｉｎｉｔｉａｌｗｅｉｇｈｔ／ｇ末重Ｆｉｎａｌｗｅｉｇｈｔ／ｇ脏体比ＶＳＩ／％增重率ＷＧＲ／％饲料系数ＦＣＲ玉米淀粉Ｃｏｒｎｓｔａｒｃｈ３９．４ʃ１．６０８９．７ʃ０．８ｂ８．１８ʃ０．３５ｂ１２７．７ʃ１．９ｂ１．５１ʃ０．０２ｂ马铃薯淀粉Ｐｏｔａｔｏｓｔａｒｃｈ３９．４ʃ１．６０１０３．５ʃ３．９ａ６．３１ʃ０．４５ａ１６２．７ʃ１０．０ａ１．２０ʃ０．０７ａ小麦淀粉Ｗｈｅａｔｓｔａｒｃｈ３９．４ʃ１．６０１０１．８ʃ３．３ａ７．１０ʃ０．０７ａ１５８．３ʃ８．３ａ１．２３ʃ０．０７ａ㊀㊀同列数据肩标不同字母表示差异显著（Ｐ＜０．０５），无字母或相同字母表示差异不显著（Ｐ＞０．０５）㊂㊀㊀Ｖａｌｕｅｓｉｎｔｈｅｓａｍｅｃｏｌｕｍｎｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｅｔｔｅｒｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔｓｍｅａｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（Ｐ＜０．０５），ｗｈｉｌｅｗｉｔｈｎｏｏｒｔｈｅｓａｍｅｌｅｔｔｅｒｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔｓｍｅａｎｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（Ｐ＞０．０５）．３㊀讨㊀论３．１㊀草鱼ＡＣＳＬ４蛋白结构㊀㊀对草鱼ＡＣＳＬ４蛋白的氨基酸序列功能分析发现，草鱼ＡＣＳＬ４蛋白具有１个脂肪酸绑定基序（Ｖ２０１ Ｑ２３６）和１个ＡＴＰ／ＡＭＰ绑定基序（Ｖ３８１ Ｉ４１８），这与其他物种［１３］保持一致，说明这段序列在不同物种间高度保守；跨膜结构预测发现草鱼ＡＣＳＬ４蛋白具有１个跨膜结构域（Ｖ７ Ｌ２９），与大鼠［７］和猪［１４］等哺乳类结果一致；对草鱼ＡＣＳＬ４蛋白的氨基酸序列相似性分析发现，其氨基酸序列与其他脊椎动物具有较高相似性，与斑马鱼相似度为９２％，其次是墨西哥丽脂鲤（Ａｓｔｙａｎａｘｍｅｘｉｃａ⁃ｎｕｓ），为８６％，与人类（Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ）相似度为７５％㊂３．２㊀草鱼ＡＣＳＬ４基因的组织表达㊀㊀ＡＣＳＬ４在脂肪代谢中起重要作用，通过辅酶Ａ催化长链脂肪酸产生长链脂酰辅酶Ａ，从而参与６４４２５期韩㊀振等：草鱼脂酰辅酶Ａ合成酶４基因全长ｃＤＮＡ分子克隆及表达调控到脂肪酸的合成和分解代谢过程，是脂肪代谢过程中的限速酶㊂研究表明，ＡＣＳＬ４优先使用花生四烯酸作为底物，在人类中，ＡＣＳＬ４基因主要表达于类固醇组织如胎盘㊁脑㊁卵巢㊁脾脏和肾上腺皮质中，而在人类肝脏以及肠胃系统中较低程度或直接不表达，在鹅中主要表达于大脑，在心脏和脂肪组织中少量表达［１５］㊂本研究发现草鱼ＡＣＳＬ４基因主要表达在大脑和脾脏，其次是肝胰脏和前肠，在肌肉中表达量最低；在哺乳动物中，ＡＣＳＬ４是前列腺素和白三烯的前体物，可调控花生四烯酸向类二十烷酸的流出通路，并且ＡＣＳＬ４基因过表达可增加类二十烷酸辅酶Ａ的合成并且促进花生四烯酸向脑磷脂㊁磷脂酰肌醇以及甘油三酯的转化［７，１６］，而花生四烯酸对大脑的生理活动极其重要，较多的花生四烯酸需求决定了ＡＣＳＬ４在大脑中高表达；而在一些免疫器官，如脾脏㊁肾上腺等合成类固醇组织中，ＡＣＳＬ４基因的表达与类固醇激素和生长因子受体有关，沉默ＡＣＳＬ４基因可以抑制类固醇激素的合成［１７－１８］，这充分说明ＡＣＳＬ４主要参与类固醇脂质的合成，ＡＣＳＬ４基因主要表达于合成类固醇的组织中，对于其他非合成类固醇的组织如肌肉㊁后肠等中，则表达量较低㊂图２㊀投喂不同淀粉源饲料的草鱼肝胰脏ＡＣＳＬ４ｍＲＮＡ相对表达量Ｆｉｇ．２㊀ＲｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＡＣＳＬ４ｍＲＮＡｉｎｈｅｐａｔｏｐａｎｃｒｅａｓｏｆｇｒａｓｓｃａｒｐｆｅｄｄｉｅｔｓｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｔａｒｃｈｓｏｕｒｃｅｓ３．３㊀不同淀粉源饲料对草鱼生长性能的影响㊀㊀在饲料所有供能原料中，淀粉是最廉价的能量来源，适当的利用淀粉可以有效节约饲料成本㊂一般来讲，肉食性鱼类对淀粉的利用率较低，至多可以利用１０％ ２０％，而草鱼是植食性鱼类，饲料中淀粉的含量可以达到５６％㊂田丽霞等［１９］研究发现，草鱼对小麦淀粉的表观消化率高于玉米淀粉，但在草鱼生长上二者并无显著差异㊂郭文英［２０］在对西伯利亚鲟鱼的研究中发现，鲟鱼对α－淀粉的利用率大于小麦淀粉和玉米淀粉㊂叶元土等［２１］认为由于直链淀粉的含量不同，鱼类对薯类淀粉的利用率高于谷类淀粉㊂本研究发现，马铃薯淀粉组和小麦淀粉组草鱼的饲料系数分别为１．２０和１．２３，显著低于玉米淀粉组的１．５１，说明马铃薯淀粉和小麦淀粉有利于草鱼的消化吸收，而玉米淀粉不利于草鱼的消化吸收，分析原因，可能是由于玉米淀粉中直链淀粉含量较高，不利于水产颗粒饲料的黏接，可通过熟化后适当应用；而在消化吸收方面，目前饲料运用的玉米淀粉多为玉米角质层淀粉，不利于水产动物的消化和吸收，因此，玉米淀粉不适合作为水产饲料的淀粉源㊂图３㊀饥饿再投喂后草鱼肝胰脏中ＡＣＳＬ４ｍＲＮＡ相对表达量Ｆｉｇ．３㊀ＲｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＡＣＳＬ４ｍＲＮＡｉｎｈｅｐａｔｏｐａｎｃｒｅａｓｏｆｇｒａｓｓｃａｒｐａｆｔｅｒｓｔａｒｖａｔｉｏｎａｎｄｒｅｆｅｅｄｉｎｇ３．４㊀不同淀粉源饲料对草鱼肝胰脏中ＡＣＳＬ４基因表达的影响㊀㊀肝脏是鱼类进行糖代谢的重要器官，履行糖原的合成与分解功能，从而维持血糖的稳定，同时高糖饲料能够促进鱼体的脂肪生成［１９，２２］，淀粉经肠道消化吸收后直接为鱼体的生理活动提供能量，多余的糖类可转变成脂肪储存起来㊂Ｌｉｎ等［２３］研究表明，脂肪酸合成酶（ＦＡＳ）的活性受饲７４４２㊀动㊀物㊀营㊀养㊀学㊀报３１卷料中碳水化合物的正向调节，碳水化合物可能控制着整个肝脏中的脂肪合成过程；冯姣［２４］和夏晓杰［２５］在对齐口裂腹鱼的饲料中添加氧化魔芋葡甘露聚糖（ＯＫＧＭ）和ＲＳ４型抗性淀粉（ＲＳ）的研究中发现，添加１．６％ＯＫＧＭ能提高肝胰脏中脂蛋白脂肪酶（ＬＰＬ）㊁过氧化物酶体增殖物激活受体α（ＰＰＡＲα）基因的相对表达量㊂在本研究中，对ＡＣＳＬ４基因在饲喂不同淀粉源饲料的草鱼肝胰脏中的表达情况进行分析后发现，ＡＣＳＬ４ｍＲＮＡ相对表达量没有显著变化，这说明ＡＣＳＬ４基因在肝胰脏中是稳定表达的，并不受外源性淀粉源的影响；或者可能由于ＡＣＳＬ４对底物选择中更多的偏好于多不饱和脂肪酸，而本试验中饲料不同的淀粉源对脂肪的生物合成的影响并没有达到显著差异，为进一步探究不同淀粉源对草鱼脂肪代谢相关基因的影响，可对ｍＲＮＡ表达谱进行深度分析以了解整个脂肪代谢的通路情况㊂３．５㊀饥饿再投喂对草鱼肝胰脏中ＡＣＳＬ４基因表达的影响㊀㊀鱼类在饥饿胁迫下会通过降低代谢水平和调节自身能量并通过分解体内储存的脂肪和糖原来维持机体基础代谢㊂田娟等［２６］报道，在饥饿胁迫下，罗非鱼肝脏ＬＰＬｍＲＮＡ相对表达量显著增强，并在重投喂后ＬＰＬｍＲＮＡ相对表达量显著下降㊂同样的，覃川杰等［２７］在黄颡鱼的饥饿再投喂试验中发现，随着饥饿时间的延长，肝脏中ＬＰＬｍＲＮＡ相对表达量显著上升，而脂肪酸结合蛋白（ＦＡＰＢ）及ＦＡＳｍＲＮＡ相对表达量则显著下降，这说明饥饿胁迫下肝脏可能通过分解脂肪供能，同时降低脂肪的生物合成；严媛等［１２］在对草鱼的研究中发现，饥饿再投喂１２ｈ后，草鱼肝胰脏中乙酰辅酶Ａ羧化酶２（ＡＣＣ２）ｍＲＮＡ相对表达量达到最高，２４ｈ后显著下降㊂本研究中，草鱼饥饿再投喂１２ｈ后，肝胰脏中ＡＣＳＬ４ｍＲＮＡ相对表达量显著升高，２４ｈ后显著下降至最初水平，与草鱼肝胰脏中ＡＣＣ２基因的表达规律相同，说明再投喂１２ｈ后ＡＣＳＬ４开始参与脂肪分解供能，而在饥饿再投喂０ ６ｈ内肝胰脏中ＡＣＳＬ４ｍＲＮＡ相对表达量并无显著差异，说明此期间鱼体内主要进行的是脂肪的生物合成㊂４㊀结㊀论㊀㊀本试验从草鱼１０种混合组织中克隆了ＡＣＳＬ４基因全长ｃＤＮＡ，其编码的氨基酸序列主要功能性位点脂肪酸绑定基序和ＡＴＰ／ＡＭＰ绑定基序在不同物种间高度保守；草鱼ＡＣＳＬ４基因主要在大脑和脾脏中表达；草鱼对马铃薯淀粉和小麦淀粉的利用效果优于玉米淀粉；饲料淀粉源对草鱼肝胰脏中ＡＣＳＬ４基因的表达无显著影响；在饥饿再投喂１２ｈ后，草鱼肝胰脏中ＡＣＳＬ４ｍＲＮＡ相对表达量达到最高，随后显著下降至最初水平㊂参考文献：［１］㊀ＰＩＣＣＩＮＩＭ，ＶＩＴＥＬＬＩＦ，ＢＲＵＴＴＩＮＩＭ，ｅｔａｌ．ＦＡＣＬ４，ａｎｅｗｇｅｎｅｅｎｃｏｄｉｎｇｌｏｎｇ⁃ｃｈａｉｎａｃｙｌ⁃ＣｏＡｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ４，ｉｓｄｅｌｅｔｅｄｉｎａｆａｍｉｌｙｗｉｔｈＡｌｐｏｒｔｓｙｎｄｒｏｍｅ，ｅｌｌｉｐｔｏ⁃ｃｙｔｏｓｉｓ，ａｎｄｍｅｎｔａｌｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１９９８，４７（３）：３５０－３５８．［２］㊀ＷＡＴＫＩＮＳＰＡ，ＭＡＩＧＵＥＬＤ，ＪＩＡＺＺ，ｅｔａｌ．Ｅｖｉ⁃ｄｅｎｃｅｆｏｒ２６ｄｉｓｔｉｎｃｔａｃｙｌ⁃ｃｏｅｎｚｙｍｅａｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｇｅｎｅｓｉｎｔｈｅｈｕｍａｎｇｅｎｏｍｅ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＬｉｐｉｄＲｅｓｅａｒｃｈ，２００７，４８（１２）：２７３６－２７５０．［３］㊀ＳＯＵＰＥＮＥＥ，ＫＵＹＰＥＲＳＦＡ．Ｍａｍｍａｌｉａｎｌｏｎｇ⁃ｃｈａｉｎａｃｙｌ⁃ＣｏＡｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｓ［Ｊ］．ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＭｅｄｉｃｉｎｅ，２００８，２３３（５）：５０７－５２１．［４］㊀于莉莉，谭小力，侯文胜．大豆长链脂酰辅酶Ａ合成酶基因ＧｍＬＡＣＳ在酵母中的表达［Ｊ］．大豆科学，２０１１，３０（５）：７１９－７２２．［５］㊀ＷＵＭＨ，ＬＩＵＨＹ，ＣＨＥＮＷ，ｅｔａｌ．Ｈｅｐａｔｉｃｅｘｐｒｅｓ⁃ｓｉｏｎｏｆｌｏｎｇ⁃ｃｈａｉｎａｃｙｌ⁃ＣｏＡｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ３ｉｓｕｐｒｅｇｕｌａｔ⁃ｅｄｉｎｈｙｐｅｒｌｉｐｉｄｅｍｉｃｈａｍｓｔｅｒｓ［Ｊ］．Ｌｉｐｉｄｓ，２００９，４４（１１）：９８９－９９８．［６］㊀ＬＯＰＥＳ⁃ＭＡＲＱＵＥＳＭ，ＣＵＮＨＡＩ，ＲＥＩＳ⁃ＨＥＮＲ⁃ＩＱＵＥＳＭＡ，ｅｔａｌ．Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙａｎｄｈｉｓｔｏｒｙｏｆｔｈｅｌｏｎｇ⁃ｃｈａｉｎａｃｙｌ⁃ＣｏＡｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（Ａｃｓｌ）ｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｉｎｖｅｒ⁃ｔｅｂｒａｔｅｓ［Ｊ］．ＢＭＣＥｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙＢｉｏｌｏｇｙ，２０１３，１３：２７１．［７］㊀ＫＡＮＧＭＪ，ＦＵＪＩＮＯＴ，ＳＡＳＡＮＯＨ，ｅｔａｌ．Ａｎｏｖｅｌａｒａｃｈｉｄｏｎａｔｅ⁃ｐｒｅｆｅｒｒｉｎｇａｃｙｌ⁃ＣｏＡｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｉｓｐｒｅｓｅｎｔｉｎｓｔｅｒｏｉｄｏｇｅｎｉｃｃｅｌｌｓｏｆｔｈｅｒａｔａｄｒｅｎａｌ，ｏｖａｒｙ，ａｎｄｔｅｓ⁃ｔｉｓ［Ｊ］．ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉ⁃ｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａ，１９９７，９４（７）：２８８０－２８８４．［８］㊀ＬＥＷＩＮＴＭ，ＶＡＮＨＯＲＮＣＧ，ＫＲＩＳＡＮＳＳＫ，ｅｔａｌ．Ｒａｔｌｉｖｅｒａｃｙｌ⁃ＣｏＡｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ４ｉｓａｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ⁃ｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｅｉｎｌｏｃａｔｅｄｉｎｔｗｏｄｉｓｔｉｎｃｔｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｏｒｇａｎｅｌｌｅｓ，ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅｓ，ａｎｄｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ⁃ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｍｅｍｂｒａｎｅ［Ｊ］．ＡｒｃｈｉｖｅｓｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＢｉｏｐｈｙｓ⁃ｉｃｓ，２００２，４０４（２）：２６３－２７０．８４４２５期韩㊀振等：草鱼脂酰辅酶Ａ合成酶４基因全长ｃＤＮＡ分子克隆及表达调控［９］㊀ＫＯＴＲＯＮＥＮＡ，ＹＫＩ⁃ＪÄＲＶＩＮＥＮＨ，ＡＭＩＮＯＦＦＡ，ｅｔａｌ．ＧｅｎｅｔｉｃｖａｒｉａｔｉｏｎｉｎｔｈｅＡＤＩＰＯＲ２ｇｅｎｅｉｓａｓｓｏｃｉａｔ⁃ｅｄｗｉｔｈｌｉｖｅｒｆａｔｃｏｎｔｅｎｔａｎｄｉｔｓｓｕｒｒｏｇａｔｅｍａｒｋｅｒｓｉｎｔｈｒｅｅｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｏｈｏｒｔｓ［Ｊ］．ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｎ⁃ｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，２００９，１６０（４）：５９３－６０２．［１０］㊀ＱＵＩＮＬＩＶＡＮＶＨ，ＦＡＲＢＥＲＳＡ．Ｌｉｐｉｄｕｐｔａｋｅ，ｍｅ⁃ｔａｂｏｌｉｓｍ，ａｎｄｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｔｈｅｌａｒｖａｌｚｅｂｒａｆｉｓｈ［Ｊ］．ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，２０１７，８：３１９［１１］㊀ＣＨＥＮＧＨＬ，ＣＨＥＮＳ，ＸＵＪＨ，ｅｔａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏ⁃ｎｉｎｇａｎｄｎｕｔｒｉｅｎｔｒｅｇｕｌａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆｌｏｎｇｃｈａｉｎａｃ⁃ｙｌ⁃ＣｏＡｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ１ｇｅｎｅｉｎｇｒａｓｓｃａｒｐ，Ｃｔｅｎｏｐｈａｒｙｎ⁃ｇｏｄｏｎｉｄｅｌｌａＬ［Ｊ］．ＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙＰａｒｔＢ：ＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏ⁃ｇｙ，２０１７，２０４：６１－６８．［１２］㊀严媛，程汉良，许建和，等．草鱼乙酰辅酶Ａ羧化酶β基因全长ｃＤＮＡ分子克隆与表达分析［Ｊ］．动物营养学报，２０１８，３０（５）：１８２７－１８３６．［１３］㊀ＷＥＩＭＡＲＪＤ，ＤＩＲＵＳＳＯＣＣ，ＤＥＬＩＯＲ，ｅｔａｌ．Ｆｕｎｃ⁃ｔｉｏｎａｌｒｏｌｅｏｆｆａｔｔｙａｃｙｌ⁃ｃｏｅｎｚｙｍｅＡｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｉｎｔｈｅｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｍｏｖｅｍｅｎｔａｎｄａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｅｘｏｇｅｎｏｕｓｌｏｎｇ⁃ｃｈａｉｎｆａｔｔｙａｃｉｄｓ．ＡｍｉｎｏａｃｉｄｒｅｓｉｄｕｅｓｗｉｔｈｉｎｔｈｅＡＴＰ／ＡＭＰｓｉｇｎａｔｕｒｅｍｏｔｉｆｏｆＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＦａｄＤａｒｅｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｆａｔｔｙａｃｉｄｔｒａｎｓ⁃ｐｏｒｔ［Ｊ］．ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，２７７（３３）：２９３６９－２９３７６．［１４］㊀郭丽娟．野猪㊁家猪ＡＣＳＬ４基因的克隆㊁表达及多态性研究［Ｄ］．硕士学位论文．哈尔滨：东北农业大学，２００８．［１５］㊀王继文，潘志雄，吕佳，等．鹅ＡＣＳＬ４基因克隆及其与肝脂质沉积的关系研究［Ｊ］．中国畜牧杂志，２０１２，４８（５）：６－１０．［１６］㊀ＧＯＬＥＪＤＬ，ＡＳＫＡＲＩＢ，ＫＲＡＭＥＲＦ，ｅｔａｌ．Ｌｏｎｇ⁃ｃｈａｉｎａｃｙｌ⁃ＣｏＡｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ４ｍｏｄｕｌａｔｅｓｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎＥ２ｒｅｌｅａｓｅｆｒｏｍｈｕｍａｎａｒｔｅｒｉａｌｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＬｉｐｉｄＲｅｓｅａｒｃｈ，２０１１，５２（４）：７８２－７９３．［１７］㊀ＷＵＸＹ，ＬＩＹＲ，ＷＡＮＧＪＨ，ｅｔａｌ．Ｌｏｎｇｃｈａｉｎｆａｔｔｙａｃｙｌ⁃ＣｏＡｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ４ｉｓａｂｉｏｍａｒｋｅｒｆｏｒａｎｄｍｅｄｉａｔｏｒｏｆｈｏｒｍｏｎｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎｈｕｍａｎｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．ＰＬｏＳＯｎｅ，２０１３，８（１０）：ｅ７７０６０．［１８］㊀ＭＡＬＯＢＥＲＴＩＰ，ＣＡＳＴＩＬＬＡＲ，ＣＡＳＴＩＬＬＯＦ，ｅｔａｌ．Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌａｃｙｌ⁃ＣｏＡｔｈｉｏｅｓｔｅｒａｓｅⅠａｎｄａｃｙｌ⁃ＣｏＡｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ４ｉｎｈｉｂｉｔｓｈｏｒ⁃ｍｏｎｅ⁃ｉｎｄｕｃｅｄｓｔｅｒｏｉｄｏｇｅｎｅｓｉｓ［Ｊ］．ＴｈｅＦＥＢＳＪｏｕｒｎａｌ，２００５，２７２（７）：１８０４－１８１４．［１９］㊀田丽霞，刘永坚，冯健，等．不同种类淀粉对草鱼生长㊁肠系膜脂肪沉积和鱼体组成的影响［Ｊ］．水产学报，２００２，２６（３）：２４７－２５１．［２０］㊀郭文英．α－淀粉水平及不同淀粉类型对西伯利亚鲟幼鱼摄食生长和能量收支的影响［Ｄ］．硕士学位论文．石家庄：河北师范大学，２０１０．［２１］㊀叶元土，蔡春芳．鱼类营养与饲料配制［Ｍ］．北京：化学工业出版社，２０１３：１１７－１１８．［２２］㊀张宝龙．饲料中不同水平蛋白㊁糖㊁脂肪对鲤鱼生长及相关代谢调控的影响［Ｄ］．硕士学位论文．天津：天津农学院，２０１５．［２３］㊀ＬＩＮＪＨ，ＣＵＩＹＢ，ＨＵＮＧＳＳＯ，ｅｔａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｏｆｆｅｅｄ⁃ｉｎｇｓｔｒａｔｅｇｙａｎｄｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓｏｕｒｃｅｏｎｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｂｙｗｈｉｔｅｓｔｕｒｇｅｏｎ（Ａｃｉｐｅｎｓｅｒｔｒａｎｓｍｏｎｔａ⁃ｎｕｓ）ａｎｄｈｙｂｒｉｄｔｉｌａｐｉａ（ＯｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓｎｉｌｏｔｉｃｕｓˑＯ．ａｕ⁃ｒｅｕｓ）［Ｊ］．Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ，１９９７，１４８（２／３）：２０１－２１１．［２４］㊀冯姣．抗性淀粉与ＯＫＧＭ降解产物对齐口裂腹鱼营养成分及脂质代谢相关基因表达的影响［Ｄ］．硕士学位论文．雅安：四川农业大学，２０１５．［２５］㊀夏晓杰．多糖对齐口裂腹鱼肌肉品质㊁脂质代谢及ＨＳＰ７０基因表达的影响［Ｄ］．硕士学位论文．雅安：四川农业大学，２０１５．［２６］㊀田娟，涂玮，曾令兵，等．饥饿和再投喂期间尼罗罗非鱼生长㊁血清生化指标和肝胰脏生长激素㊁类胰岛素生长因子－Ⅰ和胰岛素ｍＲＮＡ表达丰度的变化［Ｊ］．水产学报，２０１２，３６（６）：９００－９０７．［２７］㊀覃川杰，邵婷，杨洁萍，等．饥饿胁迫对瓦氏黄颡鱼脂肪代谢的影响［Ｊ］．水生生物学报，２０１５，３９（１）：５８－６５．９４４２㊀动㊀物㊀营㊀养㊀学㊀报３１卷∗Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ，ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ＣＨＬ３１３９＠１６３．ｃｏｍ（责任编辑㊀菅景颖）Ｆｕｌｌ⁃ＬｅｎｇｔｈｃＤＮＡＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇａｎｄＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＡｃｙｌＣｏｅｎｚｙｍｅＡＳｙｎｔｈｅｔａｓｅ４ＧｅｎｅｉｎＧｒａｓｓＣａｒｐＨＡＮＺｈｅｎ㊀ＧＡＯＱｉ㊀ＸＵＪｉａｎｈｅ㊀ＹＩＬｅｆｅｉ㊀ＳＨＥＮＸｉｎ㊀ＤＩＮＧＺｈｕｊｉｎ㊀ＣＨＥＮＧＨａｎｌｉａｎｇ∗（ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＭａｒｉｎｅＬｉｆｅａｎｄＦｉｓｈｅｒｉｅｓ，ＨｕａｉｈａｉＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌｉａｎｙｕｎｇａｎｇ２２２００５，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅｆｕｌｌ⁃ｌｅｎｇｔｈｃＤＮＡｏｆｌｏｎｇｃｈａｉｎａｃｙｌｃｏｅｎｚｙｍｅＡｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ４（ＡＣＳＬ４）ｇｅｎｅｗａｓｃｌｏｎｅｄｆｒｏｍｇｒａｓｓｃａｒｐｂｙｒｅｖｅｒｓｅ⁃ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＰＣＲ（ＲＴ⁃ＰＣＲ）ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．ＴｉｓｓｕｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆＡＣＳＬ４ｇｅｎｅｉｎｔｈｅｂｒａｉｎ，ｈｅａｒｔ，ｓｐｌｅｅｎ，ｈｅｐａｔｏｐａｎｃｒｅａｓ，ｍｕｓｃｌｅ，ｋｉｄｎｅｙ，ａｄｉｐｏｓｅｔｉｓｓｕｅｓ，ａｎｔｅｒｉｏｒｉｎｔｅｓｔｉｎｅ，ｍｉｄ⁃ｉｎｔｅｓｔｉｎｅａｎｄｐｏｓｔｅｒｉｏｒｉｎｔｅｓｔｉｎｅｏｆｇｒａｓｓｃａｒｐｗａｓａｎａｌｙｚｅｄｂｙｒｅａｌ⁃ｔｉｍｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ，ｔｈｅＡＣＳＬ４ｇｅｎｅｅｘ⁃ｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｔｈｅｈｅｐａｔｏｐａｎｃｒｅａｓｏｆｇｒａｓｓｃａｒｐｆｅｄｗｉｔｈｄｉｅｔｓｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｔａｒｃｈｓｏｕｒｃｅｓｗａｓｓｔｕｄｉｅｄ．Ｉｎａｄ⁃ｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅＡＣＳＬ４ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｔｈｅｈｅｐａｔｏｐａｎｃｒｅａｓｏｆｇｒａｓｓｃａｒｐａｔ０，３，６，１２ａｎｄ２４ｈａｆｔｅｒｓｔａｒｖａｔｉｏｎａｎｄｒｅｆｅｅｄｉｎｇｗａｓａｌｓｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄａｓｆｏｌｌｏｗｓ：ｔｈｅｆｕｌｌ⁃ｌｅｎｇｔｈｃＤＮＡｏｆＡＣＳＬ４ｇｅｎｅｗａｓ２４１８ｂｐｗｉｔｈａ２１２１ｂｐｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ（ＯＲＦ）ｅｎｃｏｄｉｎｇ７０６ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ；ｔｈｅＡＣＳＬ４ｐｒｏｔｅｉｎｃｏｎｔａｉｎｅｄａｔｒａｎｓ⁃ｍｅｍｂｒａｎｅｄｏｍａｉｎ，ａＡＴＰ／ＡＭＰｓｉｇｎａｔｕｒｅｍｏｔｉｆａｎｄａｆａｔｔｙａｃｙｌｃｏｅｎｚｙｍｅＡｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（ＦＡＣＳ）ｓｉｇ⁃ｎａｔｕｒｅｍｏｔｉｆ．ＴｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＡＣＳＬ４ｍＲＮＡｉｎｂｒａｉｎａｎｄｓｐｌｅｅｎｗｅｒｅｈｉｇｈｅｒ，ｗｈｉｃｈｗｅｒｅｓｉｇ⁃ｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈｏｓｅｉｎｔｈｅｏｔｈｅｒｔｉｓｓｕｅｓ（Ｐ＜０．０５），ａｎｄｔｈｅｌｏｗｅｓｔｉｎｍｕｓｃｌｅ．ＴｈｅｒｅｗｅｒｅｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｏｆＡＣＳＬ４ｍＲＮＡｒｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｉｎｔｈｅｈｅｐａｔｏｐａｎｃｒｅａｓｏｆｇｒａｓｓｃａｒｐａｆｔｅｒｆｅｄｗｉｔｈｄｉｅｔｓｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｔａｒｃｈｓｏｕｒｃｅｓ（Ｐ＞０．０５）．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＡＣＳＬ４ｍＲＮＡｉｎｔｈｅｈｅｐａｔｏｐａｎｃｒｅａｓｏｆｇｒａｓｓｃａｒｐｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄａｆｔｅｒ１２ｈｏｆｓｔａｒｖａｔｉｏｎａｎｄｒｅｆｅｅｄｉｎｇ，ｗｈｉｃｈｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔａｔｔｈｅｏｔｈｅｒｔｉｍｅ（Ｐ＜０．０５），ａｎｄｔｈｅｎｉｔｒｅｔｕｒｎｅｄｔｏｉｔｓｂｅｇｉｎｎｉｎｇｌｅｖｅｌａｆｔｅｒ２４ｈｏｆｓｔａｒｖａｔｉｏｎａｎｄｒｅｆｅｅｄｉｎｇ．Ｉｎｓｕｍｍａｒｙ，ｗｅｈａｖｅｃｌｏｎｅｄｔｈｅｆｕｌｌ⁃ｌｅｎｇｔｈｃＤＮＡｏｆＡＣＳＬ４ｇｅｎｅｆｒｏｍｇｒａｓｓｃａｒｐ，ａｎｄｔｈｅｍａｉｎｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｓｉｔｅｓＡＴＰ／ＡＭＰｓｉｇｎａｔｕｒｅｍｏｔｉｆａｎｄＦＡＣＳｓｉｇｎａｔｕｒｅｍｏｔｉｆｏｆａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓａｒｅｂｏｔｈｈｉｇｈｌｙｃｏｎｓｅｒｖｅｄｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｐｅｃｉｅｓ．ＢｒａｉｎａｎｄｓｐｌｅｅｎａｒｅｔｈｅｍａｉｎＡＣＳＬ４ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｔｉｓｓｕｅｓｉｎｇｒａｓｓｃａｒｐ．Ｍｏ⁃ｒｅｏｖｅｒ，ｔｈｅＡＣＳＬ４ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｈｅｐａｔｏｐａｎｃｒｅａｓｏｆｇｒａｓｓｃａｒｐｉｓｎｏｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙａｆｆｅｃｔｅｄｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｄｉ⁃ｅｔａｒｙｓｔａｒｃｈｓｏｕｒｃｅｓ，ａｎｄｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔｒｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＡＣＳＬ４ｍＲＮＡｉｎｔｈｅｈｅｐａｔｏｐａｎｃｒｅａｓｏｆｇｒａｓｓｃａｒｐｉｓｄｅｔｅｃｔｅｄａｆｔｅｒ１２ｈｏｆｓｔａｒｖａｔｉｏｎａｎｄｒｅｆｅｅｄｉｎｇ，ａｎｄｔｈｅｎｉｔｄｅｃｒｅａｓｅｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｔｏｉｔｓｂｅｇｉｎｎｉｎｇｌｅｖｅｌ．［ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｉｍａｌＮｕｔｒｉｔｉｏｎ，２０１９，３１（５）：２４４２⁃２４５０］Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｇｒａｓｓｃａｒｐ；ｌｏｎｇｃｈａｉｎａｃｙｌｃｏｅｎｚｙｍｅＡｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ４；ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ；ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ０５４２。
体外培养及长期传代对草鱼呼肠孤病毒毒力的影响
赠， 该病毒一直存放在液氮中， 大约已传代 ２ ０代
基金项 目： 烟 台市科学发展计划（ ２ ０ ０ ７ １ ５ ２； ２ ０ １ ２ １ ４ ７ ） ； 山东省星火计划（ ２ ０ １ １ Ｓ Ｈ ０ ５ ０ １ ２ ） 作者 简介 ： 刘 晓晨 （ １ ９ ８ ７ 一） ， 女， 山东临朐人。硕士研究生 ， 主要从 事动物免疫 与病 害防治研究 。Ｅ ． ｍ ａ ｉ ｌ ： ｌ ｉ ｕ ｘ ｉ ａ ｏ ｃ ｈ ｅ ｎ ． ８ ２ ５ ＠１ ６ ３ ． ｔ ｏ ｍ。
处理 １ ｈ可 使病 毒滴 度 显 著 降低 ， 反复 冻 融 、 保 藏
红鳍 红 鳃 盖型 、 肠炎型 ， 病程 有 潜 伏 期 、 前 驱期 和 发展期 三个 阶段 ． 我 国学 者从 １ ９ ７ ８年 开始 对草 鱼 出血病 病原进 行研 究 Ｊ ， １ ９ ８ ０年在 人 工 感染 致
症 状的草鱼肾脏 组织液 ， 对健康草 鱼进 行重 复感染 ， 对其 致病 和致死率 进行统 计 ， 并用抗 草鱼 呼肠 孤病 毒 的 单 克隆抗体 ５ Ｆ １ １ 进行间接免疫荧光检测 ． 结果显示长期培养 （ ＞ ８ ｄ ） 的病毒外衣壳脱落 ， 其对草鱼 的致病及致
死 率与完整衣壳感染无显著差异 ； 传代 不同次数 （ １— ５ ０代 ） 的病毒对 草鱼的致病及 致死 率无显著 差异 ； 复染
温度和时间的不同也能引起病毒毒力降低． 并对 其基因组特性进行 了研究 ： Ｇ Ｃ Ｒ Ｖ ８ ５ ４株基 因组 由 １ １个分 段 的核酸 片段 组成 ， 总分 子量 约 为 １ ４ ． ４ ６ ｘ
１ ０ 。ｋＤａ
，
病 的草 鱼 肾组织 的超 薄 切 片 中观察 到病 毒颗 粒 ｊ ， １ ９ ８ ３年 陈燕 粲 等 对 草 鱼 出 血 病 病 毒
鱼类细胞原代培养及其Giemsa形态、MTT增殖分析、细胞计数
血细胞原代培养及其形态、增殖分析1材料1.1试剂、药品培养基配制：血清使用时临时添加，培养基为DMEM培养基添加双抗。
双抗(青霉素、链霉素)终浓度均为100μg/ml。
血清为临时添加，终浓度为20%。
巯基乙醇：根据换算0.1mM的1L溶液须0.7ul巯基乙醇。
换言之，以巯基乙醇与双蒸水按70ul：930ul比例配置为母液，每100ml培养基仅需1ul双抗：先各取0.5g溶于50ml无菌双蒸水中，此时其浓度为0.1mg/ml= 10,000μg/ml,分装入250ulEP管中，此部切记EP管架。
使用时每1ml加10μL即100μg/mL。
剩余-4°冻存。
鉴于各组分均为使用时添加，故不进行单独过滤除菌。
培养基分装于250mL试剂瓶，血清分装于50mL试剂瓶。
PBS：NaCl:8g；KCl:2g; Na2HPO4·7H2O:1.15g（如果是12水合则为1.44g）; KH2PO4:0.2g 加水定容至1L，高压灭菌。
操作中使用一次性10ml滴定管，移液器1mL，100μL。
胰酶：以PBS添加0.25%胰酶配制。
过滤除菌，此步须注射一次性过滤器0.2微米。
肝素钠：取肝素钠100mg溶于10mL生理盐水中（0.9%NaCl），以10ml离心管盛装，过滤除菌。
麻醉剂：5ml丁香酚与5ml无水乙醇混溶，冻存液：无色甘油或DMSO加入含20%FBS培养基中，终浓度为10%MTT：取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS），用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可Wright-Giemsa：取两样各0.5g，甲醇500ml，配成染液台盼蓝染色液：4%台盼蓝母液，取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml滤纸过滤，4°保存。
使用时用PBS稀释至0.4%。
1.2器材离心机1、15、50ml离心管1.5、15、50ml脱脂棉、纱布、锡箔纸血细胞计数板、细胞计数器培养容器：96孔、24孔板，一次性细胞培养瓶、一次性培养皿30、60mm、载玻片、盖玻片倒置显微镜（可拍照）细胞培养箱酒精喷壶5ml、15ml一次性注射器1000、500、250ml、100、50ml试剂瓶一次性针头过滤灭菌器0.22um2方法2.1细胞培养：此步需要1ml、100ul移液枪，无菌蓝枪头1ml，无菌黄枪头100ul，2ml灭菌EP管，EP管架，5ml注射器，封口膜，无菌纱布，酒精棉球，酒精灯，打火机，酒精喷壶，一次性培养瓶，塑料餐盒。
草鱼肝细胞脂变模型的建立及脂代谢基因表达分析
中国水产科学 2015年1月, 22(1): 24-32 Journal of Fishery Sciences of China研究论文收稿日期: 2014-05-10; 修订日期: 2014-08-10.基金项目: 国家自然科学基金项目(31172420, 31402311); 河南省基础与前沿技术研究计划项目(142300410158).作者简介: 卢荣华(1977−), 博士, 硕士生导师, 主要研究方向为鱼类糖脂代谢调控机理研究. E-mail: laoaiyika@ 通信作者: 梁旭方, 教授, 博士生导师. E-mail: xfliang@DOI: 10.3724/SP.J.1118.2015.00212草鱼肝细胞脂变模型的建立及脂代谢基因表达分析卢荣华1, 2, 梁旭方1, 孙君君2, 杨峰2, 王敏1, 李玺洋1, 白小丽11. 华中农业大学 水产学院, 湖北 武汉 430070;2. 河南师范大学 水产学院, 河南 新乡 453007摘要: 为了筛选草鱼肝细胞脂肪变性的最佳诱导剂及浓度, 并初步分析脂肪乳剂(lipid emulsions, LE)引起草鱼肝细胞脂肪变性的作用机理, 以草鱼(Ctenopharyngodon idellus )正常肝细胞为研究对象, 建立草鱼脂肪变性肝细胞模型, 以含10%胎牛血清的基础培养液为对照组, 处理组为含20%脂肪乳剂0.5~2 mL/L 和含20%、50%胎牛血清的诱导培养液, 孵育草鱼肝细胞48 h 后, 定量分析肝细胞内的甘油三酯(TG)含量, 观察脂滴积聚情况及肝细胞超微结构的变化, 检测细胞培养上清中谷丙转氨酶(alanine transaminase, ALT)、谷草转氨酶(aspartate transaminase, AST)的活性, qRT-PCR 技术检测脂代谢关键基因(PPAR α、PPAR γ、SREBP-1c 、LPL 、Lep 和UCP2)的转录水平变化, 蛋白质印迹技术检测PPAR γ、SREBP-1c 的蛋白水平变化。
原代LYCT、LYCO细胞培养
原代LYCT、LYCO细胞培养背景：鱼类细胞系在资源保护、遗传育种、疾病防治、环境污染物检测等方面具有重要的应用价值。
性腺细胞系的建立将为研究性别决定的分子调控机制以及性别相关基因的表达和功能提供合适的体外模型。
方法：采用改良Leibovitz L-15培养基，从幼鱼的卵巢和精巢中分别建立了大黄鱼卵巢细胞系（LYCO）和精巢细胞系（LYCT）。
再通过优化培养基条件以提高LYCO和LYCT的生长速度和增殖能力，包括ZETA-life 胎牛血清（FBS）浓度、不同传代比例、冻存和复苏等。
结果：采用电穿孔法成功地将pEGFP-N1和pNanog-N1转染到细胞系中，细胞的转染效率较高，表明该细胞系可用于研究外源基因和内源基因的表达。
LYCO表达卵泡细胞的标记基因Foxl 2，而LYCT表达睾丸支持细胞的标记基因Dmrt 1，且LYCO和LYCT不表达生殖细胞标志基因Vasa。
表明LYCO和LYCT 分别由卵泡细胞和睾丸支持细胞组成。
在LYCO和LYCT中分别敲低Dmrt 1和Foxl 2后，获得的细胞系可有效用于RNA介导的干扰（RNAi）实验和基因间相互作用的研究。
结论：作为第一个获得的鱼类性腺细胞系。
本研究为大黄鱼体细胞与生殖细胞的相互作用提供了一种新的模型，为大黄鱼生殖细胞的进一步研究奠定了基础。
本研究结果为今后海水鱼类性腺细胞培养的研究奠定了基础。
原文标题：Establishment and characterization of the gonadal cell lines derived from large yellow croaker (Larimichthys crocea) for gene expression studies.Doi: 10.1016/j.aquaculture.2021.737300发表文章单位：集美大学水产学院农业农村部东海海水健康养殖重点实验室文章引用：Primary culture and subcultureWhen the primary cells were fully expanded, the subculture was started with a 0.25% trypsin digestion method, and the cell culture bottle was gently turned back and forth. The trypsin was sucked out after most of the cells became round, then 3 mL of new culture medium and 2mL of old culture medium were added again. The cells were gently transferred to the new culture bottle for constant temperature culture.The FBS (Zeta-life, Australia Origin, Z7010FBS-500) concentration remained at 16.7% in the early stage of cell culture and gradually decreased to 10% FBS when the cells were passed to passage 20 (P20),and the morphology turned good. During the first 30 subcultures, the cells were split at a ratio of 1:2 every 2–3 days.结果引用:以澳洲胎牛血清FBS (Zeta-life, Australia Origin, Z7010FBS-500)血清进行的LYCO和LYCT的原代培养.A和B分别表示第2天和第5天的LYCO原代培养细胞; C和D分别表示第5天和第7天的LYCT原代培养细胞。
草鱼脂肪细胞提取与保存的研究
收稿日期:2006-09-16基金项目:西北农林科技大学/青年学术骨干支持计划0.通讯作者:吉红作者简介:刘茜,1982年生,女,河北定州人,在读研究生,主要从事动物脂肪细胞发育及分子生物学研究工作。
草鱼脂肪细胞提取与保存的研究刘 茜,吉 红,苏尚顺,杨公社(西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌 712100)摘要:无菌条件下取草鱼腹腔脂肪组织,经胶原蛋白酶消化后获取脂肪细胞,通过台盼兰染液染色测定细胞活力以及统计学的方法,对脂肪细胞提取所涉及的消化时间、钢筛规格、离心速度、离心时间等4个重要因素以及脂肪细胞提取后的保存条件进行研究。
结果表明,提取草鱼脂肪细胞的最佳条件为:消化时间30m i n 、200目钢筛过滤脂肪细胞液、离心速度为1000r /m i n 、离心时间为10m i n 。
草鱼脂肪细胞在室温(25e )下保存2d 内细胞活率在94.7%以上,而4e 下保存10m in 后活率已下降至71.1%。
关键词:草鱼;脂肪细胞;提取;保存中图分类号:S912 文献标识码:A 文章编号:1003-1278(2007)02-0007-02哺乳动物脂肪细胞体外培养及其增殖分化机理方面的研究已有较多报道[1~3]。
鱼类脂肪细胞的研究国内尚属空白,国外则已有研究者开始进行鱼类脂肪细胞体外培养模型的构建,并对其增殖分化机理及其脂质代谢规律进行了探讨,但涉及的种类主要是冷水性或热水性鱼类,温水性种类涉及的是海水鱼[4,5]。
草鱼(C tenophary ngodon idellus)作为我国特有的温水性淡水养殖种类,是全国产量最大的养殖对象之一。
当前草鱼腹腔脂肪过度蓄积问题比较严重,而利用脂肪细胞体外培养手段进行有关脂肪细胞增殖与分化机理及脂质代谢的基础研究,可为草鱼脂质调控研究解决理论问题,并提供新的研究思路,确立新的研究方法。
为了在这一领域深入开展工作,本试验对草鱼脂肪细胞的提取和保存的方法进行探讨,并对相关条件进行了优化。
实验三_鱼类原代细胞的制备与培养(组织块法)
实验三鱼类原代细胞的制备与培养（组织块法）姓名：程辉辉学号：2014308110001【实验目的】掌握贴壁细胞原代培养的方法；熟悉贴壁细胞原代培养流程【实验原理】细胞培养可分为原代培养和传代培养两种。
原代培养是直接从生物体获取和切割成微小的组织块，然后贴附于培养瓶底部，并有培养液供给营养，在合适的温度中孵育，让其慢慢地长出细胞来，以获得大量均一的细胞，为以后传代培养创造条件。
【器材、材料与试剂】（一）仪器生化培养箱，倒置显微镜，超净台，加液枪。
（二）材料培养瓶，平皿，5m L移液管，15ml、50ml离心管，纱布块，穿刺针，废液缸，手术剪镊，无菌解剖刀，75%酒精，50ml小烧杯，试验幼鱼。
酒精棉球，酒精灯，橡皮头，软管，记号笔。
（三）试剂AIM：90 mL培养液+ 5 mL GPS（10×）+5 mL两性霉素B（250μg/mL）+1 mL硫酸庆大霉素（50 mg/mL）混合，4℃保存；原代培养液：80 mL培养液+2 mL GPS (10×)+20 mL FBS+ 表皮生长因子EGF（2μg/mL）+ 成纤维生长因子FGF（25 ng/mL）混合，4℃保存；传代培养液：90 mL培养液+1 mL GPS (10×)+10 mL FBS混合，4℃保存【实验步骤】工作前打开紫外灯，消毒30分钟；入无菌室之前用肥皂洗手（或带手套），用75%的酒精擦拭消毒双手；超净台面应整洁，用75% 酒精喷洒，纱布擦净；所有试剂瓶等培养用具需用酒精擦拭后放入超净台。
将灭菌的手术器械（解剖刀2把，镊子一把，眼科镊一把，眼科剪一把）插入盛有75%酒精的玻璃小烧杯中浸泡和备用。
以下操作均在超净台里。
首先用5ml 移液管吸AIM（消毒培养液）到无菌平皿中。
1. 杀幼鱼与消毒体表：将小幼鱼置于75%酒精中，浸泡30秒。
2. 取鳔：继续用消毒纱布托住鱼体，用手术剪取鳔，并置于盛有AIM培养基的培养皿（1）内浸泡消毒，写上组织编号。
草鱼体脂性状的变异特征及相关性
关键词：草鱼；体脂性状；变异；相关分析；多元统计分析
中图分类号：S 965.112
文献标志码:A
草鱼(Cfe"c^a7y"godo" ide%)是我国重要的 大宗淡水经济鱼类，养殖产量约占国内淡水鱼 养殖总量的20%,列第1位m。近年来，草鱼养殖 户普遍采用全程投喂配合颗粒饲料的集约化精 养模式来追求经济效益。集约化养殖模式下， 草鱼生长速率快，上市时间短，但养殖过程中 通常出现营养性脂肪肝、肠系膜脂肪组织和肌 肉脂肪含量增加等体脂过度沉积问题巴造成草 鱼饲料利用率降低、肝胆综合征频发、体型短 粗、肉质不佳等诸多不良影响叫严重制约着草 鱼养殖业的健康可持续发展。
目前改善鱼体脂肪过度沉积较为宜接的方 法是采用营养调控方式，即通过合理投喂配比科学、
营养素均衡的饲料［",或在日粮中适量添加高 不饱和脂肪酸、胆碱等降脂因子来控制体脂含 量问。事实上，遗传育种是改良动物体脂沉积的 另一重要途径"1。如在畜牧业中，为了降低猪 的背膘厚度，通过遗传改良成功培育出多个瘦肉型 猪品种，猪胴体脂肪率由起初的40%降到15%~ 20%切。研究发现，鱼类的体脂性状一般表现出 中高等遗传力，显示出较大的遗传改良潜力。例 如，Tobin等研究的虹^{Oncorhynchus mykiss) 脂质性状不仅表型变异大，而且体脂重量、肌 肉和鱼体脂肪含量3个性状平均遗传力达到0.4, 同等条件下蛋白质相关性状遗传力仅有0.18o基 于此，Quillet等冋利用群体选育技术，以肌肉脂
体长(body length, BL)、体高(body height,
1.2性状的测量与计算
实验草鱼在饥饿Id后开始性状测量。外部 可量性状的测定参照国标《养殖鱼类种质检测》 第3部分内容(GB/T 18654.3—2008)[12]o草鱼肌 肉粗脂肪含量(muscle lipid content, MLC)和肝胰脏 粗脂肪含量(hepatopancreas lipid content, HLC)的测 定参考国标《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》 (GB 5009.6—2016)[13]的索式抽提法，利用 FOSS全自动索氏脂肪抽提仪完成。
草鱼成熟脂肪细胞总RNA提取方法研究
草鱼成熟脂肪细胞总RNA提取方法研究
草鱼成熟脂肪细胞总RNA提取方法研究
刘品，李超，黄吉芹，吉红
【摘要】摘要: 获得高质量的RNA是逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、Northern blot以及转录组测序(RNA-Seq)等分子生物学研究的基础，由于草鱼脂肪细胞中油脂含量较高，从中提取高质量RNA存在困难。
本研究以草鱼(Ctenopharyngodon idellus)成熟脂肪细胞为材料，通过增加离心和抽提次数等方式对传统总RNA提取方法进行优化，采用琼脂糖凝胶电泳、核酸定量分析及基因扩增等方法验证所得RNA的完整性、纯度及质量。
结果表明，经此方法提取的草鱼成熟脂肪细胞总RNA的A260 nm/A280 nm比值在1.95到2.00之间，28S 和18S条带完整，草鱼LPL和β-actin基因扩增条带清晰。
认为采用本方法获得的草鱼脂肪细胞RNA样品质量较高，能够用于后续分子生物学研究。
【期刊名称】淡水渔业
【年(卷),期】2013(043)001
【总页数】4
【关键词】关键词: RNA提取;脂肪细胞;草鱼(Ctenopharyngodon idellus) RNA提取技术不仅是分子生物学技术的重要组成部分，也是功能基因组学技术的重要基础。
从动植物组织或细胞中分离获取高质量的RNA，对后续的分子克隆和基因表达分析等试验至关重要。
已有众多研究者就从动物组织中提取RNA 的方法进行了研究［1-5］。
脂肪组织作为机体储存脂质的主要场所，还可以分泌多种细胞因子［6］，因此，脂肪组织的相关研究日趋深入，部分学者探究了脂肪组织RNA提取方法的。
草鱼前体脂肪细胞原代`传代培养及鉴定
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重庆师范大学学报 （ 自然科学版） 1 .JJK： 4 4 LLL0 5M:FN0 5:1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 第 ’% 卷
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2010年11月重庆师范大学学报(自然科学版)N ov.2010第27卷第6期Journa l o f Chongqi ng N or m a lU n i versity(N a t ura l Sc i ence)V o.l27N o.6动物科学DO I:10.3969/J.ISS N.1672-6693.2010.06.004草鱼前体脂肪细胞原代、传代培养及鉴定*曹锴,李影,蔡志华(重庆师范大学生命科学学院重庆市动物生物学重点实验室,重庆400047)摘要:建立草鱼(C tenop haryngodon idellus)前体脂肪细胞的培养体系,体外重现草鱼脂肪细胞的增殖分化过程。
实验采用油红O染色法对脂肪细胞进行鉴定;采用倒置显微镜(N I KON)和CCD对细胞进行观察摄像;选用的健康草鱼体重为800~900g;利用体外组织培养技术在温度为28e,CO2浓度为5%,血清浓度为20%,p H值为7.0~7.2的条件下,以DM E M/F12培养基对来源于草鱼腹腔的脂肪组织进行原代培养;单层的原代培养细胞达到瓶底面积的70%~80%且汇合时,对细胞进行传代培养。
研究发现在本实验条件下,培养48h后组织块周围有梭形细胞迁出;3d后细胞数量增多,多为梭形和多边形;培养8d后大部分细胞融合;细胞内脂滴可被亲脂的油红O着色,证明为脂肪细胞。
对融合后的细胞进行传代培养,可传至第4代;传代第3d可形成致密单层;第8d胞质内含有大量脂滴。
研究初步确立了较为适宜的草鱼前体脂肪细胞离体培养体系。
关键词:草鱼;脂肪细胞;原代培养;传代培养中图分类号:Q813.1文献标识码:A文章编号:1672-6693(2010)06-0020-03前体脂肪细胞是一类具有增殖和向脂肪细胞分化能力的特异化细胞,它持续存在和作用于人类和动物的一生[1]。
研究脂肪细胞增殖与分化规律,可为了解人及动物诸多脂肪代谢紊乱性疾病奠定生物学基础。
当前草鱼(C tenopharyngodon i d ellus)等腹腔脂肪过度蓄积问题比较严重,研究草鱼脂肪细胞增殖、分化过程以及与脂肪沉积有关的因素,无论是从养殖生产的经济利益角度,还是从人健康问题出发,都是一项具有现实意义和经济意义的课题。
自上世纪60年代起,国内外已成功构建了人[2](H o m o s paiens)、大鼠(Ratt u s norre g icus)[3-4]、猪(Sus scrota)[5-6]和牛(B os taurus)[7-8]的前体脂肪细胞体外培养模型,国外已研究了虹鳟(Oncor hynchus m ykiss)[9]、大西洋鲑(Sal m o s alar)[10]、红鲷(Pagrus m ajor)[11-12]、鲤鱼(Cyprinus carp io)[13]等鱼类的脂肪细胞培养,本文在对草鱼脂肪细胞的提取方法进行研究的基础上,参考哺乳动物及上述鱼类的相关研究成果和吉红[14]等利用胶原酶消化法对草鱼进行原代培养的结果,对鱼类前体脂肪细胞进行了原代与传代培养,并进行了初步鉴定,以期获得较为成熟的培养体系。
1材料与方法1.1材料试验用鱼为购自重庆市沙坪坝区超市的健康草鱼,体重800~900g。
主要试剂为:DME M/F12培养基(G I BCO);胎牛血清(杭州四季青);牛血清白蛋白(S i g m a);胰蛋白酶(Trypsi n1,GI BCO);EDTA (Am resco);PBS(武汉博士德);油红O;青霉素;链霉素;卡那霉素;苯扎溴铵等。
培养液的配制方法为:1.56g D M E M/F12,0.70g N a HCO3,20mL胎牛血清,加入各100I U/mL青、链霉素,50I U/mL卡那霉素,三蒸水定容至100mL。
不加入胎牛血清即为无血清培养液。
消化液用PBS液配制含0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA。
细菌过滤器过滤灭菌(0.45L m和0.22L m微孔滤膜),4e条件下保存。
1.2方法1.2.1原代培养将鱼在0.1%苯扎溴铵溶液内浸泡30m i n,置于酒精消毒的托盘内并用碘酒和75%酒精棉球擦拭鱼体表,超净工作台内解剖取脂肪组织。
获取的脂肪组织以PBS缓冲液(含5%BSA)冲洗2次,无血清培养液洗1次,在小烧杯中用眼科剪*收稿日期:2010-09-18修回日期:2010-10-19基金项目:国家自然科学基金(No.30800843);重庆师范大学重庆市动物学重点学科拓展研究项目(2009)作者简介:曹锴,男,硕士研究生,研究方向为细胞生物学;通讯作者:李影,E-ma i:l li y i ngcqnu@s ohu.co m剪至1mm3,弯头吸管以15块左右接种于75mL培养瓶中,置28e、5%C O2培养箱内培养,4h后加入5mL培养液。
2d后观察细胞从组织块中迁出与生长情况并显微照相,第3d更换新鲜培养液。
此后每2d 换液一次,并在倒置显微镜下进行观察、照相。
1.2.2传代培养单层培养细胞达瓶底的70%~ 80%且汇合时对细胞进行传代培养。
吸出旧培养液,沿培养瓶细胞面对侧按0.2m L/c m2加入PBS 清洗细胞。
去除清洗液,加消化液到培养瓶细胞面对侧,翻转培养瓶,在倒置显微镜下观察到胞质回缩、细胞间隙增大时终止消化,消化时间约5m i n。
倾斜培养瓶,吸出消化液,加入培养液轻轻转动培养瓶把残留消化液冲掉,再加入2mL培养液,弯头吸管轻柔吹打成细胞悬液,计数,接种到新的培养瓶中,放入CO2培养箱培养。
4h后观察细胞贴壁情况,此后每2d换液1次,并在倒置显微镜下进行观察、照相。
1.2.3油红O染色鉴定细胞生长至第8d,PBS洗3次,10%甲醛的等渗盐缓冲液固定30m in后,PBS 漂洗2次,吸取油红O工作液5mL,油红O染色8m i n,60%异丙醇分色20s,蒸馏水冲洗,在倒置显微镜下观察、照相。
2结果2.1原代培养以D M E M/F12培养基对草鱼脂肪组织块进行原代培养,2d后可见部分贴壁组织块周围出现梭形或不规则三角形细胞(封二图版1A),3d后可见大部分贴壁组织块周围出现梭形或不规则三角形细胞(封二图版1B)。
第8d梭形或不规则形细胞逐渐增多并形成局部单层汇合,部分胞内出现小脂滴(封二图版1C)。
经油红O染色的原代培养的草鱼脂肪细胞在倒置相差显微镜下观察,脂滴被亲脂的油红O着色而呈橘红色(封二图版1D),证实该细胞为脂肪细胞。
2.2传代培养传代培养的细胞接种2d即开始蓄积脂滴。
大约3d细胞增殖迅速,细胞为梭形或多边形,膜边缘清晰。
生长至第5d可见细胞普遍融合(封二图版1E),8d油红O染色显微摄影发现细胞内脂滴已聚合成单个或多个大脂滴(封二图版1F)。
2.3脂肪细胞的鉴定经油红O染色,倒置显微镜下观察,脂滴被亲脂的油红O着色而呈橘红色,可以鉴定为脂肪细胞。
其中未分化的前脂肪细胞和非脂聚积的部分不着色。
3讨论组织块培养法是一种简便易行且成功率较高的常用原代培养方法[15]。
细胞的成活率比较高,操作简单方便,与酶消化法相比接种培养简便经济,污染几率较小。
吉红[14]等对草鱼前体脂肪细胞原代培养,第3d圆形细胞开始贴壁且呈梭形、三角形等不规则形状,第5d形成局部单层汇合,部分细胞内出现小脂滴,第7d分化的细胞增多,脂滴大小不等,第9d脂滴汇合。
Anne V egusda l[10]等对大西洋鲑鱼前体脂肪细胞增殖和分化的研究,24h分离出较小的前体脂肪细胞,48h后检测到增殖活动已经开始。
继续培养发现细胞继续增长并且邻近的细胞连接在一起。
5d后培养的细胞显示一个非常长的细胞质,细胞以非常快的速度增长直到1周后融合。
11d时,大多数细胞包含大的脂质内含物。
未分化的前体脂肪细胞形态与成纤维细胞类似,细胞质中缺乏脂滴。
在前体脂肪细胞融合之前,其胞浆内什么也没有或者偶尔有少量的小的脂质内含物。
本试验在组织块接种后48h有细胞从组织块周围迁出,第3d迁出的细胞增多,第8d大多数细胞融合,部分胞内出现小脂滴。
与吉红和Anne V eg-usdal等的研究结果有所差异,这可能是由于实验所采用的鱼种的区域性和鱼种不同造成。
鱼类为变温动物,对于冷水性鱼类来说,其细胞培养的适温是4~24e;温水性鱼类则是15~ 37e[16]。
草鱼属温水性鱼类,最适生长温度在20e 左右。
大鼠前体脂肪细胞采用37e作为最佳培养温度[3-4],虹鳟前体脂肪细胞采用18e[9],大西洋鲑前体脂肪细胞采用13e[10],红鲷前体脂肪细胞采用25e[11-12],本试验离体培养的草鱼脂肪细胞在DME M/F12培养基,20%胎牛血清、28e培养条件下生长良好,这与吉红[14]等的研究一致。
本研究利用组织块法对草鱼前脂肪细胞的离体原代培养进行了初步探索,获得了较为满意的结果,并成功地将草鱼脂肪细胞传至第4代;初步确立了草鱼离体培养的较为适宜的培养条件,为今后草鱼及鲤形目鲤科雅罗鱼亚科的细胞离体培养以及相应21第6期曹锴,等:草鱼前体脂肪细胞原代、传代培养及鉴定细胞系的建立奠定了实验基础。
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