离子交换层析的基本操作
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离子交换层析是以离子交换剂为固定相，以特定的含离子溶液为流动相，利 用离子交换剂对待分离的各种离子结合力的差异，而将混合物进行分离的层析技 术。
离子交换介质的基本性质
离子交换剂的基本性 能 离子交换剂亦称离子交换介质，通常是一种不溶性高分子化合物
如树脂，纤维素，葡聚糖，醇脂糖等； 离子交换剂中所含的可解离基团在水溶液中能与溶液中的其它阳离子或阴离 子起交换作用
离子交换纤维素：
离子交换纤维素是携带功能基团纤维素衍生物，具有松散的亲水 性网状结构以及较大的表面积，大分子可以自由通过，因而对生物大 分子（如蛋白质）的交换容量比离子交换树脂大
阳离子型离子交换纤维素包括羟甲基纤维素（CM纤维素）等
阴离子型离子交换纤维素包括二乙基氨基乙基纤维素（DEAE纤 维素）
不同蛋白质与离子交换剂之间形成离子键数目不同，即亲和力大 小有差异，因此只要选择适当的洗脱条件便可将混合物中的成分逐个 洗脱下来，达到分离纯化的目的
离子交换剂的分 类
阳离子交换剂：强酸型和弱酸型
阴离子交换剂：强碱型和弱碱型
阳离子交换剂 分为强酸型、中强酸型和弱酸型三类，强酸型含有－R－SO3H，中 强酸型含有－PO3H2、－PO2H2或－O－PO2H2，弱酸型含有－COOH 或－OH。 阳离子交换进行的反应如下：
具有硬度大、性质稳定，流速好，分离能力强等优点
尤其是介质受pH和离子强度的影响所引起的膨胀和收缩效应较小，因
此具有稳定的外形体积
离子交换介质的选择原则
一般而言： 酸性物质用阴离子交换剂分离 碱性物质用阳离子交换剂分离 氨基酸、核苷酸、蛋白质等两性电解质，可根据其pI值及离子化 曲线来选择
对pI=5的某酸性蛋白质 当蛋白质为阴离子时， 在pH5.5-9.0的范围内， 应首选DEAE纤维素； 当蛋白质为阳离子时， 在pH3.5-4.5的范围内，
常用的离子交换葡聚糖包括： 阳离子交换剂 CM-Sephadex C-25，CM-Sephadex C-50
阴离子交换剂
DEAE-Sephadex A-25，DEAE-Sephadex A-50 QAE-Sephadex A-25，QAE-Sephadex A-50
离子交换琼脂糖：
离子交换琼脂糖是携带DEAE或CM基团的Sepharose CL-6B
阴离子交换剂 分为强碱型、中强碱型和弱碱型三类，含有四级铵盐 [ －N+(CH3)3] 为强碱型，三级以下铵盐 [－N(CH3)2]、[ －NHCH3]、[ －NH2] 都属 弱碱型；同时具有强碱和弱碱型基团的，为中强碱型。 阴离子交换树脂进行的反应如下：
强离子交换剂的电离率基本不受pH值影响，离子交换作用的pH范围宽 弱离子交换剂的电离率受pH影响很大，离子交换作用的pH范围小 弱酸性阳离子交换剂在pH值降低时，其电离率逐渐降低，离子 交换能力逐渐减弱
第八章 外源基因表达产物的分离纯化
一 重组蛋白分离纯化方法选择的基本原则 二 常用的分离方法 三 基因重组蛋白包涵体的分离和复性 四 重组蛋白质的鉴定
一、 重组蛋白分离纯化方法பைடு நூலகம்择的基本原则
针对不同的产物表达形式采取不同的策略
针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型
多种分离纯化技术的联合运用
合适分离纯化介质的选择
理想的分离纯化介质应具有下列性质：
对目标蛋白具有较高的分离效率
对目标蛋白不会造成变性
化学性能和机械性能稳定，重复性好
价格低廉
• Sephadex 是由葡聚糖通过环氧氯丙烷交联 形成的三维网状凝胶颗粒 • Superose是在珠状琼脂糖颗粒的基础上经 过两次交联后得到的
5. 分离纯化过程的规模化
蛋白质分离纯化的实验室工艺、技术、方法在大规模产业化过程未必合适， 如：
离子交换葡聚糖： 离子交换葡聚糖是葡聚糖经环氧氯丙烷交联后形成的具有多孔三 维空间网状结构并带有离子交换功能基团。 Sephadex的优点如下： 亲水性强、不会引起生物分子的变性和失活，母链对蛋白质、核 酸及其它生物分子的非特异性吸附能力小 电离基团在母体上取代程度高，交换容量大，装柱方便，流速快 既有离子交换作用，又有分子筛效应 因而Sephadex是一类广泛应用的色谱分离介质
实验室方法在工程上可能难以实现（超声波破细胞壁）
实验室方法在大规模生产中可能成本过高（超速离心）
因此，在很多情况下，实验室的技术路线不等于生产工艺。
二、常用的分离方法
1. 离子交换层析
离子交换层析的基本原
理 离子交换介质的基本性 质 离子交换介质的选择原
则 离子交换层析的基本操 作
离子交换层析的基本原理
弱碱性阴离子交换剂在pH值升高时，其电离率逐渐降低，离子
交换能力逐渐减弱
常用的离子交换 剂
离子交换树脂： 最常见的离子交换树脂是含有酸性或碱性基团的人工合成的聚苯 乙烯-二乙烯苯不溶性高分子化合物 离子交换树脂的优点是：流速快，对小分子物质的交换容量大， 因而适合用于氨基酸、核苷酸等小分子生化物质的分离纯化
2. 针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类
等电点处于极端区域（pI≤5 或 pI≥8）的重组蛋白应首选离子交换法进行分 离，这样很容易除去几乎所有的杂蛋白；
型
重组蛋白特异性的配体、底物、抗体、糖链等都是首选亲合层析
疏水层析和反相层析是根据蛋白质的疏水性差异进行分离的； 凝胶过滤层析是根据蛋白的分子量和体积差异进行分离的；
3. 多种分离纯化技术的联合运用
在选择分离纯化方法时应遵循下列原则：
应选择不同分离纯化机理的方法联合使用 应首先选择能除去含量最多杂质的方法 应尽量选择高效的分离方法 应将最费时、成本最高的分离纯化方法安排在最后阶段
4. 合适分离纯化介质的选择
常用的蛋白质分离纯化介质有Sephadex和Superose。
分离纯化过程的规模化
1. 针对不同的产物表达形式采取不同的策略
采用分泌型战略表达重组蛋白，通常体积大、浓度低，因此应在纯化之前采用 沉淀或超滤等方法先进行浓缩处理；
采用包涵体型战略表达重组蛋白，应先离心回收包涵体；
采用融合型战略表达重组蛋白，一般是胞内可溶性的，拟首先选用亲和层析 进行纯化
表达在细胞膜和细胞壁之间的间隙中的蛋白质，应用低浓度的溶菌酶处理，然 后再用渗透压休克法释放重组蛋白。
离子交换介质的基本性质
离子交换剂的基本性 能 离子交换剂亦称离子交换介质，通常是一种不溶性高分子化合物
如树脂，纤维素，葡聚糖，醇脂糖等； 离子交换剂中所含的可解离基团在水溶液中能与溶液中的其它阳离子或阴离 子起交换作用
离子交换纤维素：
离子交换纤维素是携带功能基团纤维素衍生物，具有松散的亲水 性网状结构以及较大的表面积，大分子可以自由通过，因而对生物大 分子（如蛋白质）的交换容量比离子交换树脂大
阳离子型离子交换纤维素包括羟甲基纤维素（CM纤维素）等
阴离子型离子交换纤维素包括二乙基氨基乙基纤维素（DEAE纤 维素）
不同蛋白质与离子交换剂之间形成离子键数目不同，即亲和力大 小有差异，因此只要选择适当的洗脱条件便可将混合物中的成分逐个 洗脱下来，达到分离纯化的目的
离子交换剂的分 类
阳离子交换剂：强酸型和弱酸型
阴离子交换剂：强碱型和弱碱型
阳离子交换剂 分为强酸型、中强酸型和弱酸型三类，强酸型含有－R－SO3H，中 强酸型含有－PO3H2、－PO2H2或－O－PO2H2，弱酸型含有－COOH 或－OH。 阳离子交换进行的反应如下：
具有硬度大、性质稳定，流速好，分离能力强等优点
尤其是介质受pH和离子强度的影响所引起的膨胀和收缩效应较小，因
此具有稳定的外形体积
离子交换介质的选择原则
一般而言： 酸性物质用阴离子交换剂分离 碱性物质用阳离子交换剂分离 氨基酸、核苷酸、蛋白质等两性电解质，可根据其pI值及离子化 曲线来选择
对pI=5的某酸性蛋白质 当蛋白质为阴离子时， 在pH5.5-9.0的范围内， 应首选DEAE纤维素； 当蛋白质为阳离子时， 在pH3.5-4.5的范围内，
常用的离子交换葡聚糖包括： 阳离子交换剂 CM-Sephadex C-25，CM-Sephadex C-50
阴离子交换剂
DEAE-Sephadex A-25，DEAE-Sephadex A-50 QAE-Sephadex A-25，QAE-Sephadex A-50
离子交换琼脂糖：
离子交换琼脂糖是携带DEAE或CM基团的Sepharose CL-6B
阴离子交换剂 分为强碱型、中强碱型和弱碱型三类，含有四级铵盐 [ －N+(CH3)3] 为强碱型，三级以下铵盐 [－N(CH3)2]、[ －NHCH3]、[ －NH2] 都属 弱碱型；同时具有强碱和弱碱型基团的，为中强碱型。 阴离子交换树脂进行的反应如下：
强离子交换剂的电离率基本不受pH值影响，离子交换作用的pH范围宽 弱离子交换剂的电离率受pH影响很大，离子交换作用的pH范围小 弱酸性阳离子交换剂在pH值降低时，其电离率逐渐降低，离子 交换能力逐渐减弱
第八章 外源基因表达产物的分离纯化
一 重组蛋白分离纯化方法选择的基本原则 二 常用的分离方法 三 基因重组蛋白包涵体的分离和复性 四 重组蛋白质的鉴定
一、 重组蛋白分离纯化方法பைடு நூலகம்择的基本原则
针对不同的产物表达形式采取不同的策略
针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型
多种分离纯化技术的联合运用
合适分离纯化介质的选择
理想的分离纯化介质应具有下列性质：
对目标蛋白具有较高的分离效率
对目标蛋白不会造成变性
化学性能和机械性能稳定，重复性好
价格低廉
• Sephadex 是由葡聚糖通过环氧氯丙烷交联 形成的三维网状凝胶颗粒 • Superose是在珠状琼脂糖颗粒的基础上经 过两次交联后得到的
5. 分离纯化过程的规模化
蛋白质分离纯化的实验室工艺、技术、方法在大规模产业化过程未必合适， 如：
离子交换葡聚糖： 离子交换葡聚糖是葡聚糖经环氧氯丙烷交联后形成的具有多孔三 维空间网状结构并带有离子交换功能基团。 Sephadex的优点如下： 亲水性强、不会引起生物分子的变性和失活，母链对蛋白质、核 酸及其它生物分子的非特异性吸附能力小 电离基团在母体上取代程度高，交换容量大，装柱方便，流速快 既有离子交换作用，又有分子筛效应 因而Sephadex是一类广泛应用的色谱分离介质
实验室方法在工程上可能难以实现（超声波破细胞壁）
实验室方法在大规模生产中可能成本过高（超速离心）
因此，在很多情况下，实验室的技术路线不等于生产工艺。
二、常用的分离方法
1. 离子交换层析
离子交换层析的基本原
理 离子交换介质的基本性 质 离子交换介质的选择原
则 离子交换层析的基本操 作
离子交换层析的基本原理
弱碱性阴离子交换剂在pH值升高时，其电离率逐渐降低，离子
交换能力逐渐减弱
常用的离子交换 剂
离子交换树脂： 最常见的离子交换树脂是含有酸性或碱性基团的人工合成的聚苯 乙烯-二乙烯苯不溶性高分子化合物 离子交换树脂的优点是：流速快，对小分子物质的交换容量大， 因而适合用于氨基酸、核苷酸等小分子生化物质的分离纯化
2. 针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类
等电点处于极端区域（pI≤5 或 pI≥8）的重组蛋白应首选离子交换法进行分 离，这样很容易除去几乎所有的杂蛋白；
型
重组蛋白特异性的配体、底物、抗体、糖链等都是首选亲合层析
疏水层析和反相层析是根据蛋白质的疏水性差异进行分离的； 凝胶过滤层析是根据蛋白的分子量和体积差异进行分离的；
3. 多种分离纯化技术的联合运用
在选择分离纯化方法时应遵循下列原则：
应选择不同分离纯化机理的方法联合使用 应首先选择能除去含量最多杂质的方法 应尽量选择高效的分离方法 应将最费时、成本最高的分离纯化方法安排在最后阶段
4. 合适分离纯化介质的选择
常用的蛋白质分离纯化介质有Sephadex和Superose。
分离纯化过程的规模化
1. 针对不同的产物表达形式采取不同的策略
采用分泌型战略表达重组蛋白，通常体积大、浓度低，因此应在纯化之前采用 沉淀或超滤等方法先进行浓缩处理；
采用包涵体型战略表达重组蛋白，应先离心回收包涵体；
采用融合型战略表达重组蛋白，一般是胞内可溶性的，拟首先选用亲和层析 进行纯化
表达在细胞膜和细胞壁之间的间隙中的蛋白质，应用低浓度的溶菌酶处理，然 后再用渗透压休克法释放重组蛋白。