变性梯度凝胶电泳及其在法医学中的应用

变性梯度凝胶电泳及其在法医学中的应用

变性梯度凝胶电泳及其在法医学中的应用

【关键词】变性梯度凝胶电泳；法医学应用

【中图分类号】r919．2

【文献标识码】b

【文章编号】1007—9297(20xx)02—0063—04

随着人类基因组计划的实施和迅速发展．人类基

因的神秘面纱已逐步揭开，越来越多的疾病或基因多

样性均与基因的突变有关。因此，对基因突变的筛选

或诊断无论对基础研究还是临床研究均具有重要意

义。近年来，一系列新的基因突变检测方法层出不穷

的同时，经典的方法也不断得到改进。其中。由fischer

和lerman[ ，2】创立的变性梯度凝胶电泳(denaturing gra— dient gel electrophoresis，dgge)历经多次改良，已发展成一类极具实用价值的常规突变检测技术．被广泛

应用于疾病的诊断或相关基因的筛查、人类基因多态

性分析、微生物种群研究等各个领域。

一

、dgge基本原理

dgge是利用dna的物理性质进行突变分析的。

其原理是基于待测dna 片段双螺旋的解链温度

(melting temperature。tm)。tm值由dna片段的碱基数目和碱基组成共同决定。主要引起低温解链区域解

链。当dna片段在变性剂(尿素和甲酰胺)浓度呈线

性梯度增加的凝胶中电泳时。起初双螺旋dna片段

以恒定的速率(由分子量决定)向前迁移，在抵达变性

效果相当于其tm值的变性剂浓度点时．双链dna开

始部分解链．部分解链后的dna分子呈分枝状使其

迁移速度极度减缓．几乎处于“停顿”状态。长度相同

但序列不同的dna片段。即使仅存在单个碱基改变。

也将影响邻近碱基间的相互作用．导致tm值的改变．

从而在不同的变性剂浓度点解链、“停顿”．这样dna

片段由于相同电泳时间内的不同位移而得以分离。

上述原理仅能检测dna片段中低温解链区存在

的序列差异或突变．而位于高温解链区的则无法检

出．因高温解链区解链的变性条件可使整个双链完全

解开导致序列依赖的凝胶迁移特性丧失。基于此．可

通过克隆或pcr方法在待检目的片段的5 端引入

3o 5o个gc碱基组成的寡核苷酸链．即gc—clamp。

使其成为片段中tm最高的区域，从而使目的片段高

温解链区解链时dna双螺旋不至于完全解链成单

链，极大增加dgge的突变检出率。[3]

变性梯度凝胶是有方向性的，据此可将dgge分

为两类：垂直dgge和平行dgge。垂直dgge的变

性剂梯度方向与电泳方向垂直，可用于确定同一dna

片段上不同的解链区域、优化样本的分离条件或分析

pcr产物的组成；平行dgge的变性剂梯度方向与电

泳方向一致，在所检测的dna解链区域和温度已知

的情况下可用于多个样本的同时分析。

二、dgge衍生技术

圈i t 曩

(一)恒定变性凝胶电泳(constant denaturant gel

electrophoresis，cdge)

由hovig等嗍(1991年)在dgge的基础上发展

而来．它是通过预试验或理论计算预先精确确定待测

dna片段的tm值后即采用相当于该tm值的单一变

性剂浓度的凝胶电泳．使不同的dna片段各自以不

同但恒定的速度迁移。cdge避免了化学变性剂梯度

的应用．且选择特定的最佳变性剂浓度可获得最好的

分辨效果。同时克服了dgge电泳时间长的缺点，使

其变得更加简单快速。但对含有多个解链区域的目的

片段需选择不同浓度的变性凝胶以提高检测效率。因

需事先精确确定待测片段的tm值。故该法主要用于

已知突变的检测。

【基金项目l 国家自然科学基金资助(no．30300399)

【作者简介l 黄代新(1969一)，男，湖北松滋人，博士，副教授，主要从事法医分子遗传学研究。

· 146 ·

(二)温度梯度凝胶电泳(temperature gradient gel

electrophoresis，tgge)

tgge凝胶中含有固定浓度的化学变性剂，在电

泳过程中．通过微处理器控制从凝胶的顶端到底端形

成一线性增加的温度梯度，以此取代dgge中的化学

变性剂浓度梯度。变性环境由凝胶中恒定浓度的变性

剂和温度梯度共同构成。[5,61由于无需制备变性梯度

胶，tgge较dgge更加简单稳定。但目前大多tgge

仪器所允许的温度范围为15℃～80℃ ，较大片段的

tm值会因接变性梯度凝胶电泳及其在法医学中的应用第2页

近8o℃从而增加了检测的困难。

(三)瞬时温度梯度凝胶电泳(temporal tempera—

ture gradient gel electrophoresis，ttge)

由日本学者yoshino等同于1991年建立．最初称为温

度掠扫凝胶电泳(temperature sweep gel electrophoresis，

tsge)，后改称为tyge。其原理类似于tgge，是在加

有一定浓度化学变性剂的聚丙烯酰胺凝胶电泳过程

中，使凝胶板的温度以恒定速度逐渐升高，从而在跑

胶的过程中形成一个温度梯度，这样整个凝胶中任何

位置的温度在任何特定的时间点都是相同的，但随着

时间的改变而变化。凝胶的温度条件可用相关软件

(如macmelt、winmelt软件等)从相应序列的理论解链曲线获得，而无需通过大量实验摸索。]~fge无需制备

变性梯度凝胶，随时间而调整温度也较tgge更易操

作．同时在不降低灵敏度的前提下．其分离范围更宽，

可检测长达lkb的片段。尤其是通过调节温度范围

(窄或宽)及升温速度可以很灵活地调节tyge的分离范围[81。

三、dgge的主要技术特点

作为常规突变检测技术．dgge具有以下优点：(1)

高检测率和灵敏度。对几百bp长的dna片段，使用

带gc—clamp的pcr—dgge技术．突变检出率接近

100％。在tgge中，一般2ram可对应0．6℃温差，而在

ti~ge中．每小时升温可控制为0．1℃ ．极小的tm值差异也可被检出，尤其适用于单碱基突变个体的筛查。

在含量方面，dgge的检测灵敏度可达1％。(2)检测片

段长，可达1 kb。但其最适分离范围为100～500 bp，随

着片段长度增加．其检出率相应降低。(3)简单快速。主

要电泳条件均由微处理器控制。如用bio—rad公司的

dcode突变检测系统最快可在2小时内检测64个样品。(4)可从凝胶中分离回收片段直接用于测序。当

然．该技术也存在一些不足之处：(1)实验之初需进行

计算机分析或预试验以确定最佳的分离条件。(2)使用

带gc—clamp的引物增加了实验费用。(3)gc含量较高

的片段用dgge不易分析。(4)制备精确的梯度凝胶需

法律与医学杂志20xx年第12卷(第2期)

要熟练的操作技巧及复杂的仪器设备。(5)仅能检测突

变的存在但不能确定突变类型，需进一步测序确定。

四、法医学应用

(一)在法医dna 分型中的应用

dgge及相关衍生技术高效率的突变检测能力使

其在法医dna多态性分型中具有极大的应用潜能。

1991年。burmeister等[91采用类似rflp的基因组

dgge(genomic dgge，gdgge)技术分析人类21号染色体长臂近侧区的序列多态性取得良好的效果。与

rflp不同的是，即使限制性内切酶消化后片段长度相同的消化产物gdgge也能分离。在蛋白遗传标记

的基因分型方面，1991年，johnson等【 ol用dgge技术成功检测出人类f一1一抗胰蛋白酶基因的所有主要等位

基因(m1ala、m1val、m2、m3、s和z)以及存在于内含

子3和4中的大量遗传多态性。次年，johnson等【l】1又用pcr—dgge技术尝试对abo血型进行基因分型．