pET-22b(+)大肠杆菌表达载体说明
重组蛋白的表达系统(详细版)
终止子：转录终止子按照是否依赖和不依赖ρ因子的作用分为两类，这两类终止子均在终止点前含有一段7-20bp的回文序列。终止子可以保护mRNA在核外不被降解，显著延长mRNA的寿命，由此提高重组蛋白的表达量。但是对于T7系统来说，由于T7 RNA聚合酶效率极高，宿主中随时都有充足的mRNA以供翻译，因此大部分在T7系统中表达的重组蛋白并不在意质粒上是否有终止子，只有一些自身带有翻译起始信号的外源基因需要终止子。启动子受细胞类型的限制，在不同的细胞系中有很大不同，因此需根据宿主细胞（尤其是真核宿主）的类型选择不同的启动子以便于目的基因的高效表达。
表4：常用原核表达载体质粒
1.3 优化表达条件
重组蛋白的表达流程很少有一次成形的，为了提高蛋白表达量、改善蛋白质量，表达条件和白不表达时：
2
如果重组蛋白不表达（包含体和可溶蛋白都没有），首先检查cDNA和质粒是否正确，蛋白对宿主菌是否有很大毒性，然后尝试更换菌株、质粒载体和融合标签。原核蛋白在大肠杆菌中不能表达的情况很少见，通常是真核蛋白不能表达。不能表达的重组蛋白，即使在更换了宿主、载体后可以表达，表达量也不会很高，如果需要大规模生产，最好尝试酵母和昆虫细胞表达系统。
融合标签：融合标签是与目的蛋白共表达的一段多肽，方便重组蛋白的纯化、固定和检测，表3给出了常用的重组标签。如果不需要对重组蛋白进行纯化，尽量不要引入融合标签，以免影响蛋白性质；如果重组蛋白本身能够结合某种亲和柱，如某些金属结合蛋白可以结合Ni-NTA，某些糖结合蛋白能够特异识别糖类，也不必引入标签。融合标签的引入能够大大简化重组蛋白的纯化流程，并提高蛋白溶解度。商业化表达质粒，如pET、pGEX等提供了各种纯化标签和融合蛋白供选，应根据蛋白具体情况进行选择。His-tag是最常用的纯化标签，它具有很多优点：标签较短（10-20个氨基酸残基），不带电（pH8.0），免疫原性差，通常不影响重组蛋白的结构和功能，Ni2+亲和力高，能够通过一步纯化达到60%-90%的纯度。如果蛋白质溶解度不高，导致折叠困难、表达量低，可以选择较大的融合标签（GST、MBP、Trx等）帮助重组蛋白表达和折叠，提高重组蛋白溶解度，从而提高表达量。较大的融合标签有时也会导致翻译困难甚至提前中止，纯化后发现大部分都是标签蛋白也是常见现象。翻译的提前中止会大大影响重组蛋白产率和后续纯化，所以在短标签能够达到目的的时候，尽量不要选择大的融合标签。标签位置的选择也很重要：N端标签（短的或长的）自身带有启动子和适应宿主偏好的密码子，可以帮助目的蛋白表达，提高表达量，但是提前中止翻译的蛋白片段也会被一并纯化出来，降低重组蛋白纯度，对蛋白酶敏感的、自身容易降解的以及一级序列中有集中的疏水残基区的蛋白尤其要避免使用N端标签；C端标签则可以保证只有完整蛋白得到纯化。另外，如果蛋白的近N端或近C端有重要功能区，如酶活中心、配体结合位点、二硫键、多聚体稳定界面、相互作用界面等，则要避免纯化标签位于该末端，以免影响重组蛋白的结构和功能。如果融合标签对蛋白性质有较大影响，但又是纯化所必须的，就可以考虑在纯化过程中去除标签。主要有三种方法：化学裂解，如溴化氰（CNBr）、羟胺（NH2OH）等，能够简单有效地去除标签，但反应条件苛刻（羟胺需要在pH9.0下反应），特异性较差，而且会引入不必要的修饰，除包含体蛋白的处理外已经很少使用了；酶解，如PPase等，其底物一般是一段比较长的肽链，特异性强，是目前比较常用的方法，缺点是酶切反应需要较长的时间，也增加了蛋白纯化的步骤，使纯化变得繁琐；IMPACT质粒，该质粒在纯化标签和目的蛋白之间插入了一个蛋白质内含子（intein），intein具有可诱导的自切割活性，使用IMPACT质粒表达的重组蛋白，只需要改变缓冲液的pH和温度，即可切掉融合标签。
pBad gIII C大肠杆菌表达载体说明
pBad/gIII C编号 名称北京华越洋VECT-‐430 pBad/gIII CpBadgIII C载体基本信息载体名称: pBad/gIII C， pBadgIII C, p BadgIIIC. p Bad/gIIIC 质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达载体表达水平: 高启动子: araBad克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶载体大小: 4149 b p5' 测序引物及序列: pBAD-‐F: A TGCCATAGCATTTTTATCC3' 测序引物及序列: pBAD-‐R: g atttaatctgtatcagg载体标签: N-‐GIII s ignal, C-‐His, C-‐Myc载体抗性: 氨苄备注: -‐-‐稳定性: 瞬时表达 Transient组成型: 诱导表达病毒/非病毒: 非病毒pBadgIII C载体质粒图谱和多克隆位点信息pBadgIII C载体简介pBAD/gIII载体质粒是衍生于pBR322载体。
载体设计用来在大肠杆菌中进行可调节分泌性表达和纯化重组目的蛋白。
使用基因III信号序列来定位重组蛋白，使其分泌到大肠杆菌周质腔中。
使用大肠杆菌araBAD启动子（pBAD）增强了大肠杆菌重组蛋白可溶性表达的水平。
载体上的调节蛋白AraC能够调控pBad启动子。
pBadgIII C载体序列 AAGAAACCAATTGTCCATATTGCATCAGACATTGCCGTCACTGCGTCTTTTACTGGCTCTTCTCGCTAACCA AACCGGTAACCCCGCTTATTAAAAGCATTCTGTAACAAAGCGGGACCAAAGCCATGACAAAAACGCGTAACA AAAGTGTCTATAATCACGGCAGAAAAGTCCACATTGATTATTTGCACGGCGTCACACTTTGCTATGCCATAG CATTTTTATCCATAAGATTAGCGGATCCTACCTGACGCTTTTTATCGCAACTCTCTACTGTTTCTCCATACC CGTTTTTTGGGCTAACAGGAGGAATTAACCATGAAAAAACTGCTGTTCGCGATTCCGCTGGTGGTGCCGTTC TATAGCCATAGCACCATGGCGGCCGCTCGAGATCTGCAGCTGGTACCATATGGGAATTCGAAGCTTTCTAGA ACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATAGCGCCGTCGACCATCATCATCATCATCATTGAGTTTAAAC GGTCTCCAGCTTGGCTGTTTTGGCGGATGAGAGAAGATTTTCAGCCTGATACAGATTAAATCAGAACGCAGA AGCGGTCTGATAAAACAGAATTTGCCTGGCGGCAGTAGCGCGGTGGTCCCACCTGACCCCATGCCGAACTCA GAAGTGAAACGCCGTAGCGCCGATGGTAGTGTGGGGTCTCCCCATGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCA AATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCT GAGTAGGACAAATCCGCCGGGAGCGGATTTGAACGTTGCGAAGCAACGGCCCGGAGGGTGGCGGGCAGGACG CCCGCCATAAACTGCCAGGCATCAAATTAAGCAGAAGGCCATCCTGACGGATGGCCTTTTTGCGTTTCTACA AACTCTTTTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATG CTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGT TTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCAAGAG CAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTT ACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTA CTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGC CTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCA ATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGAC TGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGAT AAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGT ATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGT GCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTT CATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAG TTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGC GTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCA ACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAG TTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCT GCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGG TCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTA CAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGG GTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTT CGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGC AACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCT GATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGC AGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATT TCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATACACTCCGC TATCGCTACGTGACTGGGTCATGGCTGCGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTT GTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCAC CGTCATCACCGAAACGCGCGAGGCAGCAGATCAATTCGCGCGCGAAGGCGAAGCGGCATGCATAATGTGCCT GTCAAATGGACGAAGCAGGGATTCTGCAAACCCTATGCTACTCCGTCAAGCCGTCAATTGTCTGATTCGTTA CCAATTATGACAACTTGACGGCTACATCATTCACTTTTTCTTCACAACCGGCACGGAACTCGCTCGGGCTGG CCCCGGTGCATTTTTTAAATACCCGCGAGAAATAGAGTTGATCGTCAAAACCAACATTGCGACCGACGGTGG CGATAGGCATCCGGGTGGTGCTCAAAAGCAGCTTCGCCTGGCTGATACGTTGGTCCTCGCGCCAGCTTAAGA CGCTAATCCCTAACTGCTGGCGGAAAAGATGTGACAGACGCGACGGCGACAAGCAAACATGCTGTGCGACGC TGGCGATATCAAAATTGCTGTCTGCCAGGTGATCGCTGATGTACTGACAAGCCTCGCGTACCCGATTATCCA TCGGTGGATGGAGCGACTCGTTAATCGCTTCCATGCGCCGCAGTAACAATTGCTCAAGCAGATTTATCGCCA GCAGCTCCGAATAGCGCCCTTCCCCTTGCCCGGCGTTAATGATTTGCCCAAACAGGTCGCTGAAATGCGGCT GGTGCGCTTCATCCGGGCGAAAGAACCCCGTATTGGCAAATATTGACGGCCAGTTAAGCCATTCATGCCAGT AGGCGCGCGGACGAAAGTAAACCCACTGGTGATACCATTCGCGAGCCTCCGGATGACGACCGTAGTGATGAA TCTCTCCTGGCGGGAACAGCAAAATATCACCCGGTCGGCAAACAAATTCTCGTCCCTGATTTTTCACCACCC CCTGACCGCGAATGGTGAGATTGAGAATATAACCTTTCATTCCCAGCGGTCGGTCGATAAAAAAATCGAGAT AACCGTTGGCCTCAATCGGCGTTAAACCCGCCACCAGATGGGCATTAAACGAGTATCCCGGCAGCAGGGGAT CATTTTGCGCTTCAGCCATACTTTTCATACTCCCGCCATTCAGAG其他大肠杆菌表达载体：pBV221 ptdTomato pET-‐52b(+) pAmCyan pDsRed-‐Express2 pBV220 pCold-‐GST pColdS-‐SUMO pCold T F pCold I V pCold I II pCold I IpCold I pE-‐SUMO pCold-‐ProS2 pBAD102/D-‐TOPO pBAD202/D-‐TOPO pACYC184 pBAD/Thio-‐TOPO pBad/Myc-‐His C pBad/Myc-‐His B pBad/Myc-‐His A pBad/His C pBad/His B pBad/His A pBAD-‐TOPO pET-‐23b(+) pET-‐23a(+)pET-‐23c(+) pET-‐23(+) pET-‐12b(+) pET-‐12c(+)pET-‐12a(+) pET-‐11b(+) pET-‐11a(+) pET-‐11c(+) pBad24 pQE-‐82L pQE-‐81L pQE-‐80LpQE-‐32 pQE-‐9 pQE-‐16 pQE-‐31pQE-‐60 pQE-‐70 pQE-‐40 pET-‐51b(+)pET-‐50b(+) pET-‐49b(+) pET-‐48b(+) pET-‐47b(+)pET-‐26b(+) pET-‐32a(+) pET-‐21b(+) pET-‐22b(+)pET-‐14b pET-‐16b pET-‐15b pET-‐19bpET-‐20b(+) pET-‐21d(+) pET-‐21c(+) pET-‐21b(+)pET-‐21a(+) pET-‐24a(+) pET-‐24d(+) pET-‐25b(+)pET-‐27b(+) pET-‐28a(+) pET-‐30a(+) pET-‐42a(+)pET-‐43.1c(+) pET-‐43.1b(+) pET-‐43.1a(+) pET-‐44a(+)pET-‐44c(+) pET-‐46 E K/LIC pET-‐37b(+) pTrcHis2 C pTrcHis2 B pTrcHis2 A pET303/CT-‐His pET302/NT-‐His pRSET-‐CFP pRSET-‐EmGFP pRSET-‐BFP pGFPuvpET300/NT-‐DEST pET301/CT-‐DEST pGEM-‐T pBad43pGEX-‐4T-‐3 pGEX-‐5X-‐2 pBlueScript S K(+) pG-‐Tf2pG-‐KJE8 pGro7 pET-‐SUMO pSE380pET-‐17b pET102/D-‐TOPO pCDFDuet-‐1 pMAL-‐p5xpTf16 pET-‐28c(+) pBluescript I I S K(+) pET-‐30b(+) pSUMO pProEX H Tc pProEX H Tb pProEX H Ta pKD3 pKD13 pKD46 pTYB1pTYB2 pTWIN2 pBluescript I I K S(-‐) pTYB12pMAL-‐p5e pACYCDuet-‐1 pEGM-‐11ZF(+) pEGM-‐7ZF(+) PinPoint X a-‐3 PinPoint X a-‐2 PinPoint X a-‐1 pSP73pSP64 pTWIN1 pTYB11 pTXB1pET-‐5b(+) pBad/gIII C pBad/gIII B pBad/gIII ApET-‐5a(+) pMal-‐p4X pMal-‐p2G pkk223-‐3pkk232-‐8 pCYB1 pEZZ18 pBAD18pMAL-‐c5x pMal-‐p2E pMal-‐p2X pET-‐44 E K/LIC pET-‐43.1 E K/LIC pET-‐41 E K/LIC pMal-‐c4X pTrcHis BpET-‐31b(+) pET-‐3b(+) pET-‐41a(+) pGEX-‐3XpGEX-‐4T-‐2 pETDuet-‐1 pGEX-‐4T-‐1 pTrc99apET-‐28b(+) pET-‐His pALEX a,b,c pACYC177pBR322 pKD4 pKD20 pMXB10pEcoli-‐6xHN-‐GFPuv pKJE7 pRSET B pGEX-‐KGpGEX-‐2T pRSFDuet-‐1 pCOLADuet-‐1 pTrcHis C pTrcHis A pET-‐41b(+) pET-‐42b(+) pET-‐3a(+) pGEX-‐6P-‐3 pGEX-‐6P-‐2 pGEX-‐6P-‐1 pGEX-‐5X-‐3 pGEX-‐5X-‐1 pGEX-‐2TK pRSET A pMal-‐c2G pMal-‐c2E pMal-‐c2X pRSET C pQE-‐30pET-‐45b(+) pET-‐44b(+) pET-‐42c(+) pET-‐41c(+) pET-‐40b(+) pET-‐33b(+) pET-‐39b(+) pET-‐32 E K/LIC pET-‐32 X a/LIC pET-‐32c(+) pET-‐32b(+) pET-‐30 X a/LIC pET-‐30 E K/LIC pET-‐30c(+) pET-‐29c(+) pET-‐29b(+) pET-‐29a(+) pET-‐24c(+) pET-‐24b(+) pET-‐24(+) pET-‐23d(+) pET-‐11d(+) pBad33。
pBV220大肠杆菌表达载体说明
pBV220⼤肠杆菌表达载体说明pBV220编号名称北京华越洋VECT--‐110 pBV220pBV220载体基本信息载体名称: pBV220质粒类型: 原核表达载体，温控型表达载体，热诱导表达载体⾼拷贝/低拷贝: ⾼拷贝启动⼦: pR/pL克隆⽅法: 多克隆位点，限制性内切酶载体⼤⼩: 3666 b p5' 测序引物及序列: pBV220--‐F: 5?′--‐AAGAAGGGCAGCATTCAAAG--‐3‘3' 测序引物及序列: pBV220--‐R: 5?′--‐CTGCGTTCTGATTTAATCTG--‐3‘载体标签: --‐--‐载体抗性: 氨苄筛选标记: --‐--‐备注: pBV220质粒的SD sequence（⽤于结合原核⽣物核糖体的序列）后紧跟多克隆酶切位点，便于插⼊带起始ATG的外源基因，可表达⾮融合蛋⽩。
载体含有强的转录终⽌⼦可防⽌出现"通读"现象，有利于质粒--‐宿主系统的稳定。
载体pBV220为3.7Kb，有利于增加其拷贝数及容量。
pBV220含有PL启动⼦和编码对该启动⼦具有抑制作⽤⽽⼜对温度敏感的cI蛋⽩基因cIts857调控基因cI，因此可⽤温度对插⼊其中的外源基因的转录进⾏调控。
温控型原核表达载体，⾼拷贝数，⼤容量，强启动⼦，强转录终⽌⼦，可在任何受体菌中诱导表达。
pBV220载体是λPL/PR--‐cI857温度敏感系统表达载体，能够在42 表达⾮融合的⽬的蛋⽩。
在利⽤pBV220载体进⾏质粒构建的时候，需要加⼊ATG起始密码⼦。
PBV220质粒属于温度诱导表达型，培养温度为30 ，诱导温度为42 。
稳定性: 诱导表达组成型: ⾮组成型病毒/⾮病毒: ⾮病毒pBV220载体质粒图谱和多克隆位点信息Ampr, 氨苄抗性基因;ori, 质粒复制起点;cIts857, lambda 噬菌体表达抑制基因，但是在热诱导条件下能够表达⽬的基因; PRPL, 来⾃于lambda 噬菌体的串联的PR和PL启动⼦，保证基因的⾼⽔平表达; SD, Shine-Dalgarno序列;rrnB, 核糖体rrnB基因，是基因转录终⽌信号;pBV220载体简介pBV220载体是我国预防医学科学院病毒研究所⾃⾏构建的⼤肠杆菌温控表达载体,⽬前仍在⼴泛使⽤.pBV220载体序列ORIGIN1 GAATTCCCGG GGATCCGTCG ACCTGCAGCC AAGCTTCTGT TTTGGCTTAT GAGAGAAGAT 61 TTTCAGCCTG ATACAGATTA AATCAGAACG CAGAAGCGGT CTGATAAAAC AGAATTTGCC 121 TCCCGGCAGT AGCGCGGTGG TCCCACCTGA CCCCATGCCG AACTCAGAAG TGAAACGCCG 181 TAGCGCCGAT GGTAGTGTGG GGTCTCCCCA TGCGAGAGTA GCCAACTGCC AGGCATCAAA 241 TAAAACGAAA GGCTCAGTCG AAAGACTGGG CCTTTCGTTT TATCTGTTGT TTGTCGGTGA 301 ACGCTCTCCT GAGTAGGACA AATCCGCCGG GAGCGGATTT GAACGTTGCG AAGCAACGGC 361 CCGGAGGGTG GCGGGCAGGA CGCCCGCCAT AAACTGCCAG GCATCAAAGG AATCAGAAGG 421 CCATCCTGAC GGATGGCCTT TTTGCGTTTC TACAAACTCT TTGTTTATTT TTCTAAATAC 481 ATTCAAATAT GTATCCGCTC ATGAGACAAT AACCCTGATA AATGCTTCAA TAATATTGAA 541 AAAGGAAGAG TATGAGTATT CAACATTTCC GTGTCGCCCT TATTCCCTTT TTTGCGGCAT 601 TTTGCCTTCC TGTTTTTGCT CACCCAGAAA CGCTGGTGAA AGTAAAAGAT GCTGAAGATC 661 AGTTGGGTGC ACGAGTGGGT TACATCGAAC TGGATCTCAA CAGCGGTAAG ATCCTTGAGA 721 GTTTTCGCCC CGAAGAACGT TTTCCAATGA TGAGCACTTT TAAAGTTCTG CTATGTGGCG 781 CGGTATTATC CCGTGTTGAC GCCGGGCAAG AGCAACTCGG TCGCCGCATA CACTATTCTC 841 AGAATGACTT GGTTGAGTAC TCACCAGTCA CAGAAAAGCA TCTTACGGAT GGCATGACAG 901 TAAGAGAATT ATGCAGTGCT GCCATAACCA TGAGTGATAA CACTGCGGCC AACTTACTTC 961 TGACAACGAT CGGGAGGACCGAAGGAGCTA ACCGCTTTTT TGCACAACAT GGGGGATCAT 1021 GTAACTCGCC TTGATCGTTG GGAACCGGAT CTGAATGAAG CCATACCAAA CGACGAGCGT 1081 GACACCACGA TGCCTGTAGC AATGGCAACA ACGTTGCGCA AACTATTAAC TGGCGAACTA 1141 CTTACTCTAG CTTCCCGGCA ACAATTAATA GACTGGATGG AGGCGGATAA AGTTGCAGGA 1201 CCACTTCTGC GCTCGGCCCT TCCGGCTGGC TGGTTTATTG CTGATAAATC TGGAGCCGGT 1261 GAGCGTGGGT CTCGCGGTAT CATTGCAGCA CTGGGGCCAG ATGGTAAGCC CTCCCGTATC 1321 GTAGTTATCT ACACGACGGG GAGTCAGGCA ACTATGGATG AACGAAATAG ACAGATCGCT 1381 GAGATAGGTG CCTCACTGAT TAAGCATTGG TAACTGTCAG ACCAAGTTTA CTCATATATA 1441 CTTTAGATTG ATTTAAAACT TCATTTTTAA TTTAAAAGGA TCTAGGTGAA GATCCTTTTT 1501 GATAATCTCA TGACCAAAAT CCCTTAACGT GAGTTTTCGT TCCACTGAGC GTCAGACCCC 1561 GTAGAAAAGA TCAAAGGATC TTCTTGAGAT CCTTTTTTTC TGCGCGTAAT CTGCTGCTTG 1621 CAAACAAAAA AACCACCGCT ACCAGCGGTG GTTTGTTTGC CGGATCAAGA GCTACCAACT 1681 CTTTTTCCGA AGGTAACTGG CTTCAGCAGA GCGCAGATAC CAAATACTGT CCTTCTAGTG 1741 TAGCCGTAGT TAGGCCACCA CTTCAAGAAC TCTGTAGCAC CGCCTACATA CCTCGCTCTG 1801 CTAATCCTGT TACCAGTGGC TGCTGCCAGT GGCGATAAGT CGTGTCTTAC CGGGTTGGAC 1861 TCAAGACGAT AGTTACCGGA TAAGGCGCAG CGGTCGGGCT GAACGGGGGG TTCGTGCACA 1921 CAGCCCAGCT TGGAGCGAAC GACCTACACC GAACTGAGAT ACCTACAGCG TGAGCATTGA 1981 GAAAGCGCCA CGCTTCCCGA AGGGAGAAAG GCGGACAGGT ATCCGGTAAG CGGCAGGGTC 2041 GGAACAGGAG AGCGCACGAG GGAGCTTCCA GGGGGAAACG CCTGGTATCT TTATAGTCCT 2101 GTCGGGTTTC GCCAACCTCT GACTTGAGCG TCGATTTTGT GATGCTCGTC AGGGGGGCGG 2161 AGCCTATGGA AAAACGCCAG CAACGCGGCC TTTTTACGGT TCCTGGCCTT TTGCTGGCCT 2221 TTTGCTCACA TGTTCTTTCC TGCGTTATCC CCTGATTCTG TGGATAACCG TATTACCGCC 2281 TTTGAGTGAG CTGATACCGC TCGCCGCAGC CGAACGACCG AGCGCAGCGA GTCAGTGAGC 2341 GAGGAAGCGG AAGAGCGCCC TTATCTTTCC CTTTATTTTT GCTGCGGTAA GTCGCATAAA 2401 AACCATTCTT其他⼤肠杆菌表达载体：pBV221 ptdTomato pET--‐52b(+) pAmCyan pDsRed--‐Express2 pBV220 pCold--‐GST pColdS--‐SUMO pCold T F pCold I V pCold I II pCold I IpCold I pE--‐SUMO pCold--‐ProS2 pBAD102/D--‐TOPO pBAD202/D--‐TOPO pACYC184 pBAD/Thio--‐TOPO pBad/Myc--‐His C pBad/Myc--‐His B pBad/Myc--‐His A pBad/His C pBad/His B pBad/His A pBAD--‐TOPO pET--‐23b(+) pET--‐23a(+) pET--‐23c(+) pET--‐23(+) pET--‐12b(+) pET--‐12c(+)pET--‐12a(+) pET--‐11b(+) pET--‐11a(+) pET--‐11c(+) pBad24 pQE--‐82L pQE--‐81L pQE--‐80LpQE--‐32 pQE--‐9 pQE--‐16 pQE--‐31pQE--‐60 pQE--‐70 pQE--‐40 pET--‐51b(+)pET--‐50b(+) pET--‐49b(+) pET--‐48b(+) pET--‐47b(+)pET--‐26b(+) pET--‐32a(+) pET--‐21b(+) pET--‐22b(+)pET--‐14b pET--‐16b pET--‐15b pET--‐19bpET--‐20b(+) pET--‐21d(+) pET--‐21c(+) pET--‐21b(+)pET--‐21a(+) pET--‐24a(+) pET--‐24d(+) pET--‐25b(+)pET--‐27b(+) pET--‐28a(+) pET--‐30a(+) pET--‐42a(+)pET--‐43.1c(+) pET--‐43.1b(+) pET--‐43.1a(+) pET--‐44a(+)pET--‐44c(+) pET--‐46 E K/LIC pET--‐37b(+) pTrcHis2 C pTrcHis2 B pTrcHis2 A pET303/CT--‐His pET302/NT--‐His pRSET--‐CFP pRSET--‐EmGFP pRSET--‐BFP pGFPuvpET300/NT--‐DEST pET301/CT--‐DEST pGEM--‐T pBad43pGEX--‐4T--‐3 pGEX--‐5X--‐2 pBlueScript S K(+) pG--‐Tf2pG--‐KJE8 pGro7 pET--‐SUMO pSE380pET--‐17b pET102/D--‐TOPO pCDFDuet--‐1 pMAL--‐p5xpTf16 pET--‐28c(+) pBluescript I I S K(+) pET--‐30b(+) pSUMO pProEX H Tc pProEX H Tb pProEX H Ta pKD3 pKD13 pKD46 pTYB1pTYB2 pTWIN2 pBluescript I I K S(--‐) pTYB12pMAL--‐p5e pACYCDuet--‐1 pEGM--‐11ZF(+) pEGM--‐7ZF(+) PinPoint X a--‐3 PinPoint X a--‐2 PinPoint X a--‐1 pSP73 pSP64 pTWIN1 pTYB11 pTXB1pET--‐5b(+) pBad/gIII C pBad/gIII B pBad/gIII ApET--‐5a(+) pMal--‐p4X pMal--‐p2G pkk223--‐3pkk232--‐8 pCYB1 pEZZ18 pBAD18pMAL--‐c5x pMal--‐p2E pMal--‐p2X pET--‐44 E K/LIC pET--‐43.1 E K/LIC pET--‐41 E K/LIC pMal--‐c4X pTrcHis BpET--‐31b(+) pET--‐3b(+) pET--‐41a(+) pGEX--‐3XpGEX--‐4T--‐2 pETDuet--‐1 pGEX--‐4T--‐1 pTrc99apET--‐28b(+) pET--‐His pALEX a,b,c pACYC177pBR322 pKD4 pKD20 pMXB10pEcoli--‐6xHN--‐GFPuv pKJE7 pRSET B pGEX--‐KGpGEX--‐2T pRSFDuet--‐1 pCOLADuet--‐1 pTrcHis C pTrcHis A pET--‐41b(+) pET--‐42b(+) pET--‐3a(+) pGEX--‐6P--‐3 pGEX--‐6P--‐2 pGEX--‐6P--‐1 pGEX--‐5X--‐3 pGEX--‐5X--‐1 pGEX--‐2TK pRSET A pMal--‐c2G pMal--‐c2E pMal--‐c2X pRSET C pQE--‐30pET--‐45b(+) pET--‐44b(+) pET--‐42c(+) pET--‐41c(+) pET--‐40b(+) pET--‐33b(+) pET--‐39b(+) pET--‐32 E K/LIC pET--‐32 X a/LIC pET--‐32c(+) pET--‐32b(+) pET--‐30 X a/LIC pET--‐30 E K/LIC pET--‐30c(+) pET--‐29c(+) pET--‐29b(+) pET--‐29a(+) pET--‐24c(+) pET--‐24b(+) pET--‐24(+) pET--‐23d(+) pET--‐11d(+) pBad33。
大肠杆菌翻译起始因子IF1的生物信息学分析、表达载体构建及蛋白纯化
基因组学与应用生物学，2020年，第39卷，第12期，第5606-5616页研宄报告Research Report大肠杆菌翻译起始因子IF1的生物信息学分析、表达载体构建及蛋白纯化徐本锦刘玲山西医科大学汾阳学院医学检验系.汾阳,032200•通信作者，***************.cn摘要为了解大肠杆菌IF1在pET22b载体上的表达特性，优化蛋白表达条件并建立纯化策略，进一步揭 示其在细胞生命活动中的功能机制。
本研究构建了大肠杆菌in/4基因的原核表达载体pET22b-h//l，优化表 达条件并纯化出1F1蛋白，通过生物信息学手段对IF1进行了系统分析。
结果表明，过表达载体构建正确，IF1主要在裂解后的上清液中表达，镍柱初步纯化后IF1主要分布于50 mmol/L、100 mmol/L和200 mmol/L 的咪唑洗脱液中。
分子筛二次纯化后发现，IF丨蛋白纯度高，无降解。
IF1是一个由72个氨基酸组成的碱性蛋 白，等电点为9.22,不稳定指数为37.35,半衰期大于10 h，含有一个S1样RNA结合结构域，13个rRNA结合 位点，6个可能的磷酸化位点，是一种无跨膜螺旋的亲水性蛋白。
多序列比对和进化分析显示，沙门氏菌与大 肠杆菌IF1的序列一致性最高,并且亲缘关系最近;其次是假结核耶尔森菌。
本研宄为细菌翻译起始因子的 表达和纯化摸清了条件，为后续的翻译相关功能实验和三维结构分析提供了材料准备，同时有助于揭示1F1的确切功能及翻译起始机制。
关键词大肠杆菌co/〇,丨F1，蛋白表达，生物彳g息学分析Bioinformatic Analysis, Expression Vector Construction and Protein Purification of E. coli Translation Initiation Factor 1Xu Benjin*Liu LingDepartment of Medical Laboratory Science, Fenyang College, Shanxi Medical University, Fenyang, 032200*Correspondingauthor,***************.cnDOI: 10.13417/j.gab.039.005606Abstract In order to investigate the expression characteristics of Escherichia coli IF1on pET22b vector,optimize the expression conditions and establish purification strategy,and further reveal its functional mechanism in cell life activities.In this work,the expression vector pET22b-m/4 was generated,expression conditions were optimized and IF1protein was purified,and many characteristics of IF1was systematically analyzed by bioinformatics tools.The results showed that the overexpression vector was constructed correctly,the protein was mainly expressed in the supernatant of bacterial lysate,and distributed in 50 mmol/L, 100 mmol/L and 200 mmol/L imidazole eluents after preliminary purification with nickel column.After secondary purification with molecular sieve, the results showed that IF1protein had high purity and no degradation.IF1was a basic protein composed of72 amino acids,the isoelectric point was 9.22, the instability index was 37.35, and the half-life was more than 10 hours.It is a hydrophilic protein containing a SI like RNA binding domain, 13 rRNA binding sites, 6 possible基金项目：本研究由山西省高等学校科技创新项目(2020L0749)、山西省高等学校大学生创新创业训练计划重点项目(2020777)、吕梁市科技计划项目(2020SHFZ29)和山西医科大学汾阳学院引进人才启动基金项目(2020A01)共同资助引用格式：X u B.J.，and Liu L.，2020, Bioinformatic analysis, expression vector construction and protein purification of c o// transla- tion i n i t i a t i o n factor 1，Jiyinzuxue Y u Yingyong Shengwuxue (Genomics and Applied Biology), 39(12): 5606-5616 (徐本锦，刘玲，2020,大肠杆菌翻译起始因子IF1的生物信息学分析、表达载体构建及蛋白纯化，基因组学与应用生物学，39(12): 5606-5616)大肠杆菌翻译起始因子IF1的生物信息学分析、表达载体构建及蛋白纯化5607phosphorylation sites and without transmembrane helix.Multiple sequence alignment and evolutionary analysis showed that Salmonella typhi IF1had the highest sequence identity and the closest genetic relationship with that of E. coli,followed by Yersinia pseudotuberculosis.This study established the optimal conditions for the expression and purification of bacterial translation initiation factors,provided material preparation for the following translation-related functional experiments and three-dimensional structure analysis,and helped to clarify the exact function of IF1and the mechanism of translation initiation.Keywords E. coli,Translation initiation factor1,Protein expression,Bioinformatic analysisD N A携带的遗传信息经过转录形成mRNA，mRNA再被翻译成蛋白质来执行生物学功能，即为 著名的中心法则(Vigarand Wieden,2017)。
原核表达系统三大要素的选择及优化
原核表达系统是目前使用最广泛、最完善的重组蛋白表达系统，具有遗传背景清晰、表达周期快、表达量高、成本低等优势，缺点是无法进行蛋白的翻译后修饰，得到具有生物活性蛋白的几率较小。
原核表达系统适用于表达原核来源的蛋白或不需要翻译后修饰的真核来源蛋白。
在原核蛋白表达过程中，需要综合考虑表达菌株、质粒载体、表达条件三大因素，以获得最满意的表达效果。
下面为大家一一介绍这三大因素的选择和优化。
1. 表达菌株菌株的选择往往是大家最容易忽视的，大多数人会选择使用自己实验室有的或用过的表达菌株。
当蛋白表达效果不佳时，大多会在质粒载体或表达条件上找原因，而不会考虑菌株的选择是否合适。
但作为表达宿主，菌株一定会对外源基因表达蛋白产生影响。
图1 大肠杆菌原核表达系统常用的菌株包括大肠杆菌、芽孢杆菌和链霉菌。
其中运用最为广泛的就是大肠杆菌表达系统。
以下为大家列出了一些常用的大肠杆菌表达菌株，可根据不同的需求进行选择。
2. 质粒载体质粒表达载体上的重要元件包括启动子，多克隆位点，终止子，复制子，信号肽，融合标签，筛选标记等。
根据载体上这些元件的特性，有多种质粒可供选择。
图2 大肠杆菌表达质粒pET-22b(+)图谱启动子：根据启动子的强弱考虑，强启动子可以提高蛋白表达量；弱启动子可以降低本底表达、增加可溶表达、表达小量伴侣蛋白等。
根据启动子的作用方式考虑，组成型启动子使宿主不停的表达重组蛋白；诱导型启动子使宿主在特定诱导条件下表达重组蛋白。
终止子：终止子的作用在于保护mRNA在核外不被降解，延长mRNA的寿命，以提高重组蛋白表达量。
对于T7系统来说，由于T7 RNA聚合酶效率非常高，保证一直有充足的mRNA 提供翻译，所以终止子对其影响不大，只有一些自身带有起始密码子的外源基因需要终止子。
~复制子：复制子决定质粒载体拷贝数，拷贝数越高，重组蛋白表达量就越高。
表达载体通常会选用高拷贝的复制子，但过高的拷贝数会影响质粒稳定性和宿主生长。
pet22b质粒序列
pet22b质粒序列摘要：1.介绍PET22b质粒的基本信息2.PET22b质粒的组成与特点3.PET22b质粒在基因工程中的应用4.举例说明PET22b质粒在科研与生产中的作用5.总结PET22b质粒的重要性正文：【介绍PET22b质粒的基本信息】PET22b质粒，是一种广泛应用于基因工程研究的载体，来源于大肠杆菌。
它的全称是Pseudomonas putida expression vector，中文名称为假单胞菌表达载体。
PET22b质粒在基因工程领域中具有很高的知名度，为科研人员提供了便利。
【PET22b质粒的组成与特点】PET22b质粒主要由三个部分组成：启动子、目的基因插入区和选择性标记基因。
启动子位于质粒的首端，负责启动目的基因的表达；目的基因插入区位于质粒的中部，用于插入所需研究的基因；选择性标记基因位于质粒的尾端，便于筛选含有目的基因的转化子。
PET22b质粒具有以下特点：1.较强的表达能力：PET22b质粒携带的启动子具有较强的启动能力，可促进目的基因在受体细胞中高效表达。
2.方便筛选：质粒上携带的选择性标记基因，如抗生素抗性基因，便于转化子的筛选和鉴定。
3.稳定性：PET22b质粒具有较高的稳定性，在受体细胞中能稳定存在并传递给下一代。
【PET22b质粒在基因工程中的应用】PET22b质粒在基因工程中有着广泛的应用，如：1.基因克隆：通过将目的基因插入PET22b质粒，实现基因的表达和产物分泌。
2.蛋白质表达：利用PET22b质粒在受体细胞中表达外源蛋白质，为生物制品的生产提供可能。
3.基因调控研究：通过调控PET22b质粒上的启动子强度，研究目的基因在不同条件下的表达水平。
【举例说明PET22b质粒在科研与生产中的作用】以生产重组人胰岛素为例，科研人员可通过将人的胰岛素基因插入PET22b质粒，转入大肠杆菌进行表达。
大肠杆菌在适当的培养条件下，可以高效表达重组人胰岛素，从而为制备重组人胰岛素药物提供原料。
不同来源寡聚-1,6-葡糖苷酶异源表达及酶学特性
关 键 词 ： 寡 聚 -1,6-葡 糖 苷 酶 ； Bacillus coagulans ATCC 7050； Bacillus subtilis 168； Bacillus
thermoglucosidasius KP 1006
中图分类号：Q71
文献标志码：A
凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）是一种兼性 厌氧革兰氏阳性菌，具有耐高温、耐酸、稳定性好、抗 逆性强等优点[1]，在工业发酵中主要用来生产 L-乳 酸。相比于其他生产菌株，凝结芽孢杆菌的发酵温度 更高，不易染菌，且发酵工艺较简单[2]，并可以利用一 些廉价碳源作为底物原料。但目前在以玉米粉/淀粉 水解液为底物的凝结芽孢杆菌生产乳酸的工业发酵 过程中，发酵结束时会有较高浓度的残糖[3]，这会使得 糖酸转化率下降，并导致乳酸分离纯化过程费用增 加、产品质量下降以及货架期缩短。在乳酸发酵液 残糖中，异麦芽糖质量占残糖总质量的 60%左右，而 寡聚-1,6-葡糖苷酶（oligo-1,6-glucosidase，EC 3.2.1.10）
E. coli DH5α：均由本实验室保藏；Bacillus subtilis 168： 美 国 ATCC 细 胞 库 ； Bacillus thermoglucosidasius KP 1006： 中 国 普 通 微 生 物 菌 种 保 藏 管 理 中 心 ； pET22b(+)：由本实验室保藏；酵母膏、蛋白胨、琼脂：生 化试剂，上海凌峰化学试剂有限公司；异丙基-β-D-硫 代 半 乳 糖 苷 （ IPTG） ： 生 化 试 剂 ， 上 海 碧 云 天 有 限 公 司；pNPG：w> 99%，西格玛奥德里奇（上海）贸易有限 公司；限制性内切酶：宝日医生物技术有限公司；细 菌基因 DNA 抽提试剂盒、AxyPrep DNA 凝胶回收试 剂 盒 ： 爱 思 进 生 物 技 术 有 限 公 司 ； One Step Cloning Kit：南京诺唯赞生物科技股份有限公司；PAGE 凝胶 快速制备试剂盒（10%）：上海雅酶生物医药科技有限 公司；Ni-NTA 6FF 蛋白纯化预装柱（5 mL）：上海翊圣 生物科技有限公司。 1.2 测试与表征
嗜热真菌木聚糖酶1YNA的表达和定点突变
嗜热真菌木聚糖酶1YNA的表达和定点突变摘要:为了进一步提高嗜热真菌(Thermomyces lanuginosus DSM10635)本已较耐热的木聚糖酶1YNA的热稳定性｡利用重叠延伸PCR技术从嗜热真菌基因组DNA中扩增获得了木聚糖酶1YNA的基因xyl,将其插入到大肠杆菌表达载体pET-22b(+)中,构建了重组表达质粒pET-22b(+)-xyl｡该质粒转化到表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)后获得了能成功表达的工程菌｡工程菌表达木聚糖酶1YNA的最适温度为65℃,最适pH值为6.0｡其在75℃,pH值为6.5的条件下失活处理30 min 后还残存有30%的酶活,与嗜热真菌生产的木聚糖酶特性相近｡在对该木聚糖酶的N端氨基酸序列进行定点突变后发现,T4A､T4G､T4R均对该木聚糖酶的热稳定性无显著影响,其中T4G突变体的耐热性有变弱的趋势｡关键词:嗜热真菌;重叠延伸PCR;定点突变;木聚糖酶木聚糖酶(Xylanase,EC 3.2.1.8)是可将木聚糖降解成低聚木糖和少量木糖的一类酶的总称｡狭义上的木聚糖酶限指内切β-1,4-木聚糖酶,是木聚糖降解过程中最关键的一个酶[1-3]｡木聚糖酶在现代工业中的重要性越来越明显｡目前该酶主要应用于制浆造纸､饲料和食品等行业｡木聚糖酶用于制浆造纸行业的预处理可提高纸浆的白度和减少化学漂白剂的使用;用于饲料行业能增加饲料的利用率和减少动物胃肠道疾病的发生;用于食品行业主要是对小麦面粉的改良和在酿酒方面的应用等｡木聚糖酶是利用非淀粉质原料生产酒精过程中的一个关键酶｡随着生物质能源事业发展,木聚糖酶必将得到更广泛的应用｡自1983年Bernier等首次从Bacillus subtilis中分离得到木聚糖酶基因以来,许多来自细菌､放线菌､霉菌､酵母菌和藻类等不同生物的木聚糖酶基因被克隆表达和分析｡嗜热真菌Thermomyces lanuginosus产生的木聚糖酶由于其高耐热性越来越受到关注[4]｡嗜热真菌T. lanuginosus DSM10635是从捷克的土壤中分离得到的一株耐热型菌株,它产生的木聚糖酶是一种耐高温酶,在较高温度(50~80℃)条件下稳定｡Xiong等[5]对该嗜热真菌DSM10635所分泌的木聚糖酶进行了详细的研究｡该木聚糖酶属于糖基水解酶第11家族,其最适pH值为6.0,最适温度为70℃,并且在pH值为 5.5~9.0下都具有很高的酶活性｡质谱结果还表明嗜热真菌DSM10635产生的木聚糖酶的分子量为21 295.17 Da,与DSM5826产生的木聚糖酶(1yna)的分子量极为相近｡耐高温酶的应用前景广阔｡在使用酶制剂的工业大生产中,高温过程常常不可避免或对工艺有帮助,例如高温能加快生化反应速度,提高液体物料的流动性能,防止有害微生物在过程中的生长繁殖等,目前大规模使用的酶制剂主要是通过工程菌发酵获得的｡基于PCR技术的不断发展和完善,运用基因工程和蛋白质工程的方法对木聚糖酶基因进行操作已经非常普遍[6-12]｡定点突变改变木聚糖酶分子的氨基酸残基能导致酶特性的改变[13-17]｡目前的研究多聚焦于第11家族的中温木聚糖酶,并且通过定点突变等方法获得了许多较耐热的突变体[18-20]｡总体来说,这些中温木聚糖酶的突变体热稳定性并未达到满意的程度,大多数突变体的热稳定性仅仅与未修改的耐热木聚糖酶的热稳定性接近｡直接利用本身已较耐热的木聚糖酶为模板进行基因修改将极有可能获得更耐热的突变体｡本研究对嗜热真菌T. lanuginosus DSM10635的木聚糖酶1YNA进行了原核表达｡由于此木聚糖酶基因中只含有一个内含子,实验中没有采用获得木聚糖酶基因的RNA后逆转录得到cDNA的方法来获得木聚糖酶的编码基因,而是利用特异性引物进行重叠延伸PCR获得的木聚糖酶1YNA编码基因,然后将其与原核表达载体连接后转入宿主菌能诱导表达木聚糖酶｡文献查询没有关于木聚糖酶1YNA 的基因表达的报道,本文是首次对该耐热木聚糖酶进行表达和基因定点修改,为今后实验工作的进一步开展打下了基础和指明了方向｡1材料与方法1.1实验材料嗜热真菌Thermomyces lanuginosus DSM10635购自德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)｡克隆载体pGEMT-easy购自Invitrogen公司｡表达载体pET-22b(+)购自Novagen公司｡大肠杆菌BL21(DE3)､DH5α来自中国农业科学院饲料研究所实验室｡实验所用的限制性内切酶NcoⅠ､XhoⅠ,T4 DNA连接酶,Pyrobest DNA聚合酶,Taq DNA聚合酶,DNA回收试剂盒,质粒提取试剂盒均购自TaKaRa公司｡木聚糖购自Sigma公司,其他化学试剂均为国产分析纯｡1.2实验方法1.2.1木聚糖酶基因xyl的克隆参考GenBank中嗜热真菌T. lanuginosus DSM5826(登录号U35436)的木聚糖酶基因序列及相关的G11家族的木聚糖酶基因序列来进行序列比对分析,从而设计特异性的简并引物f1,f2和r(表1)对总DNA 进行PCR扩增,这些引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成｡引物f1是根据木聚糖酶基因的起始位点前面一段序列设计的,而引物f2是根据木聚糖酶基因中间一段相对保守序列设计的｡将纯化后的PCR产物与pGEMT-easy连接后转化DH5α感受态细胞,挑选阳性克隆子送去北京擎科生物技术有限公司测序｡1.2.2木聚糖酶1YNA的原核表达对f1-r,f2-r两种引物对的PCR产物的测序结果进行序列比对｡结果表明,此木聚糖酶基因只含有一个约100bp的内含子｡设计含有酶切位点的特异性引物对f1-r引物对的PCR产物进行重叠延伸PCR,PCR扩增条件为:94℃､5 min;94℃､30 s,67℃､30s,72℃､40 s,循环30次;72℃､10 min;4℃保存｡经过两轮PCR后得到含有酶切位点NcoⅠ和XhoⅠ的PCR产物xyl片段,此片段和经两种内切酶切割后的pET-22b(+)空质粒载体在T4 DNA连接酶的作用下连接为重组质粒pET-22b(+)-xyl,电击转化感受态细胞BL21(DE3),涂布于含100 μg/mL氨苄青霉素(简称Amp)的LB固体平板后,挑选阳性克隆子培养,以进行木聚糖酶酶活的初步测定,显示有酶活的克隆子送去南京金斯瑞生物科技有限公司测序｡1.2.3木聚糖酶突变体T4A､T4G､T4R的原核表达通过对原核表达的木聚糖酶的氨基酸序列进行分析,可以对其N端的某个氨基酸进行定点突变获得高稳定性的木聚糖酶突变体,设计引物将其第4位的苏氨酸突变为丙氨酸(引物dF1)､甘氨酸(引物dF2)或精氨酸(引物dF3),改变其N-端的疏水性来提高其热稳定性,利用定点突变引物和反向引物对提取的质粒pET-22b(+)-xyl进行扩增｡PCR的条件是:94℃､5 min;94℃､30 s,67℃､30 s,72℃､1 min,循环30次;72℃､10 min;4℃保存｡将纯化后的PCR定点突变产物和经限制性内切酶NcoⅠ和XhoⅠ消化后的pET-22b(+)空质粒载体在T4 DNA连接酶的作用下构建pET-22b(+)-xyl突变重组质粒｡42℃热激转化感受态细胞BL21(DE3),涂布于含100 μg/mL Amp的固体平板后过夜培养,挑选阳性克隆子进行50 mL摇瓶培养并进行诱导,用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法初步测定其是否具有酶活,有木聚糖酶表达的克隆子送去南京金斯瑞生物科技有限公司测序｡1.2.4木聚糖酶1YNA及其突变体T4A､T4G､T4R的酶液制备将在LB(含100 μg/mL的Amp)固体平板上活化生长的单克隆子接入含有LB培养基(Amp的浓度为100 μg/mL)的1.5 mL离心管,摇床培养4 h后按1%(m/m)的比例接入到100 mL LB培养基中,37℃,200 r/min摇床过夜,加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG溶液诱导培养48 h｡培养液4℃,8 000 r/min离心10 min后取上清加入硫酸铵至其达到80%的饱和度,5 000 r/min离心0.5 h后沉淀用50 mmol/L的柠檬酸-磷酸缓冲液(pH值为6.5)溶解,8 000 r/min离心10 min后取上清4℃保存备用｡1.2.5木聚糖酶酶特性的鉴定实验采用DNS法测定木聚糖酶的酶活｡一个酶活力单位的定义为:在60℃和pH值为6.5的条件下,每分钟水解木聚糖底物产生1 μmol木糖所需酶量为1个国际酶活力单位｡酶活的测定以D-木糖作为标准｡在木聚糖酶酶活测定的实验中,pH值为4~7用的是柠檬酸-磷酸缓冲液(50 mmol/L);pH 值为7~9用的是Tris-HCl缓冲液(50 mmol/L)｡木聚糖酶特性的鉴定主要包括最适温度､最适pH值和热稳定性的测定｡每个结果均为3个平行样的平均值｡①最适反应温度的测定｡0.2 mL稀释好的酶液与1.8 mL 0.5%(m/V,g/mL,下同)木聚糖底物在不同的温度下反应10 min,然后加入3 mL DNS 煮沸5 min｡最适温度的测定分别在两个pH值下进行｡②最适反应pH值的测定｡在相同的温度下,0.2 mL稀释好的酶液与不同pH值的1.8 mL的木聚糖底物缓冲液反应10 min,然后加入3 mL DNS溶液煮沸5 min｡③热稳定性的测定｡用同一pH 值的缓冲液稀释好的酶液在不同的温度(50~100℃)下失活处理30 min,然后取失活后的0.2 mL酶液与1.8 mL的0.5%木聚糖底物(pH值为6.5)在60℃下反应10 min,再加入3 mL DNS混匀后煮沸5 min｡热稳定性的测定在3个pH值下进行｡所有样品在540 nm下测定其吸光度值｡2实验结果2.1重叠延伸PCR的结果选择合适的PCR体系对提取的总DNA进行扩增,f1-r和f2-r两种引物对进行PCR后获得比较好的结果,分析两个产物的测序结果发现f1-r这对引物PCR扩增后的产物长度比f2-r的产物长,即f2-r的DNA序列包含在f1-r的DNA序列中,与实验预期的结果基本符合｡在Pyrobest DNA聚合酶作用下,采用不同特异性引物组合(mF,mR,zF,zR)对f1-r引物PCR的产物进行重叠延伸PCR(图1),结果显示PCR产物的DNA长度分别约为200 bp和400 bp(图2泳道2､3)｡将两种纯化后的PCR产物加入到含有Pyrobest DNA聚合酶和引物(mF,mR)的体系中进行PCR扩增｡获得600 bp左右的DNA片段,这就是目的片段xyl(图2泳道4)｡2.2重组表达质粒的构建及验证将经过测序验证的木聚糖酶基因xyl以正确的开放阅读框连接到原核表达载体pET-22b(+)上,获得重组表达质粒pET-22b(+)-xyl(图3),转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3),挑选阳性克隆子培养,用试剂盒提取其质粒DNA,经限制性内切酶NcoⅠ和XhoⅠ双酶切后得到与pET-22b(+)(空质粒双酶切后的片段)以及目的基因xyl大小相符的DNA片段(图4),说明木聚糖酶基因xyl已正确插入到原核表达载体pET-22b(+)上｡2.3木聚糖酶1YNA及其酶突变体T4A､T4G､T4R的酶特异性鉴定2.3.1木聚糖酶1YNA的酶特异性鉴定木聚糖酶1YNA最适温度的测定在pH 值为5.0和6.5下进行,两个pH值条件下都是在65℃反应10 min时相对酶活达到最大值,因此确定原核表达木聚糖酶1YNA的最适温度为65℃(图5)｡木聚糖酶1YNA的最适pH值为6.0｡在50､70℃的反应条件下,木聚糖酶在pH值为6.0时都具有相对比较大的酶活(图6)｡木聚糖酶1YNA的失活曲线显示其在pH值为6.5和8.0下稳定性比pH值为5.0要高些(图7),在pH值为5.0的环境下,木聚糖酶60℃处理30 min后只残留约70%的相对酶活,而经过相同的失活处理后,pH值为6.5和8.0条件下的相对残留酶活基本没有下降;在65℃处理30 min后,不同pH值下的差别更明显,在pH值为6.5和8.0条件下的相对残留酶活还有80%以上,而在pH 值为5.0的环境下1YNA只剩下约40%的相对残留酶活;木聚糖酶1YNA在pH 值为5.0,100℃下处理30 min后基本丧失所有酶活,而相同条件处理后在pH值为6.5和8.0环境下还残留有少部分酶活｡2.3.2木聚糖酶突变体T4A,T4G,T4R的热稳定性鉴定实验成功完成了将木聚糖酶1YNA的第4位苏氨酸基因定点突变为丙氨酸(T4A)､甘氨酸(T4G)或精氨酸(T4R),并对突变结果进行了表达｡表达产物均有木聚糖酶活力｡对木聚糖酶突变体T4A,T4G,T4R进行了热稳定性的测定(图8~10)｡在pH值为5.0的环境下,60℃热处理30 min后,木聚糖酶突变体T4A､T4G､T4R的相对残留酶活分别为76.61%,51.94%和62.48%｡而在pH值为6.5和8.0环境下3种突变酶的相对残留酶活基本没有变化;3种突变酶在pH值为5.0的环境下,65℃热处理30 min后就基本丧失所有酶活,但在pH值为6.5和8.0环境下3种酶表现出不一样的热稳定性,T4A的相对残留酶活分别是72.21%和66.29%,T4G的相对残留酶活最低,分别是60.28%和55.74%,T4R的相对残留酶活分别是65.27%和60.61%｡总的来说,3种突变酶在pH值为6.5和8.0下的热稳定性都高于pH值为5.0下的热稳定性｡3讨论本研究以产耐热木聚糖酶的嗜热真菌T. lanuginosus DSM10635为实验材料,克隆了其木聚糖酶基因xyl并进行了原核表达｡该木聚糖酶基因的编码序列含有588个碱基,共编码196个氨基酸｡从实验所得的结果我们可以看出,利用重叠延伸PCR的方法获得木聚糖酶1YNA的蛋白质编码序列是完全可行的,并且取得比较好的效果,这样做比用传统方法更容易获得编码序列｡传统方法获得具有内含子的基因编码区主要是通过提取mRNA再经过逆转录酶反应得到cDNA,这种方法有一定的弊端,首先提取mRNA的提取过程比较繁琐,最主要原因是提取液中目的mRNA的含量较少而且容易被广泛存在的RNA酶降解｡重叠延伸PCR以前多用于两个基因的连接(如融合蛋白)和蛋白质中间区域某个氨基酸的突变,此外还可以用于多个外显子的拼接｡陆长梅等[13]设计重叠延伸引物,从T. reesei QM9414基因组DNA中通过PCR方法获得4个外显子,然后再通过重叠延伸PCR 方法将4个外显子按顺序一个个拼接,通过8次PCR反应就成功获得了与GenBank上外显子序列完全一样的成熟xynⅢ的cDNA序列｡对于只含有少数内含子的基因,使用重叠延伸PCR的方法获得其蛋白质编码序列更具有优越性｡由于缺少蛋白质糖基化修饰过程,原核表达的木聚糖酶在氨基酸序列没有变化的情况下其热稳定性一般要比嗜热真菌产生的木聚糖酶热稳定性低｡本文的实验结果也证实了这个现象｡通过比较大肠杆菌重组表达的木聚糖酶1YNA与嗜热真菌DSM10635所分泌的原酶[3]发现,木聚糖酶1YNA的最适温度比原酶约低5℃,最适pH值差别不大,其他酶特性比较相似｡通过定点突变技术,本文对原核表达的木聚糖酶1YNA进行了单个氨基酸修改｡第11家族木聚糖酶的N端是基因突变位点较为集中的区域｡由于该区域结构较为松散,从蛋白质数据库文件PDB立体结构分析图能够观察到第4位的苏氨酸的羟基扰乱了N端肽链结构的完整性｡我们尝试改变第4位的苏氨酸为其他不同氨基酸,探讨木聚糖酶1YNA的热稳定性和N端结构的关联性｡木聚糖酶突变体(T4A,T4G,T4R)与1YNA比较,热稳定性已经发生了变化但相对变化不大,其中T4G导致酶的耐热性有变弱的趋势｡1YNA在pH值为5.0下60℃处理30 min后还剩余约70%的相对残留酶活,而T4A在相同条件下处理后相对残留酶活剩余约80%,T4R的相对残留酶活次之,为60%左右,T4G的相对残留酶活最低,只达到50%｡3种木聚糖酶突变体在pH值为6.5和8.0下的热稳定性也低于1YNA在pH 值为6.5和8.0下的热稳定性｡对本身已较耐热酶蛋白质的结构进行修改以期进一步提高其热稳定性是一个挑战｡本研究首次对耐热木聚糖酶1YNA进行了表达和基因修改,为今后进一步研究该耐热木聚糖酶打下了基础和指明了方向｡参考文献:[1] 毛连山,勇强,宋向阳,等.内切木聚糖酶的选择性纯化及酶解制备低聚木糖的研究[J]. 林产化学与工业, 2006, 26(1):124-126.[2] RANI D S,NAND K. Production of thermostable cellulase-free xylanase by Clostridium absonum CFR-702[J].Process Biochemistry,2000,36(4):355-362.[3] USTINOV B B,GUSAKOV A V,ANTONOV A I. Comparison of properties and mode of action of six secreted xylanases from Chrysosporium lucknowense[J]. EnzymeandMicrobial Technology,2008,43(1):56-65.[4] SINGH S,MADLALA A M,PRIOR B A. Thermomyces lanuginosus:Properties of strains andtheir hemicellulases[J]. FEMS Microbiology Reviews,2003,27(1):3-16.[5] XIONG H R,NYYSS?魻L?魧A,TURUNEN O,et al. Characterization of the xylanase produced by submerged cultivation by Thermomyces lanuginosus DSM10635[J]. Enzyme and Microbial Technology,2004,35(1):93-99.[6] 李东峰,周晨妍,白剑宇,等. 木聚糖酶融合基因的构建及其在大肠杆菌中的表达[J]. 食品与发酵工业,2007,33(11):39-43.[7] WANG Y R,ZHANG H L,HE Y Z. Characterization, gene cloning,and expression of a novel xylanase XYNB from Streptomyces olivaceoviridis A1[J]. Aquaculture, 2007, 267(1-4):328-334.[8] ROBERGE M,SHARECK F,MOROSOL R,et al. Characterization of active-site aromatic residues in xylanase A from Streptomyces lividans[J]. Protein Engineering,1999,12(3):251-257.[9] HUANG J L,WANG G C,XIAO L. Cloning,sequencing and expression of the xylanase gene from a Bacillus subtilis strain B10 in Escherichia coli[J]. Bioresource Technology, 2006, 97(6):802-808.[10] SRIV ASTA V A P,MUKHERJEE K J. Cloning,characterization,and expression of xylanase gene from Bacillus lyticus in EscherichiacoliandBacillussubtilis[J]. PrepBiochem Biotechnol,2001,31(4):389-400.[11] NASCIMENTO R P,COELHO R R R,MARQUES S,et al. Production and partial characterisation of xylanase from Streptomyces sp. strain AMT-3 isolated from Brazilian cerrado soil[J]. Enzyme and Microbial Technology,2002,31(4):549-555.[12] KULKARNI N,SHENDYE A,RAO M.Molecular and biotechnological aspects of xylanases[J]. FEMS Microbiol Rev,1999, 23(4):411-456.[13] 陆长梅,袁生,赵庆新.用Overlap-PCR法从Trichoderma reesei QM9414基因组DNA中克隆并表达木聚糖酶Ⅲ[J]. 生物工程学报,2004,20(5):764-769. [14] FENEL F,LEISOLA M,J?魧NIS J,et al. A de novo designed N-terminaldisulphide bridge stabilizes the Trichoderma reesei endo-1,4-β-xylanase II[J]. Journal ofBiotechnology,2004, 108(2):137–143.[15] MOERS K,BOURGOIS T,ROMBOUTS S,et al. Alteration of Bacillus subtilis XynA endoxylanase substrate selectivity by site-directed mutagenesis[J]. Enzyme and Microbial Technology,2007,41(1-2):85-91.[16] FENEL F,ZITTING A J,KANTELINEN A. Increased alkali stability in Trichoderma reesei endo-1,4-β-xylanase II by site directed mutagenesis[J]. Journal of Biotechnology, 2006, 121(1):102-107.[17] ROBERGE M,DUPONT C,MOROSOLI R,et al. Asparagine-127 of xylanaseA from Streptomyces lividans,a key residue in glycosyl hydrolases of superfamily 4/7:Kinetic evidence for its involvement in stabilization of the catalytic intermediate[J]. Protein Eng,1997,10(4):399-403.[18] XIONG H R,FENEL F,LEISOLA M,et al. Engineering the thermostability of Trichoderma reesei endo-1,4-beta-xylanase II by combination ofdisulphidebridges[J]. Extremophile,2004,8(5):393-400.[19] 周晨妍,李东峰,邬敏辰,等. 木聚糖酶XynⅡ的D37N突变､表达及酶学性质变化[J]. 生物加工过程,2008,6(3):62-67.[20] 杨浩萌,柏映国,李江,等. 木聚糖酶XYNB的N46D突变､表达及酶学性质变化[J]. 中国生物化学与分子生物学报,2006,22(3):204-211.。
pet22b质粒序列
pet22b质粒序列**一、介绍Pet22b质粒的基本信息**Pet22b质粒是一种广泛应用于基因工程研究的载体，来源于大肠杆菌（E.coli）。
它具有自主复制起始位点（ORI），能够在受体细胞中自主复制。
此外，Pet22b质粒还具有多个限制性内切酶切点，方便进行基因片段的插入和删除。
**二、分析Pet22b质粒的序列特点**Pet22b质粒的序列特点主要表现在以下几个方面：1.含有抗生素抗性基因：Pet22b质粒上携带有抗生素抗性基因，如氨苄西林抗性（AmpR）基因，便于筛选转化子。
2.具有多个选择性标记：Pet22b质粒上还可以携带其他选择性标记基因，如四环素抗性（TetR）基因、荧光素酶（Lux）等，便于对转化子进行鉴定。
3.拥有多种基因表达调控元件：Pet22b质粒上可以插入目的基因，并携带启动子、增强子等调控元件，实现对目的基因的表达调控。
4.兼容多种克隆策略：Pet22b质粒可以采用同源重组、限制性内切酶消化、PCR扩增等方法进行基因片段的插入。
**三、探讨Pet22b质粒在基因工程中的应用**Pet22b质粒在基因工程中具有广泛的应用，主要包括：1.基因表达：通过将目的基因插入Pet22b质粒，可以在受体细胞中实现目的基因的表达。
2.基因敲除：利用Pet22b质粒上的同源重组系统，可以实现基因的敲除。
3.基因编辑：通过将CRISPR/Cas9系统导入Pet22b质粒，实现对目标基因的编辑。
4.基因筛选：利用Pet22b质粒上的抗生素抗性基因，对转化子进行抗生素筛选，筛选出含有目的基因的细胞。
**四、总结Pet22b质粒的重要性**Pet22b质粒作为基因工程研究中重要的载体，具有自主复制、多种选择性标记、兼容多种克隆策略等优点，为基因研究者提供了便捷的工具。
在基因表达、基因敲除、基因编辑等领域发挥着重要作用，促进了基因研究的发展。
克隆和表达宿主全集
制品说明大肠杆菌经Ca2+处理后可摄取外源DNA (Plasmid、Phage DNA)，处于这种状态的细胞称作感受态细胞 (Competent Cells)。
在基因重组实验时，要经常使用感受态细胞进行转化操作，但制作稳定高效的感受态细胞却又十分困难。
尤其是在制作基因文库、重组质粒体以及进行亚克隆实验时，特别是在目的基因含量十分低的情况下，使用高效的感受态细胞显得十分重要。
TaKaRa对Hanahan的方法进行了改良，并制作出了高效的感受态细胞。
细胞种类1 高效常用宿主E. coli HB101E. coli HB101是基因重组实验起始时便十分常用的宿主菌。
其遗传性能稳定，使用方便，适合于各种基因重组实验。
2 α-互补性选择宿主E. coli JM109E. coli JM109在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13 phage载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM109 F'编码的lacZ△M15相结合，从而显示β-半乳糖苷酶活性(α-互补性)。
利用这一特性, 可以很容易鉴别重组体菌株。
因为具有F'质粒，除可用于制作基因库、进行亚克隆等之外，也可作为M13载体DNA的宿主，制备单链DNA。
3 E. coli DH5α在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和DH5α编码的lacZ△M15相结合，从而显示b-半乳糖苷酶活性(α-互补性)。
利用这一特性, 可以很容易鉴别重组体菌株。
DH5α可以用于制作基因库、进行亚克隆等。
由于DH5α具有deoR变异，可以作为较大质粒的宿主菌使用。
质量标准使用1 ng的质粒DNA进行转化时：100 ml Competent Cells/1 ng pUC19 plasmid转化时产生的菌落数 >1×108 transformants/1 mg pUC19 plasmidβ半乳糖苷酶、α-互补性的确认对E. coli Compatent Cells JM109/DH5α使用pUC19 DNA进行转化后，在含有100 mg/ml 的Ampicillin、0.2 mM的IPTG，40 mg/ml的X-Gal的L-琼脂平板培养基上，产生的白色菌落占总菌落数的1%以下。
融合表达载体 pET22b-SUMO-FGFR4的构建及其在大肠杆菌中表达条件的优化
融合表达载体 pET22b-SUMO-FGFR4的构建及其在大肠杆菌中表达条件的优化刘微;姚杨;马萧萧;邓裕宣;梅迪;刘磊;王会岩【摘要】目的：设计合成小泛素修饰物-成纤维细胞生长因子受体4（SUMO-FGFR4）基因，构建 pET22b-SUMO-FGFR4表达载体，并对其表达条件进行优化。
方法：采用 Overlap PCR 方法制备 SUMO-FGFR4融合基因，并连接到原核表达载体 pET22b 中，获得 pET22b-SUMO-FGFR4重组表达载体。
以乳糖为诱导剂，观察乳糖浓度、诱导时机、诱导温度、诱导时间和乳糖的添加方式等因素对SUMO-FGFR4蛋白表达量的影响，确定最佳诱导条件，并进行重组蛋白的可溶性分析。
结果：pET22b-SUMO-FGFR4表达的融合蛋白在相对分子质量40000处显示目标条带，并与 FGFR4抗体特异性结合。
融合蛋白在乳糖终浓度为1.0 g·L－1、诱导时间为3 h、诱导时机 A （600）值为0.8、诱导温度为37℃时表达量最高，乳糖的添加方式对 SUMO-FGFR4融合蛋白的表达量无明显影响。
乳糖作为诱导剂比传统诱导剂 IPTG 诱导 SUMO-FGFR4融合蛋白的表达量高7.5％，融合蛋白以包涵体形式为主。
结论：以乳糖作为诱导剂，成功表达了 SUMO-FGFR4融合蛋白，确定了融合蛋白的最佳表达条件。
%Objective:To design the small ubiquitin modification-fibroblast growth factor receptor 4 (SUMO-FGFR4) fusion gene and construct the expression vector pET22b-SUMO-FGFR4, to optimize the expression conditions. Methods:The SUMO-FGFR4 fusion gene was obtained by Overlap PCR and was connected to pET22b;the recombinant expression vector pET22b-SUMO-FGFR4 was obtained. The influence of lactose concentration, induction time,induction temperature,induction point and adding mode of lactose in the expressionlevels was observed,and the best induction condition was determined; then the solubility of recombinant protein was analyzed.Results:The SUMO-FGFR4 fusion protein was highly expressed,the molecular weight of the fusion protein was about 40 000 and it could bind with FGFR4 specific antibody.When the lactose concentration was 1.0 g·L-1 ,the induction time was 3 h,the induction temperature was 37℃,the value of A (600)was 0.8,the expression level was highest;but adding mode of lactose had no remarkable effect on the protein expression.The expression level of recombinant protein induced by lactose was higher than IPTG.SUMO-FGFR4 protein existed in a form of inclusion body.Conclusion:The SUMO-FGFR4 fusion protein is expressed successfully in this study while lactose is used as inducer and the best expression conditions are confirmed.【期刊名称】《吉林大学学报（医学版）》【年(卷),期】2016(042)004【总页数】6页(P642-647)【关键词】小泛素相关修饰物;成纤维细胞生长因子受体 4;重组融合蛋白类【作者】刘微;姚杨;马萧萧;邓裕宣;梅迪;刘磊;王会岩【作者单位】吉林医药学院检验学院生物技术教研室，吉林吉林 132013;吉林医药学院检验学院生物技术教研室，吉林吉林 132013;吉林医药学院检验学院生物技术教研室，吉林吉林 132013;吉林医药学院检验学院生物技术教研室，吉林吉林 132013;吉林医药学院检验学院生物技术教研室，吉林吉林 132013;吉林医药学院检验学院生物技术教研室，吉林吉林 132013;吉林医药学院检验学院生物技术教研室，吉林吉林 132013【正文语种】中文【中图分类】Q78;R73-3小泛素相关修饰物 (small ubiquitin-like modifier，SUMO)是由约100个氨基酸组成的保守多肽家族，作为融合标签和分子伴侣可提高重组蛋白的可溶性和稳定性[1]，有利于重组蛋白的正确折叠。
pet22b质粒序列
pet22b质粒序列
【最新版】
目录
1.质粒的概念及特点
2.pet22b 质粒的来源和结构
3.pet22b 质粒的应用领域
4.pet22b 质粒在我国的研究现状
正文
1.质粒的概念及特点
质粒（Plasmid）是一种裸露的、独立于细菌拟核 DNA 之外并具有自我复制能力的双链环状 DNA 分子。
质粒具有自主复制、传递和表达外源基因的能力，被广泛应用于基因工程领域。
2.pet22b 质粒的来源和结构
pet22b 质粒是一种常用的基因工程载体，来源于大肠杆菌（Escherichia coli）。
其结构主要包括复制起始位点（ori）、选择标记（如氨苄西林抗性基因）、多克隆位点（MCS）以及复制终止位点（ter）等。
其中，多克隆位点可用于插入外源基因，从而实现基因的克隆和表达。
3.pet22b 质粒的应用领域
pet22b 质粒在基因工程领域具有广泛的应用，包括基因克隆、表达、突变体筛选、基因敲除和基因敲入等。
此外，pet22b 质粒也可用于蛋白质工程、代谢工程和合成生物学等领域。
4.pet22b 质粒在我国的研究现状
我国科学家在基因工程领域已取得了显著的研究成果，其中包括对pet22b 质粒的研究和应用。
目前，我国已成功利用 pet22b 质粒实现了
多个基因的克隆和表达，为生物医药、生物农业和环境生物技术等领域的发展做出了重要贡献。
总之，pet22b 质粒作为一种重要的基因工程载体，在我国基因工程领域具有广泛的应用前景。
载体介绍
力的遗传单位，其本质是较小的核酸分子，大小范围在 1kb-200kb以上不等。
27
细菌质粒的一般生物学特性
1. 很多细菌中已发现； 2. 是独立于细菌染色体之外的辅助性遗传单位，基因组绝大
部分为双链环状DNA，不同质粒大小各异； 3. 大多数质粒的宿主范围较窄； 4. 已发展进化出多种机制以维持其在细菌宿主中的稳定的拷
30
质粒给宿主细胞的标记
1.氨苄青霉素 (Ampicillin ) 2.卡那霉素 (Kanamycin) 3. 四环素（Tetracycline） 4. 氯霉素(Chloramphenicol) 5. 链霉素（Streptomycin） 6. 潮霉素（Hygromycin ）
31
质粒的复制类型
据质粒DNA复制与宿主之间的关系分为： 1.“严紧型”复制控制的质粒(stringent plamid)：拷
18
噬菌粒载体的优点
1.具小分子量的共价、闭合、环状的基因基因组DNA，可克隆高达10 kb的外源DNA 2.有ampr 等基因作为选择记号 3.拷贝数高 4.存在多克隆位点,可克隆达10 kb的外源DNA 5.可用组织化学显色反应筛选重组子 6.具质粒复制起点，在无辅助噬菌体存在下，克隆外源基因可按质粒一样复制 7.有单链噬菌体复制起点，在有噬菌体辅助感染的宿主细胞中，可合成出单链DNA
特点
具有更小的分子量 （2686bp）和更高 的拷贝数（500700）。 具有多克隆位点
适于组织化学 方法检测重组 体
46
MCS
lacZ`
Ampr Ori
含四个部分：
1.来自pBR322的质粒复制起 点（ori）；
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
pET-22b(+)编号 载体名称北京华越洋生物VECT5200 pET-‐22b(+)pet22b载体基本信息别名: pET22b, p et 22b, p ET-‐22b(+)质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达表达水平: 高克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶载体大小: 5500bp5' 测序引物及序列: T7: 5'-‐TAATACGACTCACTATAGGG-‐3'3' 测序引物序列: T7t: 5'-‐GCTAGTTATTGCTCAGCGG-‐3'载体标签: N-‐pelB; C-‐His载体抗性: 氨苄备注: pET22b载体含有PelB信号肽序列， 能够将表达的目的蛋白定位在细胞外周质腔。
稳定性: 瞬时表达 Transient组成型: 组成型 Constitutive病毒/非病毒: 非病毒pet22b载体质粒图谱和多克隆位点信息pet22b载体简介pET-‐22b(+)载体携带有一个N端的pelB信号肽序列，能够将表达的目的蛋白定位于外周质腔，同时载体含有C端His标签。
载体的单一的多克隆位点见上面的环状质粒图谱。
注意：载体序列是以pBR322质粒的编码规矩进行编码的，所以T7蛋白表达区在质粒图谱上面是反向的。
T7 RNA聚合酶启动的克隆和表达区域在质粒图谱中也被标注了出来。
质粒的F1复制子是被定向的，所以在T7噬菌体聚合酶的作用下，包含有蛋白编码序列的病毒 粒子能够产生，并启动蛋白表达，同时蛋白表达将被T7终止子序列的作用下终止蛋白翻译。
pet22b载体序列ORIGIN1 ATCCGGATAT AGTTCCTCCT TTCAGCAAAA AACCCCTCAA GACCCGTTTA GAGGCCCCAA61 GGGGTTATGC TAGTTATTGC TCAGCGGTGG CAGCAGCCAA CTCAGCTTCC TTTCGGGCTT121 TGTTAGCAGC CGGATCTCAG TGGTGGTGGT GGTGGTGCTC GAGTGCGGCC GCAAGCTTGT181 CGACGGAGCT CGAATTCGGA TCCGAATTAA TTCCGATATC CATGGCCATC GCCGGCTGGG241 CAGCGAGGAG CAGCAGACCA GCAGCAGCGG TCGGCAGCAG GTATTTCATA TGTATATCTC301 CTTCTTAAAG TTAAACAAAA TTATTTCTAG AGGGGAATTG TTATCCGCTC ACAATTCCCC361 TATAGTGAGT CGTATTAATT TCGCGGGATC GAGATCTCGA TCCTCTACGC CGGACGCATC421 GTGGCCGGCA TCACCGGCGC CACAGGTGCG GTTGCTGGCG CCTATATCGC CGACATCACC481 GATGGGGAAG ATCGGGCTCG CCACTTCGGG CTCATGAGCG CTTGTTTCGG CGTGGGTATG541 GTGGCAGGCC CCGTGGCCGG GGGACTGTTG GGCGCCATCT CCTTGCATGC ACCATTCCTT601 GCGGCGGCGG TGCTCAACGG CCTCAACCTA CTACTGGGCT GCTTCCTAAT GCAGGAGTCG661 CATAAGGGAG AGCGTCGAGA TCCCGGACAC CATCGAATGG CGCAAAACCT TTCGCGGTAT 721 GGCATGATAG CGCCCGGAAG AGAGTCAATT CAGGGTGGTG AATGTGAAAC CAGTAACGTT 781 ATACGATGTC GCAGAGTATG CCGGTGTCTC TTATCAGACC GTTTCCCGCG TGGTGAACCA 841 GGCCAGCCAC GTTTCTGCGA AAACGCGGGA AAAAGTGGAA GCGGCGATGG CGGAGCTGAA 901 TTACATTCCC AACCGCGTGG CACAACAACT GGCGGGCAAA CAGTCGTTGC TGATTGGCGT 961 TGCCACCTCC AGTCTGGCCC TGCACGCGCC GTCGCAAATT GTCGCGGCGA TTAAATCTCG 1021 CGCCGATCAA CTGGGTGCCA GCGTGGTGGT GTCGATGGTA GAACGAAGCG GCGTCGAAGC 1081 CTGTAAAGCG GCGGTGCACA ATCTTCTCGC GCAACGCGTC AGTGGGCTGA TCATTAACTA 1141 TCCGCTGGAT GACCAGGATG CCATTGCTGT GGAAGCTGCC TGCACTAATG TTCCGGCGTT 1201 ATTTCTTGAT GTCTCTGACC AGACACCCAT CAACAGTATT ATTTTCTCCC ATGAAGACGG 1261 TACGCGACTG GGCGTGGAGC ATCTGGTCGC ATTGGGTCAC CAGCAAATCG CGCTGTTAGC 1321 GGGCCCATTA AGTTCTGTCT CGGCGCGTCT GCGTCTGGCT GGCTGGCATA AATATCTCAC 1381 TCGCAATCAA ATTCAGCCGA TAGCGGAACG GGAAGGCGAC TGGAGTGCCA TGTCCGGTTT 1441 TCAACAAACC ATGCAAATGC TGAATGAGGG CATCGTTCCC ACTGCGATGC TGGTTGCCAA 1501 CGATCAGATG GCGCTGGGCG CAATGCGCGC CATTACCGAG TCCGGGCTGC GCGTTGGTGC 1561 GGATATCTCG GTAGTGGGAT ACGACGATAC CGAAGACAGC TCATGTTATA TCCCGCCGTT 1621 AACCACCATC AAACAGGATT TTCGCCTGCT GGGGCAAACC AGCGTGGACC GCTTGCTGCA 1681 ACTCTCTCAG GGCCAGGCGG TGAAGGGCAA TCAGCTGTTG CCCGTCTCAC TGGTGAAAAG 1741 AAAAACCACC CTGGCGCCCA ATACGCAAAC CGCCTCTCCC CGCGCGTTGG CCGATTCATT 1801 AATGCAGCTG GCACGACAGG TTTCCCGACT GGAAAGCGGG CAGTGAGCGC AACGCAATTA 1861 ATGTAAGTTA GCTCACTCAT TAGGCACCGG GATCTCGACC GATGCCCTTG AGAGCCTTCA 1921 ACCCAGTCAG CTCCTTCCGG TGGGCGCGGG GCATGACTAT CGTCGCCGCA CTTATGACTG 1981 TCTTCTTTAT CATGCAACTC GTAGGACAGG TGCCGGCAGC GCTCTGGGTC ATTTTCGGCG 2041 AGGACCGCTT TCGCTGGAGC GCGACGATGA TCGGCCTGTC GCTTGCGGTA TTCGGAATCT 2101 TGCACGCCCT CGCTCAAGCC TTCGTCACTG GTCCCGCCAC CAAACGTTTC GGCGAGAAGC 2161 AGGCCATTAT CGCCGGCATG GCGGCCCCAC GGGTGCGCAT GATCGTGCTC CTGTCGTTGA 2221 GGACCCGGCT AGGCTGGCGG GGTTGCCTTA CTGGTTAGCA GAATGAATCA CCGATACGCG 2281 AGCGAACGTG AAGCGACTGC TGCTGCAAAA CGTCTGCGAC CTGAGCAACA ACATGAATGG 2341 TCTTCGGTTT CCGTGTTTCG TAAAGTCTGG AAACGCGGAA GTCAGCGCCC TGCACCATTA 2401 TGTTCCGGAT CTGCATCGCA GGATGCTGCT GGCTACCCTG TGGAACACCT ACATCTGTAT 2461 TAACGAAGCG CTGGCATTGA CCCTGAGTGA TTTTTCTCTG GTCCCGCCGC ATCCATACCG 2521 CCAGTTGTTT ACCCTCACAA CGTTCCAGTA ACCGGGCATG TTCATCATCA GTAACCCGTA 2581 TCGTGAGCAT CCTCTCTCGT TTCATCGGTA TCATTACCCC CATGAACAGA AATCCCCCTT 2641 ACACGGAGGC ATCAGTGACC AAACAGGAAA AAACCGCCCT TAACATGGCC CGCTTTATCA 2701 GAAGCCAGAC ATTAACGCTT CTGGAGAAAC TCAACGAGCT GGACGCGGAT GAACAGGCAG 2761 ACATCTGTGA ATCGCTTCAC GACCACGCTG ATGAGCTTTA CCGCAGCTGC CTCGCGCGTT 2821 TCGGTGATGA CGGTGAAAAC CTCTGACACA TGCAGCTCCC GGAGACGGTC ACAGCTTGTC 2881 TGTAAGCGGA TGCCGGGAGC AGACAAGCCC GTCAGGGCGC GTCAGCGGGT GTTGGCGGGT 2941 GTCGGGGCGC AGCCATGACC CAGTCACGTA GCGATAGCGG AGTGTATACT GGCTTAACTA 3001 TGCGGCATCA GAGCAGATTG TACTGAGAGT GCACCATATA TGCGGTGTGA AATACCGCAC 3061 AGATGCGTAA GGAGAAAATA CCGCATCAGG CGCTCTTCCG CTTCCTCGCT CACTGACTCG 3121 CTGCGCTCGG TCGTTCGGCT GCGGCGAGCG GTATCAGCTC ACTCAAAGGC GGTAATACGG 3181 TTATCCACAG AATCAGGGGA TAACGCAGGA AAGAACATGT GAGCAAAAGG CCAGCAAAAG 3241 GCCAGGAACC GTAAAAAGGC CGCGTTGCTG GCGTTTTTCC ATAGGCTCCG CCCCCCTGAC3301 GAGCATCACA AAAATCGACG CTCAAGTCAG AGGTGGCGAA ACCCGACAGG ACTATAAAGA 3361 TACCAGGCGT TTCCCCCTGG AAGCTCCCTC GTGCGCTCTC CTGTTCCGAC CCTGCCGCTT 3421 ACCGGATACC TGTCCGCCTT TCTCCCTTCG GGAAGCGTGG CGCTTTCTCA TAGCTCACGC 3481 TGTAGGTATC TCAGTTCGGT GTAGGTCGTT CGCTCCAAGC TGGGCTGTGT GCACGAACCC 3541 CCCGTTCAGC CCGACCGCTG CGCCTTATCC GGTAACTATC GTCTTGAGTC CAACCCGGTA 3601 AGACACGACT TATCGCCACT GGCAGCAGCC ACTGGTAACA GGATTAGCAG AGCGAGGTAT 3661 GTAGGCGGTG CTACAGAGTT CTTGAAGTGG TGGCCTAACT ACGGCTACAC TAGAAGGACA 3721 GTATTTGGTA TCTGCGCTCT GCTGAAGCCA GTTACCTTCG GAAAAAGAGT TGGTAGCTCT 3781 TGATCCGGCA AACAAACCAC CGCTGGTAGC GGTGGTTTTT TTGTTTGCAA GCAGCAGATT 3841 ACGCGCAGAA AAAAAGGATC TCAAGAAGAT CCTTTGATCT TTTCTACGGG GTCTGACGCT 3901 CAGTGGAACG AAAACTCACG TTAAGGGATT TTGGTCATGA GATTATCAAA AAGGATCTTC 3961 ACCTAGATCC TTTTAAATTA AAAATGAAGT TTTAAATCAA TCTAAAGTAT ATATGAGTAA 4021 ACTTGGTCTG ACAGTTACCA ATGCTTAATC AGTGAGGCAC CTATCTCAGC GATCTGTCTA 4081 TTTCGTTCAT CCATAGTTGC CTGACTCCCC GTCGTGTAGA TAACTACGAT ACGGGAGGGC 4141 TTACCATCTG GCCCCAGTGC TGCAATGATA CCGCGAGACC CACGCTCACC GGCTCCAGAT 4201 TTATCAGCAA TAAACCAGCC AGCCGGAAGG GCCGAGCGCA GAAGTGGTCC TGCAACTTTA 4261 TCCGCCTCCA TCCAGTCTAT TAATTGTTGC CGGGAAGCTA GAGTAAGTAG TTCGCCAGTT 4321 AATAGTTTGC GCAACGTTGT TGCCATTGCT GCAGGCATCG TGGTGTCACG CTCGTCGTTT 4381 GGTATGGCTT CATTCAGCTC CGGTTCCCAA CGATCAAGGC GAGTTACATG ATCCCCCATG 4441 TTGTGCAAAA AAGCGGTTAG CTCCTTCGGT CCTCCGATCG TTGTCAGAAG TAAGTTGGCC 4501 GCAGTGTTAT CACTCATGGT TATGGCAGCA CTGCATAATT CTCTTACTGT CATGCCATCC 4561 GTAAGATGCT TTTCTGTGAC TGGTGAGTAC TCAACCAAGT CATTCTGAGA ATAGTGTATG 4621 CGGCGACCGA GTTGCTCTTG CCCGGCGTCA ATACGGGATA ATACCGCGCC ACATAGCAGA 4681 ACTTTAAAAG TGCTCATCAT TGGAAAACGT TCTTCGGGGC GAAAACTCTC AAGGATCTTA 4741 CCGCTGTTGA GATCCAGTTC GATGTAACCC ACTCGTGCAC CCAACTGATC TTCAGCATCT 4801 TTTACTTTCA CCAGCGTTTC TGGGTGAGCA AAAACAGGAA GGCAAAATGC CGCAAAAAAG 4861 GGAATAAGGG CGACACGGAA ATGTTGAATA CTCATACTCT TCCTTTTTCA ATATTATTGA 4921 AGCATTTATC AGGGTTATTG TCTCATGAGC GGATACATAT TTGAATGTAT TTAGAAAAAT 4981 AAACAAATAG GGGTTCCGCG CACATTTCCC CGAAAAGTGC CACCTGAAAT TGTAAACGTT 5041 AATATTTTGT TAAAATTCGC GTTAAATTTT TGTTAAATCA GCTCATTTTT TAACCAATAG 5101 GCCGAAATCG GCAAAATCCC TTATAAATCA AAAGAATAGA CCGAGATAGG GTTGAGTGTT 5161 GTTCCAGTTT GGAACAAGAG TCCACTATTA AAGAACGTGG ACTCCAACGT CAAAGGGCGA 5221 AAAACCGTCT ATCAGGGCGA TGGCCCACTA CGTGAACCAT CACCCTAATC AAGTTTTTTG 5281 GGGTCGAGGT GCCGTAAAGC ACTAAATCGG AACCCTAAAG GGAGCCCCCG ATTTAGAGCT 5341 TGACGGGGAA AGCCGGCGAA CGTGGCGAGA AAGGAAGGGA AGAAAGCGAA AGGAGCGGGC 5401 GCTAGGGCGC TGGCAAGTGT AGCGGTCACG CTGCGCGTAA CCACCACACC CGCCGCGCTT 5461 AATGCGCCGC TACAGGGCGC GTCCCATTCG CCA//其他大肠杆菌表达载体：pBV221 ptdTomato pET-52b(+) pAmCyanpDsRed-Express2 pBV220 pCold-GST pColdS-SUMOpCold TF pCold IV pCold III pCold IIpCold I pE-SUMO pCold-ProS2 pBAD102/D-TOPOpBAD202/D-TOPO pACYC184 pBAD/Thio-TOPO pBad/Myc-His C pBad/Myc-His B pBad/Myc-His A pBad/His C pBad/His B pBad/His A pBAD-TOPO pET-23b(+) pET-23a(+)pET-23c(+) pET-23(+) pET-12b(+) pET-12c(+)pET-12a(+) pET-11b(+) pET-11a(+) pET-11c(+) pBad24 pQE-82L pQE-81L pQE-80LpQE-32 pQE-9 pQE-16 pQE-31pQE-60 pQE-70 pQE-40 pET-51b(+)pET-50b(+) pET-49b(+) pET-48b(+) pET-47b(+)pET-26b(+) pET-32a(+) pET-21b(+) pET-22b(+)pET-14b pET-16b pET-15b pET-19bpET-20b(+) pET-21d(+) pET-21c(+) pET-21b(+)pET-21a(+) pET-24a(+) pET-24d(+) pET-25b(+)pET-27b(+) pET-28a(+) pET-30a(+) pET-42a(+)pET-43.1c(+) pET-43.1b(+) pET-43.1a(+) pET-44a(+)pET-44c(+) pET-46 EK/LIC pET-37b(+) pTrcHis2 C pTrcHis2 B pTrcHis2 A pET303/CT-His pET302/NT-His pRSET-CFP pRSET-EmGFP pRSET-BFP pGFPuvpET300/NT-DEST pET301/CT-DEST pGEM-T pBad43pGEX-4T-3 pGEX-5X-2 pBlueScript SK(+) pG-Tf2pG-KJE8 pGro7 pET-SUMO pSE380pET-17b pET102/D-TOPO pCDFDuet-1 pMAL-p5xpTf16 pET-28c(+) pBluescript II SK(+) pET-30b(+) pSUMO pProEX HTc pProEX HTb pProEX HTa pKD3 pKD13 pKD46 pTYB1pTYB2 pTWIN2 pBluescript II KS(-) pTYB12pMAL-p5e pACYCDuet-1 pEGM-11ZF(+) pEGM-7ZF(+) PinPoint Xa-3 PinPoint Xa-2 PinPoint Xa-1 pSP73pSP64 pTWIN1 pTYB11 pTXB1pET-5b(+) pBad/gIII C pBad/gIII B pBad/gIII A pET-5a(+) pMal-p4X pMal-p2G pkk223-3pkk232-8 pCYB1 pEZZ18 pBAD18pMAL-c5x pMal-p2E pMal-p2X pET-44 EK/LIC pET-43.1 EK/LIC pET-41 EK/LIC pMal-c4X pTrcHis BpET-31b(+) pET-3b(+) pET-41a(+) pGEX-3XpGEX-4T-2 pETDuet-1 pGEX-4T-1 pTrc99apET-28b(+) pET-His pALEX a,b,c pACYC177pBR322 pKD4 pKD20 pMXB10pEcoli-6xHN-GFPuv pKJE7 pRSET B pGEX-KGpGEX-2T pRSFDuet-1 pCOLADuet-1 pTrcHis C pTrcHis A pET-41b(+) pET-42b(+) pET-3a(+) pGEX-6P-3 pGEX-6P-2 pGEX-6P-1 pGEX-5X-3 pGEX-5X-1 pGEX-2TK pRSET A pMal-c2GpMal-c2E pMal-c2X pRSET C pQE-30pET-45b(+) pET-44b(+) pET-42c(+) pET-41c(+) pET-40b(+) pET-33b(+) pET-39b(+) pET-32 EK/LIC pET-32 Xa/LIC pET-32c(+) pET-32b(+) pET-30 Xa/LIC pET-30 EK/LIC pET-30c(+) pET-29c(+) pET-29b(+) pET-29a(+) pET-24c(+) pET-24b(+) pET-24(+)pET-23d(+) pET-11d(+) pBad33。