第十二章 荧光分析法.ppt

固定某一激发波长，测定荧光发射 强度随发射波长变化所得的光谱。
荧光强度——发射波长
萘的激发光谱及荧光和磷光的发射光谱
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荧光光谱特征
苝的苯溶液（a）和硫酸奎宁的稀硫酸溶液（b）
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吸收光谱和荧光发射光谱
荧光光谱特征
1. 斯托克斯位移 荧光发射波长总是大于激发波长的现象
2. 荧光发射光谱与激发波长无关 荧光发射光谱只有一个发射带 第一激发单重态的最低振动能级基态各振动能级
虽然n*跃迁产生的荧光较*弱，但在发生 n*跃迁时，紧接着产生体系间跨越，最后从*三 重态回到基态，产生更强的磷光。
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1. 长共轭结构
能产生荧光的物质大都含有芳香环或杂环，或是长 共轭双键的脂肪烃
共轭效应增大了荧光物质的摩尔吸收系数，有利于 产生更多的激发态分子，从而有利于荧光的产生
内部能量转换
当两电子激发态能量相差较小以致其振动能级有重 叠时，受激分子由高电子能级转移致低电子能级的 过程。
（振动失活在同样多重态间进行，如S2* S1*）
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术语
外部能量转换 激发态分子与溶剂或其它溶质碰撞，以热能的形 式释放能量的过程。
体系间跨越 处于激发态分子的电子发生自旋反转而使分子的 多重性发生变化的过程，如S1* T1*
F

K
I0
1

(
1


( 2.303ECl 1!
)

( 2.303ECl 2!
)2

( 2.303ECl 3!
)3



K
I
0

2.303
ECl


( 2.303ECl 2!
)2

( 2.303ECl 3!
)3


当ECl 0.05
F 2.3K I0 ECl KC
A. lex320nm lem 400nm C. lex350nm lem 448nm
B. lex320nm lem 360nm D. lex320nm lem 448nm
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第二节 荧光定量分析方法
一、荧光强度与物质浓度的关系
F K ( I0 I ) I I0 10 ECL F K I0 ( 1 10 ECL ) K I0 ( 1 e2.303ECL )
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荧光发射
第一激发单重态的最低振动能级
hv

基态（任一
振动能级）
发射荧光的过程约为10-9~10-7s
磷光发射
激发三重态的最低振动能级
hv

基态（任一振动
能级）
发射磷光的过程约为10-4~10s或更长
磷光法不如荧光法普遍
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分子发光
荧光、磷光和化学发光统称为分子发光 荧光和磷光是光致发光 化学发光是由于分子的外层电子在化学能的
使激发单重态分子向三重态的体系间跨越速率增
加，因而会使荧光效率降低。其它顺磁性物质也
有这种作用。
1A* + Baidu NhomakorabeaO2
( A+ .O2- )*
3A* + 3O2
氧的熄灭作用
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5. 散射光
散射 光子与物质相碰撞，使光子的运动方向发生改变而向 不同的方向散射。
瑞利散射 光子和物质分子发生弹性碰撞，只有光子运动方向发 生改变的散射光，其波长与入射光波长相同。
电子能级的多重性 M=2s+1 M=1 单重态 M=3 三重态
M=1
M=1
M=3
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2. 荧光的产生
内转换
振动弛豫 内转换
S2
系间跨越
S1
能 量
吸 收
发
射
外转换
荧
光
S0
l3
l1
l 2 l 2
T1 T2
发 射 磷 振动弛豫 光
术语
振动驰豫
激发态各振动能级的分子通过碰撞释放能量，返回 同一电子激发态的最低振动能级的过程。
苯
萘
蒽
lex 205nm
lex 286nm
lex 356nm
lem 278nm
lem 321nm
lem 404nm
0.11
0.29
0.36
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2. 分子的刚性
分子的刚性越强，荧光效率越大
联苯 ＝0.2
芴 ＝1.0
NN
OH
OH
无荧光
NN
O Al+
O
有荧光
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3. 取代基
给电子取代基常使荧光强度增大 如：-NH2、-OH、-OCH3、-NHR、-NR2、-CN等
作用下使分子处于激发态，再以无辐射驰豫 转入第一电子激发态的最低振动能级，然后 跃回基态的各个振动能级并产生光辐射。
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（二）荧光的激发光谱和发射光谱
激发光谱（形状与吸收光谱相似）
固定某一发射波长，测定该波长下 荧光发射强度随激发波长变化所得 的光谱。
荧光强度——激发波长
发射光谱（荧光光谱）
（2）溶液温度降低通常会使荧光效率 。 （3）在高浓度时荧光物质的浓度增加，荧光强度 。 （4）下列化合物中，哪种物质的荧光效率最大（ ）
A. 苯 B. 联苯 C. 萘 D. 芴 E.蒽 （5）下列说法中正确的是（ ）
荧光熄灭剂 卤素离子、重金属离子、氧分子、硝基化合
物、重氮化合物、羰基化合物等等 荧光熄灭原因
分子碰撞失去能量、生成不发光的物质、氧 的熄灭作用、自熄灭和自吸收
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M* Q M Q 碰撞熄灭 M* Q M Q* 能量转移
由于氧分子的顺磁性质，溶液中溶解氧的存在，
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二、定量分析方法
1. 校正曲线法 F—C 2. 比例法 （空白不能调零时，要扣
除空白）
3. 联立方程式法
Fs F0 Cs Fx F0 C x
Cx

Fx Fs
F0 F0
Cs
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第三节 荧光分光光度计和分析新技术
滤光片荧光计 滤光片－单色器荧光计 荧光分光光度计
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（三）荧光试剂
作用：产生强荧光性产物 1. 荧光胺 2. 邻苯二甲醛 3. 1-二甲氨基-5-氯化磺酰萘 4. 测定无机离子的荧光试剂
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三、 影响荧光强度的外部因素
1. 温度
温度升高通常会使荧光效率和荧光强度降低 乙醇 -80C =1.00 温度每增加10C ，荧光效率减小约3%
低浓度时呈现良好的线形关系
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为什么荧光分析法比紫外可见法更灵敏？
对于荧光法 F = 2.3k I0ECl FI0， I0 增强，F增大；低浓度时，FC 只要检测器灵敏，可检测微弱信号。
对于分光光度法 A = -lgT = ECl C极小时，A0，无吸收； 若C不变，改变入射光I0强度，A无变化。 所以吸收光谱受一定限制，灵敏度小于荧光光谱。
3. 荧光光谱与激发光谱的镜像关系 基态与激发态的振动能级间隔类似 激发光谱：基态激发态各振动能级 荧光光谱：激发态基态各振动能级
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二、荧光与分子结构
（一）荧光寿命和荧光效率
荧光寿命
除去激发光源后，分子 的荧光强度降低到最大 荧光强度的1/e所需的时
间，用f 表示。
以lnF0/Ft 作图，直线斜
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溶剂中杂质的荧光光谱或溶剂的拉曼光谱可 能干扰测定。
溶剂在不同波长的激发光照射下，其拉曼光 的波长随激发光波长的变化而变化，而物质 的荧光波长不变，所以可以通过选择适当的 激发波长来消除拉曼光的干扰。
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荧光法测定硫酸奎宁时，激发光波长若选择在 320nm，拉曼光波长为360nm；若激发光波长选择 在350nm，拉曼光波长为400nm。荧光波长为 448nm。则测定时选择波长应为（ D ）
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一、荧光分光光度计
1. 主要部件
源发光源（氙灯）、激发单色器、样品池、发射单色器、检测系统
荧光分光光度计结构示意图 1.光源
2、4、7、9. 狭缝 3.激发单色器
5.样品池 6.表面吸光物质 8.发射单色器 10.检测器 11.放大器 12.指示器 13.记录器
荧光分光光度计常使用的光源是（ B ）
蓝色荧光
+ H+
pH=4.8~3.4 NH2
NH3+
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蓝色荧光
无荧光
苯胺在（ C）条件下荧光强度最强 A. pH=1 B. pH=3 C. pH=10 D. pH=13
下列中能使苯胺引起荧光熄灭的是（ BD ） A. 乙醇 B. 盐酸 C. 水 D. 硫酸
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4. 荧光熄灭剂
荧光熄灭（荧光猝灭） 荧光强度降低的现象
芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多数能发 生荧光，可直接用荧光法测定。对具有致癌活性的 多环芳烃，荧光分析法已成为最主要的测定方法。
在生物化学分析、生理医学研究和临床、药物分析 领域，许多重要的分析对象，如维生素、氨基酸和 蛋白质、胺类、甾族化合物、酶和辅酶等，均可用 荧光法分析。
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二、荧光分析新技术简介
2. 仪器的校正
（1）灵敏度的校正 一定浓度的稳定荧光物质作对照品溶液调仪器 （如1ug/ml硫酸奎宁）
（2）波长校正 汞灯的标准谱线
（3）激发光谱和荧光光谱的校正 光源强度、检测器的感应度
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3. 荧光分析法的应用
（1）无机化合物的分析 采用有机试剂进行荧光分析的元素已近70多种 能够与金属离子形成荧光络合物的有机试剂绝大多数
第十二章 荧光分析法
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光致发光
物质受到光的照射时，除吸收某种波长的光还会发射出 比原来所吸收的波长更长的光的现象。
荧光
物质分子接受光子能量被激发后，从激发态的最低振动 能级返回基态时所发射的光。
分子荧光和原子荧光
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第一节 荧光分析法的基本原理
一、分子荧光 （一）分子荧光的产生 1. 分子的电子能级与激发过程
吸电子取代基常使荧光强度降低 如：-COOH、-NO、-NO2、 -SH、 RCO-等
卤素取代基随卤原子序数的增加而荧光下降
1-氯代萘 ＝0.05 1-溴代萘 ＝0.002 1-碘代萘 ＝0.000
可能是由 “重原子效应”所致。在重原子中，能级之间的 交叉现象比较严重，容易发生自旋轨道的相互作用，增加 了体系间跨越的速度。
是芳香族化合物。（分子刚性平面结构增大） 另一类络合物是三元离子缔合物。
例：罗丹明B为阳离子荧光染料，Au3+、Ga3+、Tl3+等 阳离子首先与卤素离子形成二元络阴离子，再与罗丹 明B缔合形成荧光化合物。 荧光猝灭法也是常采用的方法。
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（2）有机化合物的分析
脂肪族有机化合物本身能发荧光的很少，需要与某 些试剂反应后才能进行荧光分析
A. 空心阴极灯 B. 氙灯 C. 氢灯 D. 硅碳棒
在测量分子荧光强度时，要在与入射光成直角的方
向上进行测量，这是由于（E ）
A. 只有在入射光线成直角的方向上才有荧光 B. 荧光强度比透射光强度小 C. 荧光强度比透射光强度大 D. 荧光波长比透射光波长长 E. 荧光是向各个方向发射的，为了减小透射光的影响
率即为1/ f。
Ft F0e Kt F 荧光强度 K 衰减常数
F f F0 / e F0e K f
1 / e eK f
K 1 1
K 1
f
F0 / Ft e Kt e t / f
ln F0 t
Ft f
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荧光效率
发射荧光的光子数
f 吸收激发光的光子数
1. 激光荧光分析 激光作光源；超低浓度分析
2. 时间分辩荧光分析 利用不同物质的荧光寿命不同，在激发和检 测之间延缓的时间不同来实现分别检测。
3. 同步荧光分析 4. 胶束增敏荧光分析
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（1）关于荧光光谱和激发光谱，叙述错误的是（ ） A. 荧光光谱的形状与激发光的波长无关 B. 荧光光谱和激发光谱一般是对称镜像关系 C. 荧光光谱是分子的吸收光谱 D. 荧光激发光谱和紫外吸收光谱的形状相似
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2. 溶剂
一般地，随极性溶剂的增加，荧光波长长移， 荧光强度增强。 奎宁在苯、乙醇和水中的荧光效率的相对大小 为1、30、1000。
溶剂粘度减小，分子碰撞机会增加，荧光减弱。
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3. 酸度
每一种荧光物质都有其最适宜的pH范围
SO3-
- H+
SO
3
pH=6.4~7.4 OH
O-
无荧光
拉曼散射 光子和物质分子发生非弹性碰撞，光子运动方向发生 改变的同时，光子与物质发生能量交换，发射出比入 射光更长或更短的散射光。
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如何区别荧光、磷光、瑞利光和拉曼光？ 波长320nm的入射光激发硫酸奎宁的稀硫
酸溶液时，将产生320nm的（ C ） A. 荧光 B. 磷光 C. 瑞利光 D. 拉曼光
物质的荧光效率在0～1之间，0.1～1时有分析价值。
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（二）有机化合物分子结构与荧光的关系
物质发射荧光的两个条件： 强的紫外吸收、 一定的荧光效率 一般地，大多数荧光物质受到激发后，首先经历
*或n*跃迁，经过振动驰豫或其它无辐射跃 迁，再发生*或*n跃迁，产生荧光。
由于*比n*跃迁的强度更大，寿命更短， 因此*常能产生较强的荧光。