变性梯度凝胶电泳及其在法医学中的应用

变性梯度凝胶电泳及其在法医学中的应用
变性梯度凝胶电泳及其在法医学中的应用
【关键词】变性梯度凝胶电泳；法医学应用
【中图分类号】r919．2
【文献标识码】b
【文章编号】1007—9297(20xx)02—0063—04
随着人类基因组计划的实施和迅速发展．人类基
因的神秘面纱已逐步揭开，越来越多的疾病或基因多
样性均与基因的突变有关。

因此，对基因突变的筛选
或诊断无论对基础研究还是临床研究均具有重要意
义。

近年来，一系列新的基因突变检测方法层出不穷
的同时，经典的方法也不断得到改进。

其中。

由fischer
和lerman[ ，2】创立的变性梯度凝胶电泳(denaturing gra— dient gel electrophoresis，dgge)历经多次改良，已发展成一类极具实用价值的常规突变检测技术．被广泛
应用于疾病的诊断或相关基因的筛查、人类基因多态
性分析、微生物种群研究等各个领域。

一
、dgge基本原理
dgge是利用dna的物理性质进行突变分析的。

其原理是基于待测dna 片段双螺旋的解链温度
(melting temperature。

tm)。

tm值由dna片段的碱基数目和碱基组成共同决定。

主要引起低温解链区域解
链。

当dna片段在变性剂(尿素和甲酰胺)浓度呈线
性梯度增加的凝胶中电泳时。

起初双螺旋dna片段
以恒定的速率(由分子量决定)向前迁移，在抵达变性
效果相当于其tm值的变性剂浓度点时．双链dna开
始部分解链．部分解链后的dna分子呈分枝状使其
迁移速度极度减缓．几乎处于“停顿”状态。

长度相同
但序列不同的dna片段。

即使仅存在单个碱基改变。

也将影响邻近碱基间的相互作用．导致tm值的改变．
从而在不同的变性剂浓度点解链、“停顿”．这样dna
片段由于相同电泳时间内的不同位移而得以分离。

上述原理仅能检测dna片段中低温解链区存在
的序列差异或突变．而位于高温解链区的则无法检
出．因高温解链区解链的变性条件可使整个双链完全
解开导致序列依赖的凝胶迁移特性丧失。

基于此．可
通过克隆或pcr方法在待检目的片段的5 端引入
3o 5o个gc碱基组成的寡核苷酸链．即gc—clamp。

使其成为片段中tm最高的区域，从而使目的片段高
温解链区解链时dna双螺旋不至于完全解链成单
链，极大增加dgge的突变检出率。

[3]
变性梯度凝胶是有方向性的，据此可将dgge分
为两类：垂直dgge和平行dgge。

垂直dgge的变
性剂梯度方向与电泳方向垂直，可用于确定同一dna
片段上不同的解链区域、优化样本的分离条件或分析
pcr产物的组成；平行dgge的变性剂梯度方向与电
泳方向一致，在所检测的dna解链区域和温度已知
的情况下可用于多个样本的同时分析。

二、dgge衍生技术
圈i t 曩
(一)恒定变性凝胶电泳(constant denaturant gel
electrophoresis，cdge)
由hovig等嗍(1991年)在dgge的基础上发展
而来．它是通过预试验或理论计算预先精确确定待测
dna片段的tm值后即采用相当于该tm值的单一变
性剂浓度的凝胶电泳．使不同的dna片段各自以不
同但恒定的速度迁移。

cdge避免了化学变性剂梯度
的应用．且选择特定的最佳变性剂浓度可获得最好的
分辨效果。

同时克服了dgge电泳时间长的缺点，使
其变得更加简单快速。

但对含有多个解链区域的目的
片段需选择不同浓度的变性凝胶以提高检测效率。

因
需事先精确确定待测片段的tm值。

故该法主要用于
已知突变的检测。

【基金项目l 国家自然科学基金资助(no．30300399)
【作者简介l 黄代新(1969一)，男，湖北松滋人，博士，副教授，主要从事法医分子遗传学研究。

· 146 ·
(二)温度梯度凝胶电泳(temperature gradient gel
electrophoresis，tgge)
tgge凝胶中含有固定浓度的化学变性剂，在电
泳过程中．通过微处理器控制从凝胶的顶端到底端形
成一线性增加的温度梯度，以此取代dgge中的化学
变性剂浓度梯度。

变性环境由凝胶中恒定浓度的变性
剂和温度梯度共同构成。

[5,61由于无需制备变性梯度
胶，tgge较dgge更加简单稳定。

但目前大多tgge
仪器所允许的温度范围为15℃～80℃ ，较大片段的
tm值会因接变性梯度凝胶电泳及其在法医学中的应用第2页
近8o℃从而增加了检测的困难。

(三)瞬时温度梯度凝胶电泳(temporal tempera—
ture gradient gel electrophoresis，ttge)
由日本学者yoshino等同于1991年建立．最初称为温
度掠扫凝胶电泳(temperature sweep gel electrophoresis，
tsge)，后改称为tyge。

其原理类似于tgge，是在加
有一定浓度化学变性剂的聚丙烯酰胺凝胶电泳过程
中，使凝胶板的温度以恒定速度逐渐升高，从而在跑
胶的过程中形成一个温度梯度，这样整个凝胶中任何
位置的温度在任何特定的时间点都是相同的，但随着
时间的改变而变化。

凝胶的温度条件可用相关软件
(如macmelt、winmelt软件等)从相应序列的理论解链曲线获得，而无需通过大量实验摸索。

]~fge无需制备
变性梯度凝胶，随时间而调整温度也较tgge更易操
作．同时在不降低灵敏度的前提下．其分离范围更宽，
可检测长达lkb的片段。

尤其是通过调节温度范围
(窄或宽)及升温速度可以很灵活地调节tyge的分离范围[81。

三、dgge的主要技术特点
作为常规突变检测技术．dgge具有以下优点：(1)
高检测率和灵敏度。

对几百bp长的dna片段，使用
带gc—clamp的pcr—dgge技术．突变检出率接近
100％。

在tgge中，一般2ram可对应0．6℃温差，而在
ti~ge中．每小时升温可控制为0．1℃ ．极小的tm值差异也可被检出，尤其适用于单碱基突变个体的筛查。

在含量方面，dgge的检测灵敏度可达1％。

(2)检测片
段长，可达1 kb。

但其最适分离范围为100～500 bp，随
着片段长度增加．其检出率相应降低。

(3)简单快速。

主
要电泳条件均由微处理器控制。

如用bio—rad公司的
dcode突变检测系统最快可在2小时内检测64个样品。

(4)可从凝胶中分离回收片段直接用于测序。

当
然．该技术也存在一些不足之处：(1)实验之初需进行
计算机分析或预试验以确定最佳的分离条件。

(2)使用
带gc—clamp的引物增加了实验费用。

(3)gc含量较高
的片段用dgge不易分析。

(4)制备精确的梯度凝胶需
法律与医学杂志20xx年第12卷(第2期)
要熟练的操作技巧及复杂的仪器设备。

(5)仅能检测突
变的存在但不能确定突变类型，需进一步测序确定。

四、法医学应用
(一)在法医dna 分型中的应用
dgge及相关衍生技术高效率的突变检测能力使
其在法医dna多态性分型中具有极大的应用潜能。

1991年。

burmeister等[91采用类似rflp的基因组
dgge(genomic dgge，gdgge)技术分析人类21号染色体长臂近侧区的序列多态性取得良好的效果。

与
rflp不同的是，即使限制性内切酶消化后片段长度相同的消化产物gdgge也能分离。

在蛋白遗传标记
的基因分型方面，1991年，johnson等【 ol用dgge技术成功检测出人类f一1一抗胰蛋白酶基因的所有主要等位
基因(m1ala、m1val、m2、m3、s和z)以及存在于内含
子3和4中的大量遗传多态性。

次年，johnson等【l】1又用pcr—dgge技术尝试对abo血型进行基因分型．
一次扩增即可成功检测6种主要基因型，同时还发现
了未曾报道过的o和b等位基因中包含的序列多态
性，在95个无关欧洲个体中共检出4个不同的o等
位基因和2个不同的b等位基因，从而使该系统的法
医学应用价值大为提高。

takahashi等【 21(1991年)在分析日本人群人类f-球蛋白基因5 侧翼区a 兀’rr串
联重复多态性时．以rna ：dna形成异源双链方式
采用dgge技术，除成功检出已报道的重复次数为5
和6的两个等位基因外．还检出了重复次数为7和第
5个重复单位中形成a／g替换的2个新等位基因。

chen等【 31(1994年)用tgge技术对hla—drb3第二外显子271bp的扩增片段采用35℃ ～7o℃ 的温度
梯度进行分析．在hla—drb3的4个等位基因
drb3*0101、"0201、*0202和"0301中可成功检出3 个同源双链片段．其中"0201和*0202因具有相同的
热稳定性无法区分，但可通过人工形成异源双链的方
法加以区分．证实了tgge技术是检测hla基因型
的有效手段。

steers等【 (1996年)用pcr—dgge技术
通过扩增分析rhd和rhce基因的第2、第5外显子
成功地从基因组dna实现了rh表型分型。

日本学者
matsuzaki—takada和mukaidat 5】通过精心设计引物和优化实验条件．采用pcr—dgge技术实现了在同一
凝胶板上同时进行红细胞血型mn、dufy和kidd以
及血清型gc的基因型分型。

mtdna多态性多表现为不同核苷酸的替换，故
pcr—dgge这种灵敏高效的突变筛选技术非常适于
mtdna的突变筛选或检测．对此已有较多的研究报道
r 7j。

利用dgge技术进行mtdna分析不仅可以同时
法律与医学杂志20xx年第l2卷(第2期)
进行多个样本的检测比对．而且还可应用于mtdna
异质性分析。

1999年，steighner等[181在评估pcr— dgge技术检测mtdna高变区l(hv1)序列多态性的可靠性时，所有设计的49对配对序列(每对仅存在
1个碱基差异)用该技术可全部有效加以区分。

次年．该研究小组又用dgge技术对253个随机个体的
mtdna hv1进行了分析，发现35个个体存在异质性，其中33个为单核苷酸异质，2个为二核苷酸异质，
进一步证实了mtdna异质性存在的普遍性，而且该
技术检测异质性的灵敏度高达1o~[19]。

(二)在法医病理学研究中的应用
法医病理学中dgge技术的应用相对较少。

1999
年，opdal等用pcr—ti’ge技术对158例婴幼儿猝
死综合征(sids)和97例正常对照的mtdna 3230～
3330nt区域进行分析．从4例sids中检出3个不同的
点突变(t3290c、t3308c和t3308g)．而对照组未检
出．同时发现这4例sids的mtdna d一环区碱基替换
率较高，提示mtdna的突变在部分sids中起作用。

nobel等用pcr—dgge技术对蓝藻和硅藻群
落的16s rdna进行研究，发现不同时间、不同环境的
水体或土壤，其蓝藻和硅藻群体的电泳图谱构成均不
相同，形成高度特异的“群落指纹”。

基于此，作者设计
课题将该技术引入法医学用于溺死的诊断研究，以期
建立一种特异性好、灵敏度高，既能定性诊断溺死，同
时又能提示溺死地点的全新的分子生物学鉴定方法，
且初步的研究结果较为理想。

五、展望
随着相关技术的发展，dgge技术也会不断发展，
其突变检测能力将进一步增强。

如gelfi等将tgge
与毛细管电泳结合建立了高度灵敏的温度梯度毛细
管电泳(temperature gradient capillary electrophoresis，
tgce)技术．并成功分析了囊性纤维化跨膜传导调节
蛋白(cyfr) 基因外显子17b 中的3个点突变
(r1066h、r1066c和f1052v)和外显子14a中的两个
多态性(v868v和t854t)。

此外，将荧光技术与dgge
结合的荧光多重复合dgge (fluorescent multiplexing
of denaturing gradient gel electrophoresis，fm—dgge) 技术(http：／／www．miraibio．com／pdf／tech／appnotes／mutation％ 20detection％20．pdf)可使具有多个解链区的多
个位点在同一凝胶上通过重复扫描进行分析，实现了
相对高通量、快速、灵敏的检测目标。

相信随着其检测
能力的不断提高，dgge技术定会在更多的领域发挥
更加重要的作用。

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