细胞培养及材料细胞毒性检测 PPT课件
动物细胞培养技术ppt课件
常用的排除微生物污染的方法
抗生素排除法：采用5～10倍于常用量的冲击法，加入高浓 度抗生素后作用24～48h，再换入常规培养物，有时可能奏 效。
加温除菌：根据支原体不耐热的特点，可将受支原体污染的 细胞至于41摄氏度作用5～10h（最长可达18h），以杀灭支 原体。
动物体内接种：受污染的肿瘤细胞可接种在同种动物皮下或 腹腔内，利用动物的免疫功能消灭污染的微生物，而肿瘤细 胞却能在动物体内继续生长，待一定时间后从体内取出肿瘤 细胞进行培养
2、上皮型细胞：
名称：仅形态上似体内，实际上不完全相同
来源：来源于外胚层、内胚层细胞, 如：皮肤及其衍 生物,消化道，乳腺，肺泡, 上皮性肿瘤
形态：类似体内的上皮细胞，扁平，不规则多角形， 中有圆形核
生长特点：易相连成片，相靠—紧密相连—成薄层— 铺石状生长时呈膜状移动，很少脱离细胞群而单个 活动
3、游走细胞型：
呈散在生长，一般不连成片，胞质常 突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规 则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细 胞相区别。
4、多型细胞型：
有一些细胞，如神经细胞难以确定其 规律和稳定的形态，可统归于此类。
（二）悬浮型：
见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞。 胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容易 大量繁殖。
(二) 细胞的营养
培养基：合适的细胞培养基是体外细胞生长增 殖的最重要的条件之一，培养基不仅提供细胞 营养和促使细胞生长增殖的基础物质，而且还 提供培养细胞生长和繁殖的生存环境。
血清：血清是细胞培养液中最重要的成分之一， 含有细胞生长所需的多种生长因子及其它营养 成分 。
其它成分（条75%酒精泡2—3秒钟 （时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内）再 用碘酒消毒腹部，将鼠带入超净台内解剖取肝脏，置 平皿中。
细胞毒性实验
细胞毒性实验
细胞毒性实验是一种常用的实验方法，用于评估不同物质对细胞的毒性程度。
在药物研发、化学品评估、环境监测等领域中，细胞毒性实验起着至关重要的作用。
本文将介绍细胞毒性实验的原理、方法和应用。
原理
细胞毒性实验通过将待测物质暴露于不同类型的细胞培养物中，通过观察细胞
生长、代谢活性、细胞形态等指标的变化来评估毒性。
细胞毒性主要分为急性毒性和慢性毒性两种类型，分别用于评估物质对细胞的直接杀伤作用和潜在的长期影响。
方法
1. 细胞培养
首先需要选择适当的细胞系进行实验，常用的细胞系包括HEK293、HeLa、RAW264.7等。
细胞需在灭菌条件下培养，并保持在适宜的培养基中。
2. 暴露实验
将不同浓度的待测物质加入到细胞培养物中，设立对照组和实验组。
根据实验
需要，可以选择不同时间点进行观察。
3. 细胞存活率检测
通过MTT法、CCK-8法等方法检测细胞的存活率，进而评估毒性程度。
此外，也可以观察细胞形态的变化，如细胞凋亡、坏死等。
4. 数据统计分析
将实验结果进行统计分析，绘制图表，评估不同浓度下待测物质的毒性效应。
应用
细胞毒性实验广泛应用于药物筛选、化学品评估、环境毒性检测等领域，为评
估物质对细胞的毒性提供重要依据。
通过细胞毒性实验，可以及时发现有毒物质，减少对人类健康和环境的危害。
综上所述，细胞毒性实验是一种重要的实验方法，具有广泛的应用前景。
加强
对细胞毒性实验的研究和应用，对于促进科学研究和保护人类健康具有积极意义。
细胞生物学(电子版)PPT课件
研究对象
细胞生物学的定义与研究对象
从17世纪列文虎克发现细胞到20世纪分子生物学的兴起，细胞生物学经历了漫长的发展历程。
随着现代科学技术的进步，细胞生物学已经从描述性学科向实验性学科转变，成为生命科学领域最活跃的分支之一。
细胞生物学的发展历史与现状
与细胞的有丝分裂密切相关，形成纺锤丝并牵引染色体分离
高尔基体
溶酶体
液泡
中心体
03
CHAPTER
细胞的代谢与能量转换
包括糖酵解、糖异生和三羧酸循环等过程，是细胞获取能量的主要途径。
糖代谢
脂代谢
蛋白质代谢
代谢调控
涉及脂肪酸的合成与分解，以及胆固醇的代谢等，与细胞膜的构成和信号传导密切相关。
包括蛋白质的合成与分解，以及氨基酸的代谢等，对细胞生长和分裂至关重要。
细胞生物学的研究涉及到生命科学领域的多个前沿问题，如细胞命运决定、细胞间通讯等。
02
CHAPTER
细胞的基本结构与功能
03
细胞膜的功能
物质运输、信息传递、能量转换等
01
细胞膜的主要成分
磷脂双分子层、蛋白质、糖类等
02
细胞膜的结构特点
流动性、选择透过性
细胞膜的结构与功能
细胞质的主要成分
水、无机盐、有机物等
光合作用
在叶绿体中，通过光合作用将光能转化为化学能，并储存于ATP和NADPH中，是植物细胞特有的能量转换方式。
1
2
3
细胞通过膜受体接收外界信号分子，如激素、神经递质等，进而引发细胞内一系列生化反应。
受体介导的信号传导
包括第二信使系统、蛋白激酶级联反应等，将膜受体的信号传递至细胞核内，调控基因表达。
医学细胞生物学实验
细胞毒性实验
原理
评估化学物质、药物对细胞 的毒性影响。
技术
包括细胞存活率、细胞毒性 指标的测量方法。
应用
用于研究药物筛选、环境污 染物评估等。
细胞信号传导实验
原理
研究细胞内外信号传递 的分子机制，如细胞膜 受体激活、信号转导途 径等。
技术
包括Western blot、ELISA 等分析方法。
应用
医学细胞生物学实验
医学细胞生物学实验是研究细胞结构和功能的重要手段。本演示将介绍几种 常见的细胞实验以及它们在医学领域的应用。
细胞分离实验
1
原理
通过酶溶解组织样本中的细胞间质，使细胞分散成单个细胞。
2
应用
用于分离研究特定细胞类型，如癌细胞，干细胞等。
3
技术
包括悬浮液培养法、胶原酶消化法等。
细胞培养实验
用于研究细胞生长、分 化、细胞死亡等。
细胞分化实验
原理
研究细胞从幼稚状态到成熟 细胞的进程。
技术
包括诱导分化、干细胞培养 等方法。
应用
用于研究胚胎发育、组织再 生等。
细胞凋亡实验
原理
探究细胞凋亡的信号通 路和调控因子。
技术
包括细胞凋亡检测方法、 荧光染料等的使用。
应用
用于研究肿瘤治疗、器 官发育等领域。
细胞色素实验
Hale Waihona Puke 1原理通过染色体标记的方法研究细胞的遗传变异和突变。
2
应用
用于检测遗传性疾病、突变的发生与演化。
3
技术
常用的染色体标记方法有FISH、GISH等。
1 目的
在体外创建适宜的环境条件来培养和繁殖细胞。
2 技术
细胞生物学检测
细胞计数板
31
细胞密度＝（4个大格细胞总数/4）×104个/ml 32
注意事项：
台盘蓝染色法是一种粗略检测细胞存活的方法，
不能准确反映细胞活力差异。 含有台盘蓝的细胞悬液不宜放置时间过长，否则 正常细胞可摄取染料，影响染色结果。
33
2. 细胞生长曲线法：是测定细胞绝
对增长数值常用的最简单的方法。 方法：接种24孔细胞板，分7组，每组3孔， 每日检测1组计数，每个孔计数2次，计算3个 孔细胞密度平均值；最后将7天的数值绘成图， 即为细胞生长曲线。此法不精确，有20～30% 的误差。 细胞数量增加1倍的时间称倍增时间。
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1. 细胞一般形态
生长良好的细胞透明度大，轮廓不清，极性良好。 细胞机能不良时，轮廓增强，胞质中常出现空泡、 脂滴和其它颗粒状物。 细胞之间空隙加大、细胞形态可能变得不规则，甚 至失去原有特点。 细胞因营养缺乏、代谢物堆积、pH改变或温度变化 等时，可导致细胞中毒和结构发生变化。
20
④ 戊二醛：对组织的渗透率高，与蛋白质反
应快，能较好地保存蛋白质，对微管和膜性结构 保存也比较好，透射电镜分析时常用。 ⑤ 甲醇/醋酸固定液：甲醇：醋酸为3：1，是 应用最广的一种培养细胞固定剂，甲醇穿透力好、
易于挥发，醋酸固定蛋白效果好，且有使细胞膨
胀作用，两者结合能使细胞形态固定不变。最适
4．微生物污染
14
三、细胞一般形态学观察
• 活细胞观察：普通倒置显微镜、相差显微 镜 • 固定细胞观察法：染色后普通光学显微镜、 荧光显微镜观察；电镜观察
15
（一）固定细胞观察法
• 固定染色观察是细胞培养中常用的显示细胞形态 的技术。 • 固定细胞的目的在于把组织和细胞的原有结构尽 可能完整地保存下来，避免组织和细胞发生降解、 自溶和变形等。 • 能观察细胞的细微结构，可对细胞内的大分子物 质准确定位。 • 标本制好后可以长期保存和做长时间的观察、分 析。
医疗器械工程导论5细胞毒性评价
细胞形态学的检测方法
直接观察
光镜 电镜检测技术
• 透射电镜 • 扫描电镜
组织学染色 免疫细胞化学染色
免疫荧光染色方法 ABC免疫染色方法
细胞活力的检测方法 细胞遗传学的检测方法 有关分子生物学技术
生物学评价
直接观察
相差倒置显微镜
无需制样
体外细胞培养评价技术
细胞形态学的检测方法
直接观察
光镜 电镜检测技术
• 透射电镜 • 扫描电镜
组织学染色 免疫细胞化学染色
免疫荧光染色方法 ABC免疫染色方法
细胞活力的检测方法 细胞遗传学的检测方法 有关分子生物学技术
生物学评价
免疫细胞化学染色
将细胞培养技术与免疫学技术结合
Color Cell/Tissue
Substr. Color
P1成骨细胞(6d)免疫细胞化学染色.× 200
P1成骨细胞(6d)免疫细胞化学染色.× 40
cytotoxicity of Si-substituted HA composite
Immunofluorescence Stain
多光子激光共聚焦显微镜观察结果 正常成骨细胞（细胞骨架） HA/TCP材料表面结构
体外细胞培养评价技术
细胞形态学的检测方法
直接观察
光镜 电镜检测技术
• 透射电镜 • 扫描电镜
组织学染色 免疫细胞化学染色
免疫荧光染色方法 ABC免疫染色方法
细胞活力的检测方法 细胞遗传学的检测方法 有关分子生物学技术
生物学评价
细胞活力检测
染料 克隆（集落）形成试验 四唑盐（MTT）比色试验 Alamar Blue比色试验 碱性磷酸酶测定（ALP） 乳酸脱氢酶测定（LDH） 细胞蛋白质含量测定法 细胞蛋白质合成测定法
细胞毒性实验
细胞毒性实验细胞毒性实验是评价化学物质对细胞生长的毒性的一种常用方法。
该实验通常运用化学物质的浓度或暴露时间，评估细胞的代谢活性、细胞增殖或细胞死亡等指标来判断其毒性程度。
该实验可以通过直接在细胞培养物中加入一定浓度的化学物质，或将化学物质预处理后再加入培养物中等方式进行。
不同的实验方法，评价的指标也有所区别，例如：MTT法、WST法、细胞计数法、流式细胞术等，均可用于评价细胞毒性。
MTT法是一种基于细胞色素体代谢的细胞毒性评估方法。
该方法主要基于细胞色素氧化酶还原MTT后产生的紫色产物的数量作为评估指标。
实验中通常将化学物质加入至细胞培养物中，培养一定时间后，加入MTT试剂，并通过光学密度检测方法测定样品OD值。
在实验过程中，所测得的OD值通常可以反映出样品中细胞活力和细胞增殖的变化情况。
当化学物质的浓度或暴露时间超过一定阈值时，MTT实验结果将显示出细胞毒性效应。
细胞计数法是一种直接测定细胞数量的方法。
该方法主要基于通过细胞计数仪或显微镜直接计数样品中的细胞数量来评估毒性。
在实验中，一般需要先将细胞培养物制成单细胞悬液，再通过细胞计数仪或显微镜等工具直接观察计数。
该方法的优点是操作简单，结果直接。
但是，由于人为操作的不确定性，对实验人员的技能水平要求较高。
流式细胞术是一种结合光学和电子学技术的先进工具，可同时评估多种参数的细胞毒性评估方法。
该方法主要基于细胞表面和内部成分的特异性标记，通过激光扫描和电子检测等检测方式来捕捉和分析细胞不同部位标记物的强度和分布情况。
通过分析不同实验组的流式细胞术数据及其之间的差异，可以评价化学物质的毒性效应。
总之，细胞毒性实验是一种常用的毒性/生物活性测试方法，是评价化学物质对细胞的毒性作用非常重要的实验方法之一。
相对于动物体内实验，细胞毒性实验具有快速、简单、可重复性高、成本低等优点，并且具有高度预测性，往往可以作为快速筛选化学物质毒性的重要工具。
但是，需要注意的是，细胞毒性实验仅能反映化学物质对细胞的毒性作用，不能完全代表其在整个生物体系中的毒性效应。
细胞毒性实验报告
细胞毒性实验报告细胞毒性实验报告细胞毒性实验是一种常见的科学实验方法，用于评估化合物对细胞的毒性作用。
本实验旨在研究不同浓度的化学物质对细胞的影响，并探讨其可能的毒性机制。
实验材料与方法：1. 细胞系：本实验选择了人类肺癌细胞系A549作为研究对象。
这是一种常用的细胞系，具有较高的增殖活性和易于培养的特点。
2. 化学物质：选择了化学品A、B和C作为实验物质，分别为已知对细胞具有不同程度毒性的化合物。
3. 细胞培养：将A549细胞系培养在含有适宜营养物质和生长因子的培养基中，保持在37摄氏度、5%二氧化碳的恒温培养箱中。
4. 细胞处理：将A549细胞分成不同组，每组细胞分别加入不同浓度的化学物质A、B和C，同时设置一个对照组，不加入任何化学物质。
5. 细胞存活率检测：使用MTT法检测细胞的存活率。
MTT是一种黄色的化学试剂，它能够被活细胞内的线粒体酶还原为紫色的产物。
通过测量产物的光密度，可以反映细胞的存活率。
实验结果与讨论：经过一定时间的培养和处理后，我们观察到不同浓度的化学物质对A549细胞的影响。
通过MTT法测定细胞存活率，我们得到了以下结果：在化学物质A的处理下，细胞存活率呈现浓度依赖性的下降趋势。
随着化学物质A浓度的增加，细胞存活率逐渐降低。
这表明化学物质A对A549细胞具有明显的毒性作用。
进一步的研究发现，化学物质A可能通过抑制细胞的DNA合成和蛋白质合成来导致细胞死亡。
与化学物质A相比，化学物质B对A549细胞的毒性作用较弱。
在较低浓度下，细胞存活率相对较高，但随着浓度的增加，细胞存活率逐渐降低。
这可能是因为化学物质B对细胞的毒性作用与其浓度成正相关。
进一步的研究发现，化学物质B可能通过干扰细胞的氧化还原平衡和细胞膜的完整性来导致细胞死亡。
化学物质C对A549细胞的毒性作用相对较弱。
在较低浓度下，细胞存活率接近对照组水平，但随着浓度的增加，细胞存活率逐渐降低。
进一步的研究发现，化学物质C可能通过干扰细胞的代谢过程和细胞凋亡通路来导致细胞死亡。
细胞毒性实验
细胞毒性实验简介细胞毒性实验是一种常用的生物学实验方法，用于评估物质对生物体的细胞毒性。
通过测量物质对细胞的影响，可以判断其是否对细胞产生有害作用。
细胞毒性实验常被应用于药物研发、化学品评估以及毒性测试等领域，旨在确保物质的安全性和对生物体的可接受性。
实验步骤1. 细胞培养在进行细胞毒性实验之前，首先需要培养细胞。
选择适当的细胞系，如人类肺癌细胞株A549，将其放入细胞培养皿中，并添加培养基（常用的培养基包括DMEM、RPMI 1640等）。
将细胞培养在恒温恒湿的培养箱中，通常培养温度为37°C，CO2含量为5%。
2. 细胞处理将待测试物质加入培养基中，与细胞一同培养。
通常会设置不同浓度的待测物质组，以便研究其剂量依赖性毒性效应。
同时，还需设置一个阴性对照组（仅含培养基）和阳性对照组（含有已知毒性的物质，如阿霉素）。
3. 细胞存活率检测根据细胞系的不同，可以选择合适的方法检测细胞的存活率。
常用的方法包括MTT法、SRB法和细胞计数法等。
- MTT法MTT法是一种测定细胞代谢活性的方法。
MTT（3-(4,5-二甲基-2-噻吩基)-2,5-二苯基-2H-四唑）是一种黄色溶液，可以被活细胞中的代谢酶还原为紫色的形式。
使用MTT溶液处理细胞后，将细胞溶胀后的产物溶解，通过分光光度计测量溶液的吸光度，间接反映细胞存活率。
- SRB法SRB法是通过测量细胞中蛋白质含量来评估细胞数量的一种方法。
在SRB实验中，细胞在培养皿中固定后，使用SRB染色剂染色。
待染色剂固定后，通过溶解并测量其吸光度，可以间接反映细胞存活率。
- 细胞计数法细胞计数法是直接计数细胞数量来评估细胞存活率的方法。
将细胞用适当的缓冲溶液（如PBS）稀释后，使用血细胞计数器或显微镜进行细胞计数。
通过对细胞数量的统计，可以计算出细胞存活率。
4. 数据分析将实验得到的数据进行统计和分析。
使用适当的统计方法，比如t检验或方差分析，来判断待测物质对细胞的毒性作用是否存在显著差异。
细胞毒性的检测
实验三、细胞毒性的检测一、实验材料及设备培养箱、雷杜RT-6100酶标仪、移液器（THERMO）、枪头、吸管、96孔板、盐水、PBS、1640培养液、离心管、血球计数板、CCK-8（日本同仁）二、实验步骤1、在96孔板中配置100微升的细胞悬液。
将培养板在培养箱中预培养24小时（37℃,5% CO2）（注：贴壁细胞最小的接种量为10000个/孔，细胞数目由血球计数板中计算得来，若计数时浓度太大，可以先稀释一定倍数取融合度为90%左右的细胞，吹打均匀，取样计数一般细胞接种后贴壁大约需要2~4小时，但是不同类型的细胞所需要的时间有差异，根据实验情况而定细胞悬液一定要混匀，培养基周围容易挥发，为减少误差，建议培养板的四周只加培养基，而不作为检测孔）。
2、向培养板加入10微升不同浓度的待测物质。
在培养箱中孵化一段时间。
（6、12、24、48，时间根据OD值来选择，OD值在1.0~2.0都可以，最好在1.0附近比较好，时间根据细胞周期来定，起码要一代以上的时间）3、向每孔加入10微升CCK-8溶液，加完后轻轻敲击培养板以帮助混匀。
【注：每孔培养基体积的10%加入CCK-8，注意不要在孔中形成气泡，他们会影响OD值得读数。
如果待测物质有氧化或者还原性的话，或者细胞培养时间较长使得培养基颜色或者pH发生变化的话，可以在加CCK-8之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞俩次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。
斜贴壁加CCK-8,不要插到培养基下，容易产生气泡，干扰读数，而且速度要快，减少试剂在移液器上的残留，加后要轻轻地振荡培养板使试剂和培养基充分混合，可以将CCK-8用培养基稀释一倍，混匀后每孔加20uL使用】4、将培养板在培养箱内孵育1~4小时。
（细胞不同形成的甲臜的量也不同，如果显色不够的话，可以继续培养，以确定最佳条件建议BEL-7402 2h，）。
5、用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
细胞毒性讲义
d) 弃去原培养液，每孔加入100μL的空白对照液，阴性 对照液，阳性对照液，100％ 和50％浓度的试验样品 浸提液。每组至少设8孔。 e) 置含5％二氧化碳的二氧化碳培养箱, 在7℃±2℃温度 下进行培养。培养间期可分为24h、48h、72h。 f) 每个培养间期后,每孔加入MTT溶液20μl，置含5％二 氧化碳的二氧化碳培养, 在37℃±2℃温度下培养5小 时。 g) 弃பைடு நூலகம்孔内液体，每孔分别加入200μl DMSO，将培养 板放置10分钟，水平振摇使孔内溶液颜色均匀。 h) 用酶标仪测定吸光度，可采用双波长测定，选用的波 长可为570nm和630nm。
噻唑蓝比色法
噻唑蓝（MTT）比色法是目前应用最广泛的一种检验细胞 活性的方法 原理：线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为难 溶解的蓝色结晶Formazan
Formazan 含量
细胞活性
琥珀酸脱 氢酶活性
试验材料：细胞系
推荐使用ATCC CCL1(NCTC clone 929)[小鼠 成纤维细胞]或ATCC CCL2 (Hela)[人上皮细胞]。 如能证明试验的重现性和精确性，也可选用 其他细胞系。优先采用已建立的细胞系并应从 认可的贮源获取。 用选定的细胞系和培养基制备试验所需的细胞。 使用冻存细胞时, 如加有细胞保护剂应除去, 使 用前至少传代培养一次。
有几类细胞毒性试验方法？
GB/T 16886.5－2003/ISO 109935:1999中推荐了三类细胞毒性试验： 1） 浸提液试验 2）直接接触试验 3）间接接触试验（包括琼脂扩散试 验、滤膜扩散试验）
常用的细胞毒性试验方法
• 浸提液试验（MTT）比色法 或MTT法： 哺乳动物胞的线粒体酶可将黄绿色的MTT降 解形成蓝紫色的物质，用二甲基亚砜 （DMSO）将其溶解成溶液，用酶标仪测定 其浓度，从而定量测定细胞的存活比例。该 试验用于细胞毒性细定量评价。对该试验有 干扰的供试品不适于本试验。
CCK8检测细胞增殖毒性的原理、方法及注意事项.pptx
• 使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂； • CCK-8 法 能 快 速 检 测 ； • CCK-8 法 的 检 测 灵 敏 度 很 高 ，甚 至 可 以 测 定 较 低 细 胞 密 度 ； • CCK-8 法 的 重 复 性 优 于 MTT 法 ； • CCK-8 法 对 细 胞 毒 性 小 ； • CCK-8 细 胞 活 性 检 测 试 剂 中 为 1 瓶 溶 液 ， 毋 需 预 制 ，即 开 即 用 。 CCK8 的缺点： • 与 MTT 法 相 比 ， CCK8 和 XTT 的 价 格 比 较 贵 。 • CCK8 试 剂 的 颜 色 为 淡 红 色 ，与 含 酚 红 的 培 养 基 颜 色 接 近 ，不 注
注：
• 若 暂 时 不 测 定 OD 值 ，可 以 向 每 孔 中 加 入 10 μL 0.1M 的 HCL 溶 液 或者 1% w/v SDS 溶 液 ，并遮盖培养板避光保存在室温条件 下。 24 小时内测定，吸光度不会发生变化。
• 如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加 CCK8 之前更换新 鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新 的培养基）， 去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可 以 不 更 换 培 养 基 ，直 接 扣 除 培 养 基 中 加 入 药 物 后 的 空 白 吸 收 即 可 。
三、CCK8 检测细胞增殖/毒性的注意事项
• 当使用标准 96 孔 板时 ，贴壁 细胞 的最 小接 种量 至少 为 1,000 个 / 孔 (100 μl 培 养 基 )。检 测 白 细 胞 时 的 灵 敏 度 相 对 较 低 ，因 此 推 荐 接种量不低于 2,500 个/孔 (100 μl 培养基)。
生物医用材料PPT演示课件
个性化与定制化
随着医疗技术的发展， 临床对个性化、定制化 的生物医用材料需求越 来越高。
未来发展方向与展望
01
创新性研究
加强新材料、新技术和新工艺的研究，推动生物医用材料的创新发展。
02
交叉学科合作
加强生物医学工程、化学、物理学等多个学科的交叉合作，共同推动生
分类
根据用途可分为药物载体、医疗 器械、组织工程和再生医学材料 等。
生物医用材料的特性
生物相容性
功能性
稳定性
可加工性
材料与人体组织、血液 等相互作用时不产生有
害反应。
具备所需要的功能，如 传导热量、机械支撑等。
在体内保持稳定，不发 生降解、变质或毒性反
应。
易于加工成所需形状和 大小，以满足医疗需求。
常见的金属生物医用材料
不锈钢、钛和钛合金、钴铬合金等。
金属生物医用材料的优缺点
优点包括良好的机械性能和加工性能，缺点包括可能引发过敏反应 和金属腐蚀。
高分子生物医用材料
高分子生物医用材料的特性
01
具有良好的化学稳定性、生物相容性和加工性能，广泛用于制
造医疗用品、人工器官和药物载体等。
常见的高分子生物医用材料
氧化铝、氧化锆、生物活性玻璃和玻璃陶瓷等。
陶瓷生物医用材料的优缺点
优点包括良好的化学稳定性和生物相容性，缺点包括脆性大、加工 困难。
复合生物医用材料
复合生物医用材料的特性
通过将两种或多种材料组合在一起，发挥各自的优势，弥补单一材 料的不足，具有良好的综合性能。
常见的复合生物医用材料
聚合物/陶瓷复合材料、聚合物/高分子复合材料、金属/陶瓷复合 材料等。
细胞毒性检查法
附件细胞毒性检查法本法系将供试品或供试品液接触细胞，通过对细胞形态、增殖和抑制影响的观察，评价供试品对体外细胞的毒性作用。
试验用细胞推荐使用小鼠成纤维细胞L-929。
试验时采用传代48～72h生长旺盛的细1 相对增殖度法阴性对照液制备为不加供试品的细胞培养液。
阳性对照液制备取生物毒性阳性参比物质，照供试品制备项下的规定进行，如6.3%苯酚的细胞培养液。
检查法取33个培养瓶，分别加入4×104个/ml浓度细胞悬液1ml，细胞培养液4ml，置(37±1)℃，（5±1）%CO2的条件下培养24h。
培养24h后弃去原培养液。
阴性对照组：取13个培养瓶加入5ml阴性对照液；阳性对照组取10个培养瓶加入5ml根据各组细胞浓度按下式计算细胞相对增殖度（RGR）：100⨯=均值阴性对照组细胞浓度平组）细胞浓度平均值供试品组（或阳性对照RGR 结果评价 试验组相对增殖度（以第7天的细胞浓度计算）为0级或1级判为合格。
试验组相对增殖度为2级，应结合形态综合评价，轻微毒或无毒的判为合格。
试验组相对增殖度为3级～5级判为不合格。
2 琼脂扩散法供试品制备 将样品用纯化水冲洗干净（根据实际情况需要），用滤纸吸干。
若用供试品液进行试验，将制备的供试品液附着到生物惰性吸收性的基质﹙例如超细硼硅玻璃纤维滤纸﹚上，制成面积不少于100mm 2的圆形供试品。
阴性对照制备 取无生物毒性阴性参比物质，例如高密度聚乙烯。
按照供试品制备项下的规定进行。
阳性对照制备 取生物毒性阳性参比物质，例如含二乙基二硫代氨基甲酸锌的聚氨酯（ZDEC ）。
按照供试品制备项下的规定进行。
可采用10%二甲基亚砜(DMSO)溶液，附着到生物惰性吸收性（例如超细硼硅玻璃纤维滤纸）的基质上。
检查法取细胞悬浮液（1×105个/ml ）7ml ，均匀分散至直径60mm 的培养皿中。
置于含（5±1）%CO 2气体的细胞培养箱中培养24h 至近汇合单层细胞，弃去培养皿中培养基，将溶化琼脂冷却至48℃左右与含20%血清的2倍新鲜哺乳动物细胞培养基混合，使琼脂最终质量浓度不大于2%，在每只培养皿内加入新制备的含琼脂培养基（要足够薄以利于可沥滤物的扩散）。
细胞毒理学(2014)
研究内容
细胞毒性作用 细胞形态学观察 细胞恶性转化 细胞生物学（生长、死亡、衰老、分化） 作用机制（信号转导、细胞损伤、修复）
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体外细胞实验的优点
细胞来源充足 条件容易控制 结果重复性好 操作简便 试验周期相对较短
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细胞水平研究局限性
脱离了整体复杂的环境条件，其 生存环境和细胞之间的相互关系 都发生了改变，细胞生物学特性 也发生相应变化；
1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高； 2）PH中性或易调为中性； 3）浓度大时渗透压不大； 4）对细胞无毒。
细胞毒性的检测方法
化学物质对细胞的毒性作用，可以表现为 细胞一系列的形态、功能以及代谢上的变 化，在损伤严重的情况下，会导致细胞的 死亡。
细胞凋亡(apoptosis)和细胞坏死 (necrosis)是两种主要的细胞死亡方式， 它们的性质和生物学意义有本质上的不同。
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细胞功能
分子运输 DNA复制 增殖 蛋白质合成 细胞代谢 细胞信号传导
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细胞生物学研究技术
• 显微镜观察 • 细胞培养 • 分子生物学 • 免疫组织化学 • 生物化学
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细胞毒理学
定义：应用细胞生物学技术研究外 来有害因素作用所导致的细胞结构 上和功能上的损伤效应以及毒作用 机制的一门毒理学分支学科。
有核膜和核仁 有 复杂 微管和微丝 有丝分裂 不同时间和地点
动 物 细 胞 模 式 图
细胞膜（Cell Membranes） 细胞质（Cytoplasm） 细胞核（Nucleus）
细胞膜结构及功能
• 保护细胞 — 结构、形状 • 物质交换 — 转运物质 • 信息传递 — 如神经信号传导 • 能量交换 — 如化学能
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细胞毒实验
要对结果进行分析，写出影响结果的因素，及 注意事项。
SI
50 40 30 20 10
0 100:1
Excel 作 图
NK杀伤实验
50:1 E：T
25:1
检测方法
1.1.1 alamarBlue一步荧光测定法 alamarBlue为活细胞代谢指示剂，易溶于水，进入细胞后经线粒体
酶促还原产生荧光及颜色变化，可用以定量。本法与51Cr释放法纺织 厂较有以下特点：①特异性相当但灵敏度更高，重复性好，组内及组 间差异很小。②使用方便，无需预先标记靶细胞及离心和洗涤步骤， 适用于大批量样品的高准确性自动测定。③alamarBlue的使用浓度不 影响细胞正常代谢及基因表达，可在无菌条件下测定后继续培养扩增 细胞，有利于对培养细胞的连续监测及深入研究。④还可测定淋巴细 胞增殖或化学物质的细胞毒性及细胞凋亡。⑤多种粘附或非粘附细胞 系、细菌、真菌等可用作靶细胞，所需效应细胞数较少（3×105/孔 即可）。⑥含胎牛血清（FCS）及酚红的培养液也不干扰测定结果
抗原与抗体结合
+ 补体
台盼蓝染液
抗体依赖性细胞介导细胞毒实验 （ADCC）：
抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用是指表达IgGFc受体的 NK细胞、巨噬细胞和中性粒细胞等，通过与已结合在病毒感 染细胞和肿瘤细胞等靶细胞表面的IgG抗体的Fc段结合，而杀 伤这些靶细胞的作用，是不同效应细胞群介导的杀伤性效应机 制之一。
CCK-8法(课堂PPT)
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CCK方法的优势
实验方法
接种培养细胞
用含10％胎小牛 血清的培养液配 成单个细胞悬液 以每孔4000－ 5000个细胞接 种到96孔板
每孔100ul.培养
呈色
每孔加CCK8溶 液 20ul，孵育4 小时，终止培养 ，小心吸弃孔内 培养上清液，每 孔加150ul DMSO振荡10分 钟
8
比色
选择490nm波长 ，在酶联免疫监 测仪上测定各孔 光吸收值，记录 结果，以时间为 横坐标，吸光值 为纵坐标绘制细 胞生长曲线。
3
细胞毒性
• MTT、XTT，CCK-8：利用线粒体内部酶的活性 ，可以将特定的四唑盐类进行转化，然后通过酶 标仪进行检测。
• LDH的方法：通过检测细胞培养上清中LDH的酶 活性，来检测细胞毒性。
• 其它酶方法：如检测上清中碱性磷酸酶、酸性磷 酸酶的活性等
4
原理
• 细胞增殖能力分析试剂盒
正常细胞代谢旺盛，其线粒体内的琥珀酸脱氢酶，可将四唑盐类物质（如 MTT、XTT、WST-1等 ）还原为紫色的结晶状的物质，沉积在细胞周围 然后通过酶标仪读取OD值，从而检测到细胞增值状态
主要应用
药物药效试验
细胞筛选培养
现代 应用
10 药物毒性检测
基因工程
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Thank you !
6
CCK-8
• Cell Counting Kit简称CCK试剂盒，是一种基于 WST-8（化学名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝 苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐）的广泛 应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测 试剂盒。
• WST-8属于MTT的升级产品，工作原理为：在电 子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的脱 氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物（ formazan）。颜色的深浅与细胞的增殖成正比， 与细胞毒性成反比。使用酶标仪在450mM波长处 测定OD值，间接反映活细胞数量。
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3
1907年Harrison 和1912年 Carrel开始把组织培养作为一种 方法，用于研究离体动物细胞 的培养。
他建立的鸡胚胎成纤维细胞 持续了34年之久(1912-1946)
Alexis Carrel France Rockefeller Institute for Medical Research New York, NY, USA b. 1873 d. 1944
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2.基本概念
器官培养 (Organ culture)：将活体中整个 器官或一部分器官取出， 置于体外生存、生长并同 时保持其一定的结构和功 能特征。
组织培养 (Tissue culture)：把活体的一小 片组织（O.5～1立方毫米） 置于底物上孵育，细胞自 其周围移出并生长。
细胞培养(cell culture)： 把提取的组织用机械或消 化的方法分散成单个细胞 悬液，后进行培养，增殖。
无菌条件：净化工作室，风淋室，传递窗，高效 过滤器，洁净层流罩，生物安全柜，超净工作台， 紫外灯，电热干燥箱，滤器，高压灭菌器，抗生 素 细胞生长条件：培养板，培养瓶，CO2培养箱， 培养基，血清 细胞检测条件：倒置显微镜，酶标仪，微孔板震 荡器，高速离心机，移液器 细胞保存条件：液氮罐，超低温冰箱
培养细胞的生长和增殖过程
原代细胞：从机体取出后立即培养 的细胞
原代培养：将从体内取出的细胞进 行培养
传代培养：从原代培养细胞继续转 接培养
传代细胞：在体外培养条件下持续 传代培养的细胞
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细胞培养的工作原则
无菌 无毒、生物相容性 清洁的环境 品质良好的细胞来源，培养基配制使用高纯度药品和
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常用仪器与设备
超净工作台 高压蒸汽灭菌器 过滤除菌装置 倒置显微镜 水纯化装置 恒温培养箱 电热干燥箱 离心机、天平、水浴、摇床 液氮罐 冰箱：4℃、-20 ℃ 、-80 ℃
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细胞培养器材
移液器 移液管 吸管 培养瓶： 25cm2、75cm2、150cm2 培养皿： 30、60、120毫米 多孔培养板： 4、6、24、96孔 离心管 冻存管
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× ×
16
完全培养基的组成
基础培养基 血清 青、链霉素
80％～95％ 5％～20％
各100U／ml
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天然培养基：
培养基
血清
血浆
组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）
合成培养基： 根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法
模拟合成的。
包括四大类物质：无机盐、氨基酸、维生素、碳水化合 物
目前常用培养基：RPMI-1640、DMEM、M199、MEM、
＋＋＋
23
4.细胞培养的基本方法
贴附生长型细胞 必须贴附于
底物才能生长的 细胞。从形态上 大体分为上皮细 胞型及成纤维细 胞型，还有一些 难以确定其稳定 形态的细胞。
粘着、粘附 （attachment）
人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和 繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。
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血清的使用
常用血清 胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血
清、 马血清等
优质血清的标准 透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原
体、 病毒污染。
血清的灭活（消除补体活性） 56℃ ，30 分钟。
血清的消毒：过滤除菌 19
使用时溶入培养液中，使青、链霉素的浓度最 终为100U/ml。
庆大霉素：使用终浓度为100U/ml，广谱、稳定。
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消化液：胰蛋白酶溶液、EDTA溶液、胶原酶溶液
胰蛋白酶溶液
主要作用：
水解与赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，除去细胞间粘 蛋白及糖蛋白，使贴壁细胞从瓶壁上脱落并使细胞分离。
常用浓度：0.25%
肿瘤
胚胎
成体
粗切
消化
细切
修切
细胞培养 组织培养 器官培养
5
细胞培养的优点
活细胞 便于观察检测 条件可控 均一性 便于人工筛选
6
培养细胞与体内细胞的差异
失去原有组织结构和形态，趋向单一性 分化减弱 可能获得不死性
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体外培养细胞的生长类型
贴壁型：动物的正常细胞 悬浮型：血液淋巴细胞、肿瘤细胞、植物细胞 固定化培养
去离子水 有标准化的工作方法 培养用的液体极多，应由专人负责，配制浓度准确，
所有配好的溶液瓶上都要标明名称、浓度、消毒与否 和制备日期等 一切培养用品都要有固定的存放点，避免杂乱无章， 其中尤其重要的是：培养用品与非培养用品应严格分 开，已消毒品与未消毒品应分别存放
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3.细胞培养的基本条水 平衡盐溶液
主要由无机盐和葡萄糖配制而成 作用：维持渗透压、缓冲和调节酸碱度 常用的缓冲液：
生理盐水 PBS Hanks液 （D-Hank’s常用于配制胰酶溶液）
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抗生素溶液
通常是青霉素和链霉素联合使用，俗称“双抗 溶液”。
配制
具体操作均在超净台内完成。青霉素是80万U/瓶，用注 射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万U/瓶，加5ml灭 菌双蒸水，即每毫升各为20万U。
用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液或D-Hank’s配制，用滤 器过滤除菌。
消化时间： 用含血清培养液终止其对细胞的消化作用。
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物品 湿热 干热 过滤 紫外
培养室 工作台
＋
玻璃 制品
＋
＋
金属 器械
＋
＋
塑料 制品
橡胶 制品
＋
培养 用液
＋
＋
布类 棉类
＋
＋
化学 气体
消毒剂
电离 辐射
＋＋
＋
＋＋
＋＋＋
8
成纤维细胞样细胞
来源：由中胚层间充质组织起源的组织 如：真正的成纤维细胞 心肌，平滑肌，成骨细胞，内皮细
胞 形态：似体内成纤维细胞的形态
胞体梭形或不规则三角形 胞质向外伸出2—3个长短不等的突起 中有卵圆形核
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生长特点： 排列成放射状，漩涡状 并不紧靠连成片， 细胞—细胞接触易断开而单独行动
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细胞培养
cell culture
1
主要内容
前言 细胞培养的基本概念 细胞培养的基本条件 细胞培养的基本方法 细胞培养的污染和检测 细胞冻存和复苏 细胞管理及保藏 细胞毒性检测
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1.前言
1885年Roux最早尝试使组 织离体培养，材料是鸡胚神经 板，采用生理盐水为培养液， 并首次采用组织培养这个术语。