生物技术概论课后习题

1.简述一下内切酶和连接酶的作用机制。

内切酶：

类型

、

：都有甲基化，依赖于ATP，限制内切酶活性。

型酶在识别部位进行切割，很容易从底物上解离。

型酶是随机切割，识别部位不等于切割部位，能产生不同的末端。则

型和

型不同，很难形成稳定的切割末端。

类型

的特点：识别部位等于切割部位。①在DNA分子双链特异性识别部位切割产生特定的DNA序列。②两个单链断裂部位在DNA分子上的分布通常不是彼此相对的。③断裂的结果形成的DNA片段往往具有互补的单链延伸末端。

连接酶：

能够催化双链DNA片段紧靠在一起的3‘—OH末端于5’—P末端之间形成磷酸二脂键，使两末端连接。连接方法：①用DNA连接酶连接具有互补的黏性末端片段。②用T4DNA连接酶将平末端片段连接。③平末端片段加上衔接头或人工合成的连杆使之成为黏性末端后用DNA连接酶连接。

2.比较基因工程中常用的DNA聚合酶的催化活性有什么不同？

修饰酶：

⑴DNA聚合酶：①大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ（特点：a 5‘→3‘聚合酶活性b 5’→3‘外切酶活性c 3’→5‘外切酶活性）②大肠杆菌DNA聚合酶大片段（a 5’→3‘聚合酶活性b 3’→5‘外切酶活性）③T4噬菌体DNA聚合酶④T7DNA聚合酶（催化合成的DNA链比其他的长）⑤耐热DNA聚合酶（75—80℃，耐高温，用于PCR中）⑥逆转录DNA聚合酶（依赖于RNA的DNA聚合酶）⑦末端转移DNA聚合酶（将平末端修饰为黏性末端）⑵T4噬菌体多核苷酸聚合酶⑶S1核酸酶（降解双链DNA,单链RNA）⑷Bal3核酸酶（具有高度的、特异的脱氧核苷酸内切酶活性）⑸碱性磷酸酶（细菌碱性BE（DAP）去除5‘端磷酸，提高重组效率）

3.基因工程中常用载体，具有哪些性质?

(1)能在宿主细胞中进行独立和稳定的DNA自我复制。（2）易于从宿主细胞中分离并进行纯化。（3）在其DNA序列中具有适当的限制性DNA内切酶位点（最好是单一的识别位点）。（4）具有能够观察的表型特征。

4. 质粒载体的类型以及质粒DNA复制类型，他们之间的关系？

细菌质粒载体：⑴生物特性：①定义：存在于细胞质中的一种独立于染色体外，自主复制的遗传成分，游离，在特定条件下，可逆整合到染色体内②类型：接合型（是必需遗传信息，还带有一套控制细菌细胞配对和转移基因。分子量大，低拷贝，严密型。）和非接合型（是必需遗传信息，丧失了自我转移能力。分子量小，高拷贝，松弛型。）。⑵其条件：具有复制起点；带有可选择的标记；含有若干限制酶单一的识别位点；分子量小；拷贝数较高。转移能力与分子量大小以及DNA复制类型有关。

质粒DNA复制类型：一个质粒就叫拷贝数。（1）底拷贝数质粒：DNA复制是属于严紧复制控制的。（2）高拷贝数质粒：DNA复制是属于松弛性复制控制的。

5. 简述质粒、柯斯质粒和入噬菌体等的特性

入噬菌体的特性：定义：把专门感染了细菌的病毒称为噬菌体载体，由DNA 和蛋白质组成。（1）溶源：若噬菌体侵入宿主细胞后并不裂解宿主细胞，而是把自身DNA整合到宿主细胞DNA中，并随着宿主细胞分裂而增殖。（2）裂解：若噬菌体侵入宿主细胞后可以利用宿主细胞的酶以及底物合成新的噬菌体，然后破裂细胞释放出子代噬菌体并再次感染其它宿主。

柯斯质粒的特性：①含有质粒的复制起点和药物抗性基因。②含有入噬菌体的cos基因位点。③分子量较小，但是具有高容量的克隆能力。④具有于质粒同源序列的质粒进行重组的能力。

6. 基因重组的定义

利用限制性内切酶和其它一些酶类，切割和修饰载体DNA和目的基因，将两者连接起来，使目的基因插入语可以自我复制的载体内，再转入受体细胞，以期这种外源性目的基因在受体细胞内得到正确表达。

7. 载体DNA与外源基因链接的方法有哪几种？

（1）黏性末端连接法：DNA连接酶，辅助因子NAD+提供能量。

（2）平末端连接法：①同聚物加尾法：利用末端脱氧核苷酸转移酶，不直接使用T4DNA连接酶，连接效率低。②衔接物连接法：用化学方法合成的，由10~12个核苷酸组成，具有1个或数个限制性内切酶位点的平末端双链寡核苷酸片段称衔接物。③人工接头连接法：一端是平端，另一端是黏性末端，衔接物两端都是平末端。

8. 阐述外源基因导入受体细胞的途径。

⑴受体细胞：是指能够摄取外源DNA，并使其稳定扩增以及表达的细胞。

⑵不同导入原核受体细胞的方法：①转化：把以质粒为载体，构建的重组分子导入受体细胞的方法。②转导：以噬菌体或真核病毒为载体构建的重组分子导入受体细胞的方法。③三亲本杂交：将含有重组DNA分子的供体菌，被转化的受体菌含有辅助菌，在辅助菌作用下，将供体菌导入到受体菌中。

⑶不同导入真核受体细胞的方法：①导入酵母中：对酵母进行转化的两种方法：a.细胞壁在CaCL2或多聚醇作用下，细胞壁具有穿透性，允许外源基因进入。

b.用Li+盐进行处理，细胞能够允许外源基因进入。②导入植物中细胞中：主要采用致癌农杆菌制导下的以后Ti质粒为载体的，土壤杆菌诱发植物产生肿瘤进行转化的方法。③导入动物细胞中：a.物理、化学法b.生物法。

9. 组织培养的概念及其大概步骤。

植物组织培养：是指在无菌和人工控制的环境条件下，利用适当的培养基，对离体的植物器官、组织、细胞及原生质体进行培养，使其再生细胞或完整植株的技术。步骤：⑴预备阶段：①选择合适的外植体②除去病原菌及杂菌③配置适宜的培养基⑵诱导去分化阶段⑶继代增值阶段⑷生根发芽阶段⑸移栽成活阶段

10. 植物细胞培养的基本方法有哪些？

植物细胞培养：在离体条件下，将愈伤组织或其它易分散的组织接种到培养基培养使细胞增殖，从而获得大量的细胞的一种增值方式。培养方法：单细胞培养、单倍体培养、原生质体培养。

（1）单倍体培养：花粉培养。小孢子→胚状体→完整植株。（2）单细胞培养：a.制备：机械法、酶解法、愈伤组织诱导。b.方法：平板培养法、看护培养法、饲养层培养法、液体浅层静置培养法、细胞悬浮培养。（3）大规模培养：生物反应器的选择：①合适的氧传递②良好的流动性③低的剪切力。类型：机械搅拌、鼓泡、气生循环式。影响因素：⑴遗传特征：不同部位合成此生代谢产物能力不同⑵培养条件：①光照②温度③搅拌与混合④通气⑤营养盐⑥pH值⑦前提和调