微生物之微生物多样性分析-DGGE

变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）

普通的聚丙烯酰胺凝胶电泳只能通过片段大小不同在同一浓度的胶上电泳迁移率不同而分离不同的DNA片段，对于片段大小接近或相同的DNA片段无法做到有效地分离；DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis) 即变性梯度凝胶电泳，是利用DNA在不同浓度的变性剂中解链行为的不同而导致电泳迁移率发生变化，从而将片段大小相同而碱基组成不同的DNA片段分开。

DGGE作为一种成熟的分子生物学技术被广泛应用于环境科学（土壤、海洋、河流、冰川、淤泥等）、医学（各种疾病治疗前后，病变部位微生物的差异）、人体（鼻咽、口腔、黏膜、肠道）等领域进行微生物多样性分析。

实验流程图：

实验结果

实验结果包括以下内容

1 引物设计

以下是DGGE中常用的引物，我们将根据客户的不同需求，进行针对性的引物设计。

引物序列（5’-3’）

细菌 16S V3

区扩

增引物

357-F-GC CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGG GCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG

518r ATTACCGCGGCTGCTGG

引物 序列（5’-3’）

真核 18S V1-3区扩增引物

Euk1A CTGGTTGATCCTGCCAG

EukA516r-GC

CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCA CGGGGGGACCAGACTTGCCCTCC

2 基因组DNA 抽提电泳检测图

针对客户的样本来源不同，我们针对性优化不同的基因组抽提方法，已达到提取效果最佳。

说明：1-8为样本所抽提基因组DNA，上样量3uL；M 为1kb Marker 上数第一条带为8 kb，中间的亮带为3kb，浓度为30ng/uL，其余为10 ng/uL。

3 目的片段PCR 检测

说明：1-8为样本，负为负对照（说明我们的实验没有污染，这对分子实验是至关重要的），上样量为5uL；M 为DL2000 Marker，上样量3uL。其中亮带为20ng/uL，其余为10 ng/uL。 Reconditioning PCR：

第一轮PCR 产物将会作为新的模板再进行少数循环的第二轮PCR 扩增，这叫做“Reconditioning PCR”。由于在“ Reconditioning PCR”的过程中引物和模板之

间的比例始终保持在较高的水平上，因此可以保证引物与模板之间的退火要优先于不同模板之间的退火，消除异源双链（Heteroduplex）污染对于PCR-DGGE图谱的观察和分析。

参考文献：

(1)Heteroduplexes in mixed-template amplifications: formation, consequence and elimination by “reconditioning PCR”. 2002. Nucleic Acids Research.

(2)不同外源扰动因素对肠道菌群组成结构影响的研究. 上海交通大学 2008 届博士学位论文.

4 DGGE图谱分析

4.1 DGGE胶图和条形图

4.2 戴斯相似性系数

4.3微生物多样性指数

4.4 UPGAM法进行样品间的聚类分析图

常见聚类分析方法有Neighbor Joining、single linkage、complete linkage、upgama、wpgama、centroid、median、ward’s

4.5微生物群落的多维定标分析

4.6 主成分分析（PCA, Principal Component Analysis）

4.7 冗余分析（RDA, Redundancy Analysis）

5 主要胶条进行割胶

6 割胶条带的DNA回收、二扩及TA克隆

6.1 二扩电泳检测

分别取5 μL PCR产物，于1%琼脂糖凝胶电泳检测。琼脂糖凝胶电泳检测结果如下图所示

电泳检测结果显示：PCR产物条带单一，片段大小正确，可进行胶回收。

6.2 胶回收

采用AXYGEN 公司的 AxyPrepDNA 凝胶回收试剂盒回收 PCR 产物，取3 μL回收产物进行电泳检测。

6.3 TA连接及转化

PCR产物的克隆使用 BioLinker的pED-T载体试剂盒。

6.4 阳性克隆的筛选及测序

在平板上随机挑取8个克隆摇菌，菌液进行M13检测，挑取3个阳性克隆进行测序。

7 测序结果汇总

7.1 fasta文件

全部测序结果进行整理，去除载体序列，将其整理为fasta格式的序列文件，为后

续分析做准备。

7.2克隆子一致性分析（Alignment比对）

一般每个条带送三个克隆子进行测序，那么三个克隆子所测序列的一致性如何，

我们通过clonemanager软件进行序列性的分析，如果克隆子的测序结果完全一致，

那么会以绿色的覆盖形式表示，若是序列不一致，会是白色区域。如下图所示：

7.3测序结果NCBI的Blast比对汇总表

条带克隆子菌株名称GenBank序最大相似条带占比

编号

编号 列号 度（%） （%）

1 3 Winogradskyella ulvae strain KMM 6390

NR_109172.1 91 67 7

Polaribacter irgensii strain 23-P

NR_044733.1 99 33 2 4 Cyanothece sp. ATCC 51142 strain ATCC 51142

NR_074316.1 93 33 5 Clostridium populeti strain 743A

NR_026103.1 99 33 7

Candidatus Pelagibacter ubique HTCC1062 strain

HTCC1062

NR_074224.1

100

33

3 3 Paraprevotella clara YIT 11840 NR_041626.1 100 67 8

Flavobacterium limicola strain ST-82 NR_024787.1 97 33 4 1

Bacteroides vulgatus ATCC 8482 strain ATCC

8482

NR_074515.1

100

100

5 1 Bacteroides fragilis YCH4

6 strain YCH46 NR_074839.1 99 100 6 1 Bacteroides gallinarum strain JCM 13658 NR_041448.1 98 100 7

1

Megamonas rupellensis strain FM1025

NR_044473.1

97

100

7.4测序结果的系统发育树分析

DGGE 技术的优缺点