PCR技术发展与应用的研究进展
PCR技术用于基因治疗及研究的进展
分子生物学课程论文题目PCR技术用于基因治疗及研究的进展班别学号姓名成绩PCR技术用于基因治疗及研究的进展摘要PCR技术与分子克隆和DNA序列分析方法几乎构成了整个现代分子生物学的实验工作基础。
PCR技术使微量的核酸（DNA或RNA）操作变得简单易行，同时还可使核酸研究脱离活体生物。
PCR技术的发明是分子生物学的一项革命，极大地推动了分子生物学以及生物技术产业的发展。
[1]本文在简述PCR技术原理的基础上,综述了PCR在基因治疗和生物研究方面的概况。
关键词PCR技术聚合酶链式反应DNA体外扩增基因治疗1.前言1983年KaryMullis发明了一种特异性DNA体外扩增技术—聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）,是体外扩增DNA序列的技术.原来的PCR只能单纯扩增已知两端序列之间的DNA片段，现在可以扩增到已知序列两侧的未知序列，甚至可以扩增到序列未知的新基因。
PCR的模板也从原来要用的DNA发展到直接用RNA作为模板，即反转录PCR，这就使得从真核生物中扩增目的基因变得很容易。
PCR原本是一种定性的方法只能回答样品中有无目的基因存在，现在已经可以用来定量测定，即回答样品中原始模板的确切数目。
PCR扩增的片段也从原先只能扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的DNA片段。
PCR也从单纯用来扩增基因到能将两个以上的基因连接起来，省去了限制性内切酶消化和用连接酶连接的步骤，这就是所谓的克隆PCR。
再加上PCR方法与其他方法联合应用，到目前为止已报道的PCR方法有几十多种之多。
PCR技术建立以来，在20多年的时间里发展很快，已有一系列PCR方法被设计出来，并广泛应用于遗传学、微生物学乃至整个生命科学的研究中。
PCR技术的出现极大地推动了分子生物学的发展。
[2]由于PCR技术的实用性和极强的生命力，PCR方法还将会被不断完善，进一步在生命科学研究中发挥更大的作用。
实时荧光定量PCR的研究进展及其应用
实时荧光定量PCR的研究进展及其应用一、本文概述实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative PCR，简称qPCR）是一种在分子生物学领域广泛应用的分子生物学技术，它能够在PCR 扩增过程中实时监测反应产物的积累，从而精确地定量目标DNA或RNA的初始浓度。
自20世纪90年代诞生以来，qPCR技术以其高灵敏度、高特异性、快速性和定量准确等优点，在基因表达分析、病原体检测、基因型鉴定、基因突变分析、药物研发等多个领域发挥了重要作用。
随着技术的不断发展和完善，实时荧光定量PCR已成为现代生物学研究中不可或缺的工具。
本文旨在全面综述实时荧光定量PCR技术的最新研究进展，包括其原理、方法、技术优化、应用领域的拓展以及面临的挑战等。
文章首先简要介绍qPCR技术的基本原理和常用方法，然后重点论述近年来在技术优化、多重PCR、数字化PCR等方向上的进展。
接着，本文详细探讨实时荧光定量PCR在基因表达分析、病原体检测、基因型鉴定、基因突变分析、药物研发等领域的应用案例和前景。
文章还将讨论实时荧光定量PCR面临的挑战，如引物设计、数据分析等问题，并提出相应的解决方案。
通过本文的综述，读者可以对实时荧光定量PCR技术的最新进展和应用有一个全面的了解，为相关研究提供参考和借鉴。
二、实时荧光定量PCR的基本原理与技术特点实时荧光定量PCR（Real-time Fluorescent Quantitative PCR，简称qPCR）是一种在PCR扩增过程中，通过对荧光信号的实时检测，对特定DNA片段进行定量分析的技术。
其基本原理是利用荧光染料或荧光标记的特异性探针，在PCR反应过程中实时检测PCR产物量的变化，从而得到DNA模板的初始浓度。
实时性：通过荧光信号的实时检测，可以实时了解PCR产物的生成情况，无需PCR结束后进行电泳等后续操作，大大缩短了实验时间。
定量性：通过标准曲线的建立，可以准确地计算出DNA模板的初始浓度，实现了PCR的定量分析。
最新PCR技术的发展和应用
TAIL-PCR 技术的基本原理是利用目标序列 旁的已知序列设计3 个嵌套的特异性引物 ( special prime, 简称sp1，sp2，sp3，约 20 bp), 用它们分别和1个具有低Tm 值的短 的(14 bp) 随机简并引物(Arbitrary degenerate prime 简称AD) 相组合, 以基因 组DNA 作为模板, 根据引物的长短和特异性 的差异设计不对称的温度循环, 通过分级反应 来扩增特异引物
巢式PCR可以增加有限量靶序列（如 稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了 困难PCR的特异性。
另外，如果大片断扩增错误，则小片 断错误扩增的概率很大。
锚定PCR（Anchored PCR）
以基因组总DNA 为起始材料, 用于克隆某一已知 片段的侧翼序列, 如分离某一基因的调控序列, 分 析T-DNA 或转座子插入突变体等。
第一次循环时，外引物的融合温度只能比没 有GC-clamp的引物稍高一点，在起始循环后， 由于GC- clamp已导入初级产物，因此以后 的融合温度可以提高。
由于采用了两种不同退火温度的引物，所以 巢式PCR的程序与普通PCR不同，整个程序 中某个阶段一些引物工作，另一些引物 “休 闲”，在另一阶段，“休闲”的引物开始工 作。
在设计引物时，必须使外引物的GC%含量高于 内引物，因而在一个含有不同引物的反应管中， 早期的PCR循环中，长引物在较高的温度下与 模板特异结合，此时内因物是被排斥的，因此 扩增产物是外长片段，在后期PCR循环时，由 于融合温度改变到只适于套组引物，外引物是 被排斥的，因此，此时的扩增产物是套组片段。 因此，巢式PCR的关键是引物设计，可以在外 引物5ˊ端增加多个GC钳子（GC- clamp）达到 扩增片断的目的。
实时荧光定量PCR技术及其应用研究进展
实时荧光定量PCR技术及其应用研究进展实时荧光定量PCR（Real-time fluorescent quantitative PCR，Real-time qPCR）是一种通过荧光信号实时测量PCR产物累积量的技术，可以在PCR反应过程中实时监测PCR 产物的数量。
这种技术结合了常规PCR技术的放大特异性和荧光标记探针的特异性探测，使得PCR分析更加准确、精确。
实时荧光定量PCR技术广泛应用于基因表达分析、病原体检测、细胞检测、突变分析等领域。
下面将分别介绍该技术在不同领域的应用研究进展。
在基因表达分析中，实时荧光定量PCR可用于测量特定基因在不同组织或不同发育阶段中的表达量。
该技术的灵敏度高、动态范围广，并可同时分析多个基因。
通过实时监测PCR产物的累积，可以获得准确的基因表达水平。
实时荧光定量PCR还可以用于研究非编码RNA的表达，如长非编码RNA（lncRNA）和微小RNA（miRNA）。
在病原体检测中，实时荧光定量PCR可用于快速、准确地鉴定和定量各类病原体。
各类病毒、细菌、真菌等的快速检测和定量分析。
由于实时荧光定量PCR具有高灵敏度和高特异性，能够在短时间内完成大量样本的分析，广泛应用于临床诊断和食品安全领域。
在细胞检测中，实时荧光定量PCR被用于检测细胞中的特定基因表达水平，并研究基因在细胞中的调控机制。
通过测量细胞内转录因子基因的表达变化，可以了解基因调控网络的变化情况。
在突变分析中，实时荧光定量PCR可用于检测某一基因的突变频率，如药物抗性相关基因的突变频率。
通过实时监测突变型和野生型基因的相对数量，可以计算出突变频率，为个性化药物治疗提供参考。
实时荧光定量PCR技术具有高灵敏度、高特异性、高准确度和高通量性等优点，在生命科学研究和临床应用中发挥着重要作用。
随着技术的不断进步和应用领域的不断拓展，实时荧光定量PCR技术在分子生物学领域的应用前景将更加广阔。
PCR技术推动了分子生物学领域进步
PCR技术推动了分子生物学领域进步PCR（聚合酶链式反应）技术是一种重要的分子生物学技术，它在分子生物学领域中具有广泛的应用。
PCR技术的出现和发展极大地推动了分子生物学领域的进步，为科学家们在基因组学、医学研究、疾病诊断和法医学等领域提供了强有力的工具。
PCR技术的推动作用体现在其在基因组学研究中的应用。
PCR技术通过放大DNA片段，使得科学家们能够更加准确地研究基因组的组成和功能。
在过去，科学家们在研究基因组时只能依赖于一些传统的技术，如限制性酶切的方法。
然而，这些方法往往需要较长的时间和大量的DNA样本，并且无法放大特定的DNA片段。
而PCR技术的出现改变了这一现状，它能够快速、精确地放大DNA片段，为基因组研究提供了便捷和高效的工具。
科学家们可以根据已知的DNA序列设计特定的引物，通过PCR技术扩增出感兴趣的DNA片段，进一步研究和解读基因组。
此外，PCR技术在医学研究和疾病诊断中的应用也十分重要。
PCR技术可以被用来检测和鉴定病原体，包括病毒、细菌和真菌等。
通过设计特异性的引物，科学家们可以利用PCR技术检测感兴趣的病原体，从而提高疾病的诊断准确性和效率。
这对于病毒性疾病、细菌感染和真菌感染等疾病的早期诊断和防治具有重要意义。
此外，PCR技术还可以被用于基因突变的检测和遗传性疾病的筛查，帮助科学家们更好地理解疾病的发生机制，并为疾病的治疗和预防提供参考。
PCR技术在法医学领域也有广泛的应用。
在犯罪侦查和案件调查中，DNA的信息十分重要。
PCR技术通过放大DNA 片段，使得科学家们可以从微量的DNA样本中提取足够的DNA片段进行分析。
这对于解决一些涉及个人身份鉴定、犯罪现场DNA分析以及遗失人口的身份确认等问题非常有帮助。
PCR技术的高灵敏度和高特异性使得DNA的检测和分析更加准确和可靠，为法医学和刑事司法领域提供了重要的技术支持。
总的来说，PCR技术的推动作用体现在其在基因组学研究、医学研究、疾病诊断和法医学等领域的广泛应用。
PCR技术的新进展
基因组学研究
基因组测序
PCR技术是基因组测序的关键步骤之一，用 于合成更长的DNA片段，提高测序的准确 性和覆盖率。
基因组编辑
基于PCR技术的基因组编辑技术如CRISPRCas9，能够实现对特定基因的敲除、插入 和修复，为遗传疾病治疗和农作物改良提供 可能。
05
pcr技术的未来展望
pcr技术的改进与创新
02
新一代pcr技术
数字pcr
数字PCR是一种高灵敏度和高特异性的绝对定量技术，通过将待测样本分成大量独立的反应单元，每 个单元中包含一个或多个起始分子，进行独立扩增，通过计数每个反应单元中阳性与阴性结果的个数 ，计算出待测样本中目标分子的数目。
数字PCR具有高灵敏度、高分辨率和高准确性的特点，能够检测单拷贝基因，适用于稀有基因变异、 低丰度基因表达以及突变负荷的检测等。
基因表达
PCR技术可用于检测基因在不同组织或发育阶段的表达情况，有助于理解基因在生命过 程中的作用。
基因突变研究
突变检测
PCR技术能够检测DNA序列中的突 变，包括点突变、插入和缺失等，为 遗传病研究和药物研发提供有力工具 。
突变定位
通过PCR扩增和测序，可以精确定位 突变位点，为遗传咨询和产前诊断提 供依据。
实时PCR是一种实时监测PCR扩增过程的检测技术，通过在 反应体系中加入荧光染料或荧光探针，利用荧光信号的变化 实时监测PCR扩增过程。
实时PCR具有高灵敏度、高特异性和可重复性强的特点，能 够实现自动化操作，广泛应用于基因表达分析、病原体检测 和基因突变研究等领域。
逆转录pcr
逆转录PCR是一种将RNA逆转录为 cDNA再进行PCR扩增的技术，用于 检测细胞或组织中特定基因的表达水 平。
pcr 国内发展现状
pcr 国内发展现状PCR（聚合酶链反应）是一种可以在体外复制和扩增特定DNA片段的分子生物学技术。
自1983年PCR技术被开发以来，它在许多领域的应用取得了巨大成功，如医学诊断、基因工程、体外复制等。
以下是PCR在国内的发展现状：首先，PCR在医学诊断领域的应用十分广泛。
例如，PCR可以用于检测各种病原体，如细菌、病毒和寄生虫。
临床上，PCR被广泛用于诊断肿瘤、传染病和遗传病等疾病。
通过检测特定的DNA序列，PCR可以提供高度敏感和特异性的诊断结果，有助于早期发现和治疗。
其次，PCR在农业科学中的应用也越来越重要。
PCR可以用于检测和鉴定农作物病害、害虫和转基因作物。
通过PCR技术，可以快速、准确地鉴定受感染植物或有害昆虫的存在，有助于保护农作物的质量和产量。
此外，PCR还可以用于育种和品种鉴定等农业研究领域。
此外，PCR在环境监测和食品安全领域也有广泛的应用。
例如，PCR可以用于检测水源中的细菌、寄生虫和病毒，以及环境中的重金属和污染物。
在食品安全方面，PCR可以用于检测食品中的潜在病原体和转基因成分。
这些应用可以提高环境和食品安全的监测能力，保护公众的健康和安全。
此外，PCR技术也在基础研究中发挥了重要作用。
例如，PCR 可以用于DNA测序、基因突变分析、基因表达研究等。
PCR 的快速、高效、准确的特性为基础研究提供了强有力的工具，推动了生命科学等领域的发展。
不过，尽管PCR技术在国内已经得到广泛应用，但还存在一些挑战。
首先，PCR技术的操作较为复杂，需要高度的专业知识和实验技术。
此外，PCR技术中的污染问题也需要重视，否则可能会导致假阳性结果。
另外，PCR技术的成本相对较高，限制了其在一些基层医疗机构和农村地区的应用。
总结起来，PCR技术在国内的发展已经取得了显著进展，广泛应用于医学诊断、农业科学、环境监测和基础研究等领域。
随着技术的不断进步和成本的降低，相信PCR技术的应用将进一步扩展，并在更多领域发挥重要作用。
分子生物学技术的研究进展及应用
分子生物学技术的研究进展及应用随着科技的不断进步和发展，分子生物学技术成为了人类研究生命学科的一大利器。
分子生物学技术通过对生物分子及其相互作用的研究，为解释生命现象及其发生机制提供了新的思路和方法。
分子生物学技术的应用涵盖了基础科研和应用领域的各个方面，如医学、农业、环境科学等，为人类提供了更好的生活品质。
1. PCR技术PCR技术是目前分子生物学领域最具代表性的技术之一。
PCR技术可以在短时间内扩增生物样本中的DNA序列，从而将其放大到足够的数量进行研究和分析。
PCR技术操作简便，准确性高，可用于研究基因的发生、发展、多态性和演化等过程。
除了在生物学领域中的广泛应用，PCR技术还常用于医学诊断、药物筛选等方面。
2. 基因芯片技术基因芯片技术是一种高通量的基因分析方法，可以同时识别和量化数百至数万个基因。
它基于表达谱学，通过对不同阶段基因表达的比较，实现基因的鉴定与分析。
基因芯片技术的应用范围非常广泛，包括癌症、心血管疾病、神经退行性疾病、肝病、肾病等多种疾病的基因诊断和治疗。
3. 基因编辑技术基因编辑技术是近年来兴起的一项分子生物学技术。
它可以修改细胞的基因序列，使其具有某种特定的性质或功能。
目前基因编辑技术最重要的平台是CRISPR/Cas9。
CRISPR/Cas9是一种靶向基因编辑工具，可以对任何基因进行编辑，而且精度较高。
基因编辑技术的应用涵盖了很多领域，如基因治疗、重要作物品种改进、疾病研究等。
4. 基因组学和蛋白质组学基因组学和蛋白质组学为解码生命信息提供了强大的工具。
基因组学研究的是组成基因组的DNA分子，而蛋白质组学研究的是蛋白质。
它们在各自领域里扮演着重要的角色。
例如，基因组学研究可以揭示生物的遗传信息，蛋白质组学则可以更深入地了解生物的功能和进化。
5. 二代测序技术二代测序技术是分子生物学领域的一项重要技术。
它可以快速地进行DNA测序，从而加速对生物结构和功能的理解和研究。
PCR技术的应用及其发展
PCR技术的应用及其发展王艺(哈师大生科院,哈尔滨,150025)摘要:聚合酶链式（PCR）反应技术是一项新发展起来的技术,具有特异性强、快【5.能在短时间内将所要的目的基因扩增至数万倍,扩增的过速、简便等很多优点】程类似于DNA的复制过程,其特异性依赖于靶序列两端的寡核苷酸引物,并且可通过基因的扩增获得目的片段,广泛应用于产品的检测、病毒的检测、细菌的检测、亲自鉴定性别等都具有划时代的意义.本文就PCR的应用和目前的发展状况做一综述.关键字：PCR技术；DNA；检测；应用；发展前言：PCR技术是20实际80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术,最初是为扩增已知序列设计的,打破了传统的DNA克隆方法,利用该技术能够从复杂的DNA分子群体中选择性的复制一段特异的序列,使某一DNA片段得到特异性的扩增.PCR技术有特异性高,灵敏度强,快速,简便等诸多优点,在生命科学飞速发展的今天,PCR技术已经成为分子生物学中的常规技术.如今的PCR技术已经发展到一定的阶段,人们常用这个技术运用于食品工业,医学,病毒检测,生物学研究等方面.并且在这些方面也得到了良好的应用.1PCR的原理PCR技术是1985年美国Cetus 公司发明的一种特异性的DNA 体外扩增技【9.首先合成两个小片段的寡核苷酸引物,长度一般在20bp左右,这两种引物分术】别与需要扩增的DNA片段的正链和负链的两端互补,将引物片段与需要扩增的DNA片段混合并加热使之变性,然后退火,这时引物片段和相应的DNA模板互补杂交,加入四种dNTP和DNA聚合酶进行DNA扩增,则完成了第一轮的循环,继之加热变性和退火,第一轮得到的DNA扩增链又作为第二轮扩增的模板再与引物杂交,进行第二轮扩增循环时犹豫引物和dNTP都是过量的,如果加入的DNA多聚酶是耐高温的,则在以后各轮反应不需加入任何试剂直到达到需要扩增的量为止.运用此方法可正在短时间内得到大量的DNA扩增片段,数量可达数万倍,2PCR技术的特性2.1操作简便应用PCR方法的早期阶段操作萦琐,因为使用的聚合醉是大肠杆菌DNA聚合酶I的大片段,即Klenow片段,而不是耐高温的TaqDNA聚合酶,而且操作也未实现自动化.目前使用的是耐高温的TaqDNA聚合酶,其操作也实行了电脑控制的DNA扩增仪的自动化,只要将扩增反应所需要的特定程序输入DNA自动扩增仪,把反应所需要的全部材料混合均匀,置入仪器内,反应就会按照所输入的正确程序进行.如果需要,还可随时予以调整.2.2灵敏度高PCR产物的生成,是以指数方式增加的,所以欲扩增pg量级的起始物到此水平成放大真核细胞单拷贝基因,通过PCR方法都是不难完成的.PCR方法还可用单一双倍体细胞,一根头发,甚至单一精子进行DNA定型.3.3 特异性强作为引物的寡聚核昔酸与模板结合的正确性是决定反应产物是否特异的关键.TaqDNA聚合酶耐高温的性质,使得反应中引物与模板退火的步骤可以在较高的温度下进行,结合的特异性大大增加,被扩增的目的DNA片段也能保持很高的正确程度.3.4 对原始材料的质量要求低由于PCR技术有高灵敏度和较强的特异性,故仅含目的基因的DNA,就可以作为反应起始材料来获取目的DNA扩增产物.4PCR技术的应用4.1PCR在食品行业检测PCR技术在食品科学中主要用于对食品中微生物含量的检测.众所周知,食品中微生物的检测涉及到人的健康,需要方便、准确、快捷的技术保障,传统方法检测食品中致病菌的步骤繁琐费时,需经富集培养、分离培养、形态特征观察、生理生化反应、血清学鉴定以及必要的动物试验等过程,并且传统方法无法对那些难以人工培养的微生物进行检测.如肉制品的检验,蛋白质鉴定技术已成功运用于鉴别生鲜肉类的品种,但当食品中的肉类已经经过切碎、混合、蒸煮、熏烤等加工烹调过程后,失去了原有的形态学特征和质地.进攻处理也会改变肉类蛋白质的结构和稳定性,从而破坏物种特有的蛋白质和抗原决定部位】【3.所以,蛋白质鉴定肉类品种的稳定性和可靠性较差,已不能满足现代肉类安全检测的要求.随着生物技术的发展,A.A. Aida 10【和Y .B. Che Man 】【11使用 PCR 技术建立了检测清真食品中是否含有猪肉或猪油的方法,物种特异性 PCR 技术可以用于清真食品的鉴定,是一种可以信赖和合适的技术.以物种间基因差异为基础的分子学鉴定方法成为研究的热点,而采用PCR 方法有特异性强,灵敏度高和可鉴别性的特点,已经成为肉质品种鉴别最常用的方法.4.2 PCR 在医学中的应用在临床医学方面也经常使用PCR 技术,如对乙肝病毒、肿瘤、病原体等的检测.如人类许多常见的肿瘤疾病与某些病毒病因及肿瘤相关基因的遗传学改变有着密切的关系.PCR 技术在肿瘤病毒病因、肿瘤相关基因、肿瘤相关抑癌基因等研究方面已取得可喜成果.同时也被用于多点突变的遗传病]1[.PCR 在法学中应用于亲子鉴定,血型鉴别,以及指纹鉴别等.如对痕量的血迹,无法用传统血清学的方法进行血型检验时,就可采用PCR 方法检验ABO 和MN 血型.对某些犯罪现场的生物材料的检定将为法医提供可靠有效的依据及直接、高效率的数据. DNA 技术鉴定进行取证主要应用在以下刑事民事案件中】【6.4.3 PCR 在应用水中的检测1990 年,Bej et al 】【7在利用多重 PCR 的方法检测了 Leg-ionella 类菌种和大肠类细菌 ,其结果是通过点对点方法固定的多聚 dT 尾捕捉探针和生物素标记的扩增 DNA 进行杂交来检测的.而对于水中得而大部分细菌,通常采用分离培养来鉴定它们弄得种类和数量,但是分离方法和培养基的选项额是限制检测效率的问题所在,使得一部分细菌由于不能在人工培养基上生长,使得鉴定的细菌种类和数量低于环境中的实际值】【2.因此运用PCR 技术可对水体进行直接检测,缩短检测时间,扩大检测范围,并且具有较高的精确度.同时也可以反映水环境中微生物病原体的种类及多样性.4.4 PCR 技术在非生物学中的应用DNA 的初级结构核苷酸序列具有极丰富的信息含量,利用 PCR 扩增,可以从非常少的DN A原始材料中获取信息,使之在作为商业产品的亚显微标志或标志物方面用途广泛. 例如在对伪造产品的检测, 污染源的追踪调查等方面, 都可通【4.过PCR来鉴定】PCR技术的问世成了生物学界的一个热点, 特别在分子生物学和人类遗传学等研究领域. 该技术能直接、富于针对性且高效率地提供数据, 还能得到离散的等位基因数据并正确地确定DNA 类型的基因型. 此外, 还可用于遗传图谱构建、器官移植的组织类型鉴定, 检测转基因动植物中的植入基因等领域, 它使人类基因重组成为可能. PCR的应用前景还使研究现已灭绝的动物及在过去几百年间收集的物种的群体遗传成为可能. 科学家们还在继续尝试扩增来自更稀有、更陌生样品的序列. 总之, PCR 作为一项“革命性的新技术”不仅推动分子生物学及相关学科的发展, 而且为相应的产业提供一片“天空”, 将在商业领域中占有重要领地.5 PCR技术的发展PCR技术创立之初,使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Kloonw 大片段,它有两个缺点:一是大于59℃时完全失活,需在每轮反应中添加新酶;二是催化反应须在73℃下进行,模板与引物间的碱基错配效高,即特异性较差.近几年PCR技术又在引物设计,使用标记等方面取得了一系列引人注目的新进展.PCR作为一项“革命性的技术”,不仅推动了遗传与分子生物学的发展,而且在其它领域科学家的努力与创新下,其不断与该领域的核心技术相结合,极大地推动了此领域的发展.并且PCR技术从问世便成为生物学界的一大热点.传统PCR 技术以及衍生出来的新型PCR 技术自面世以来,已被广泛应用到生命科学的各个领域.随着技术方法的不断改进与完善,荧光定量PCR 技术将会逐渐完善并广泛应用.多重PCR 技术在食品病原微生物、非致病微生物及环境微生物检测中的应用；PCR技术在食品、医学、以及其他方面的应用都具有重【8.未来的研究主要集要的作用.在高通量的生物免疫检测方面具有广泛的应用】中在去除食品抑制因子干扰改进样品前处理技术等方面,其次是整合应用多重PCR与其他技术,必将在未来食品微生物检测中有非常好的应用前景.参考文献【1】陈尚武.不同种类的PCR 技术及其应用[J].贵阳医学院校报．1993.14(3);113-116【2】丁清波戴浩吴敬波方东明. FQ-PCR技术在饮用水生物学监测中的应用. 黑龙江环境通报. 2009.12(4).【3】刘帅帅，李宏，罗世芝，刘云国. PCR技术在肉类掺假检验中的应用进展.食品安全质量检测学报. 2011,12(6)【4】刘怀如, 张桂萍. PCR技术的应用及前景展望. 泉州师专学报( 自然科学).1999.11(6).【5】王华, 刘斌. PCR技术在食品微生物检测中的应用. 生物技术通报.2010.(2)【6】赵铁军,贾天军,王德宝.DNA检验在法医学中的应用及发展[J].张家口医学院学报,2003(5):64～68.【7】谢海燕. 黑线仓鼠LHR部分序列克隆及组织器官的表达差异[D].曲阜：曲阜师范大学，2011.【8】林虹君，张爱红，蔡耘，等. 电感偶合等离子体质谱(ICP-MS)在蛋白质绝对定量中的应用[J]. 生命的化学，2009,9:153-157.【9】常世敏.PCR 在食品微生物检测中的应用[J].邯郸农业高等专科学校学报，2004，21（4）：23-25.【10】AIDA A A，CHE MAN Y B，WONG C M V L，et al．Analysis of raw meats and fats of pigs using polymer-ase chain reaction for Halal authentication ［J］．MeatScience，2005，69( 1) : 47-52．【11】Y B CHE MAN，A A AIAD，A R RAHA，et al．Iden-tification of pork derivatives in food products by spe-cies-specific polymerase chain reaction ( PCR) forhalal verification［J］．Food Control，2007，18 ( 7) :885-889．。
pcr的基本原理应用和发展
PCR的基本原理、应用和发展前言聚合酶链反应（PCR）是一种常用的分子生物学技术，它在基因分析、疾病诊断和法医学等领域具有广泛的应用。
本文将介绍PCR的基本原理，以及它在不同领域中的应用和未来的发展前景。
1. PCR的基本原理PCR是一种体外扩增DNA序列的技术，它利用DNA聚合酶酶在适当的条件下，通过反复复制DNA序列，从而扩增特定的DNA片段。
PCR的基本原理包括以下几个步骤：•变性（Denaturation）：将PCR反应体系中的DNA加热至高温，使DNA双链解离为两条单链。
•退火（Annealing）：降温时，引入特定的引物（primers），使其与目标DNA序列的两端互补结合。
•延伸（Extension）：在适当的温度下，加入DNA聚合酶酶，使其在引物的引导下，在目标DNA序列上进行合成DNA。
以上这个过程将被重复多次（通常为30-40次），每次循环都会使目标DNA的数量翻倍，从而实现目标DNA序列的扩增。
2. PCR的应用2.1 基因分析PCR在基因分析领域中广泛应用。
它可以用于鉴定特定基因的存在与否，从而确定物种的遗传关系。
此外，PCR还可以用于检测基因突变、获得基因重组产物等。
2.2 疾病诊断PCR在疾病诊断中是一种快速、准确的工具。
例如，PCR可用于检测病原体的存在，如病毒、细菌等。
此外，PCR还可以用于检测人体内的特定基因变异，从而为疾病的早期诊断提供依据。
2.3 法医学PCR在法医学中也得到了广泛应用。
通过PCR技术，可以从犯罪现场提取到微量的DNA，然后进行扩增和分析，从而帮助解决犯罪案件。
2.4 其他领域的应用除了以上三个领域，PCR还在许多其他领域得到了应用。
例如，PCR可用于农业领域进行植物基因的改良，也可以用于环境科学领域中对微生物的研究。
3. PCR的发展前景PCR技术的不断发展为科研和医学的发展带来了巨大的帮助。
未来，我们可以期待PCR技术在以下方面的进一步发展：3.1 快速检测目前的PCR技术需要相对较长的时间才能得到结果。
PCR技术的应用
pcr技术的原理
• 在高温下，DNA双链会解开成为 单链；在适中的温度下，引物与 单链DNA结合；在低温下，DNA 聚合酶开始延伸引物，并合成新 的DNA链。经过多次循环，DNA 片段可以得到大量复制。
02
pcr技术在医学领域的应用
遗传疾病的诊断
遗传疾病的诊断
PCR技术可以用于检测和诊断遗传性 疾病，如囊性纤维化、镰状细胞贫血 等。通过对特定基因的扩增和检测， 可以快速准确地诊断遗传疾病。
生物样本保存
PCR技术可以用于长期保存生物样本，以便 未来进行DNA分析。这有助于保持证据的 新鲜度和有效性。
生物证据的保存与分析
要点一
证据完整性
PCR技术可以检测生物样本中的微小DNA片段，确保证据 的完整性。这对于确保法庭上的公正审判至关重要。
要点二
快速分析
PCR技术具有高度敏感性和特异性，可以在短时间内完成 DNA分析，加快案件的解决速度。
病原体耐药性分析
细菌耐药性分析
PCR技术可以用于检测细菌的耐药性基因，帮助医生了解病原体对不同抗生素 的敏感性，从而选择更合适的抗生素进行治疗。
病毒变异分析
PCR技术还可以用于检测病毒的基因变异，了解病毒的遗传特点和传播方式， 为防控病毒传播提供科学依据。
肿瘤诊断与治疗
肿瘤诊断
PCR技术可以用于检测肿瘤标志物和癌基因的扩增，辅助医 生进行肿瘤的诊断和分类。这有助于提高肿瘤诊断的准确性 和及时性。
基因突变研究
点突变
PCR能够特异性扩增DNA片段，通过 与野生型序列对比，发现并验证点突 变的存在。
突变筛查
利用多重PCR技术，可以对大规模样 本进行突变筛查，提高突变检测的灵 敏度和特异性。
pcr仪的原理应用及发展趋势
PCR仪的原理应用及发展趋势一、PCR技术简介PCR（聚合酶链反应）是一种用于扩增DNA序列的技术。
它通过重复序列的循环反应，在体外复制并扩增特定的DNA片段。
PCR技术是分子生物学领域中非常重要的工具，广泛应用于基因分型、疾病诊断、基因工程等领域。
二、PCR仪的原理PCR仪是PCR技术的重要设备，它通过控制温度和时间来实现PCR反应的各个步骤。
PCR仪主要由加热模块、温度控制模块和检测模块组成。
1.加热模块：PCR仪中的加热模块用于控制反应液的温度。
其工作原理是通过Peltier元件、热电偶和制冷装置等组件来实现。
2.温度控制模块：PCR反应需要经历一系列的温度变化，如变性、退火和延伸等步骤。
温度控制模块通过精确控制加热模块的温度，使PCR反应能够按照设定的步骤进行。
3.检测模块：PCR反应的结果需要进行检测和分析。
检测模块通常采用荧光检测技术或者电导率检测技术来实现PCR产物的定量和分析。
三、PCR技术的应用PCR技术的应用非常广泛，以下是一些主要领域的应用：•分子生物学研究：PCR技术可以用于在DNA水平上研究基因的表达、突变和功能等。
•医学诊断：PCR技术可以用于检测疾病相关基因的突变、病原体的检测和诊断等。
•法医学：PCR技术可以用于法医学领域的DNA分型、个体识别和犯罪现场物证鉴定等。
•基因工程：PCR技术可以用于构建重组DNA、基因克隆和基因编辑等。
四、PCR技术的发展趋势PCR技术在过去几十年中发展迅速，未来的发展趋势可以预见：1.快速PCR技术：传统PCR技术的一个瓶颈是反应时间较长，未来的发展方向之一是加快PCR反应速度，实现快速扩增。
2.高通量PCR技术：随着测序技术的快速发展，对PCR反应产物的高通量测序需求也在增加。
未来的PCR仪将更加关注样品处理的自动化和高通量化。
3.实时PCR技术的发展：实时PCR技术可以实时监测PCR反应的进程，同时具备高灵敏度和高特异性。
未来的PCR仪将更加注重实时PCR技术的发展和应用。
pcr技术应用研究进展(综述)2000字
目录一、概述二、PCR技术的发展历程三、PCR技术的原理四、PCR技术的应用及研究进展1. 医学领域2. 生物学领域3. 法医学领域4. 食品安全领域5. 环境监测领域五、PCR技术存在的问题及展望一、概述PCR（Polymerase Ch本人n Reaction）聚合酶链式反应技术是一种通过酶解反应，精确复制DNA片段的重要实验技术。
PCR技术的发明是生物学领域的重大突破，它不仅在基因工程、医学、生物科学等领域有着广泛的应用，也对人类社会的发展产生了重大影响。
二、PCR技术的发展历程PCR技术最早由美国生物化学家凯瑟琳·福尔和基里·穆利斯共同发明于1983年，他们首先提出了PCR的理论基础。
此后，美国科学家卡里·墨利斯在1985年发表了PCR技术的具体操作方法，从而为其在实验室中的应用奠定了基础。
随着PCR技术的不断改进和完善，其应用领域也不断扩展，成为现代生命科学中不可或缺的重要技术手段之一。
三、PCR技术的原理PCR技术是一种通过酶反应合成DNA的技术，其原理主要包括以下几个步骤：1. 双链DNA的变性：将待扩增的DNA双链在高温下变性，得到两条单链DNA。
2. 引物结合：将两个引物结合到待扩增的DNA的两条单链上。
3. DNA合成：通过DNA聚合酶的作用，使引物逐渐向前延伸，合成新的DNA链。
通过上述步骤，可以在短时间内迅速扩增出大量特定的DNA片段。
四、PCR技术的应用及研究进展PCR技术在医学、生物学、法医学、食品安全、环境监测等众多领域都发挥着重要作用，并且不断展现出新的应用前景。
1. 医学领域PCR技术在医学领域有着广泛的应用，如临床诊断、疾病预防、药物研发等方面。
利用PCR技术可以快速、准确地检测出病原体的存在，对临床诊断和治疗起到了重要的辅助作用。
2. 生物学领域在生物学领域，PCR技术被用于基因突变分析、基因表达分析、DNA 指纹鉴定等方面，为研究者提供了一种便捷、高效的实验手段，推动了生物学领域的发展。
转录组测序技术的应用及发展综述
转录组测序技术的应用及发展综述
随着科技的不断发展，转录组测序技术在研究生物生理学、病理学和
疾病机理等领域有着广泛的应用。
在过去的十年里，转录组测序技术已成
为研究生物基因组学的主流手段，对生物体遗传信息的解读、基因表达水
平的分析和基因调控关系的确定，都发挥着至关重要的作用。
转录组测序技术的基础是建立在质粒酶切末端（PCR）的发展之上的，该技术允许研究人员对基因组上的所有RNA的表达水平进行全面的测序分析。
这种技术的发展，使研究人员能够以非常高的通量获得准确的转录组
信息，进而推断基因组的进化和变异情况，并为生物体表达谱的研究提供
重要的线索，在癌症和其他复杂疾病的发病机制研究中发挥重要作用。
转录组测序技术已在各个领域大量应用。
现代的转录组测序技术可以
根据细胞表达产物的样本类型来分类，其中包括非编码RNA测序（ncRNA-seq）、清除测序（CLE-seq）、全转录组测序（WT-seq）、多次重测序（MRC-seq）等等。
这些技术在许多重要的应用领域发挥着重大的作用，
如食品安全评价、毒理学研究、精准医学研究等。
随着转录组测序技术的发展，越来越多的技术发展出来。
实时荧光定量PCR技术及其应用研究进展
实时荧光定量PCR技术及其应用研究进展实时荧光定量PCR技术（Real-time quantitative PCR，qPCR）是一种快速、精确、灵敏、特异的基因检测技本，广泛应用于医学、生物学、农业和环境学等领域。
本文将介绍实时荧光定量PCR技术及其原理、应用研究进展。
一、实时荧光定量PCR技术原理实时荧光定量PCR技术是通过荧光探针标记的PCR产物进行实时监测，利用荧光信号的强度反映靶基因的数量。
其基本原理是将荧光信号的增加与反应过程中的PCR产物数量成正比。
实时PCR技术相比于传统PCR技术具有以下优势：1. 高灵敏度：实时PCR技术可以检测到非常低浓度的DNA或RNA，通常可以达到几十个分子的水平。
2. 高特异性：通过设计特异性的引物和探针，可以避免非特异性扩增产生。
3. 快速性：实时PCR技术可以在几小时内完成PCR反应，相比于传统PCR技术更快速。
4. 定量性：实时PCR技术可以准确地测量靶基因的数量，比较不同样本中的基因表达量或拷贝数。
二、实时荧光定量PCR技术应用研究进展1. 医学领域在医学领域，实时PCR技术被广泛应用于病原微生物的检测与鉴定，包括细菌、病毒、真菌等。
利用实时PCR技术可以快速准确地检测到呼吸道病毒、肠道病毒、HIV等病原微生物，为临床诊断和治疗提供了重要依据。
实时PCR技术还可以用于检测肿瘤标志物、基因突变和表达水平的变化，为肿瘤的早期诊断和预后评估提供了重要手段。
2. 生物学领域在生物学领域，实时PCR技术被广泛应用于基因表达分析、基因型分析、基因突变检测等研究。
利用实时PCR技术可以快速准确地测量基因的表达水平，在研究基因调控、信号转导、分子途径等方面发挥了重要作用。
实时PCR技术还可以进行单细胞PCR分析，研究细胞在不同状态下基因表达的动态变化。
实时荧光定量PCR技术具有快速、精确、灵敏、特异的特点，广泛应用于医学、生物学、农业和环境学等领域。
随着PCR技术的不断发展和改进，相信实时PCR技术在基因检测领域将发挥越来越重要的作用，为人类健康、生物科学研究和环境保护等方面做出更大的贡献。
pcr发展历程
pcr发展历程聚合酶链式反应（PCR）是一种在分子生物学领域中广泛使用的技术，它可以从微量DNA样品中扩增目标DNA片段。
PCR的发展历程可以追溯到1980年代初。
1983年，开创性的研究者库里斯（Kary Mullis）首次提出了PCR的概念，并描述了PCR的基本原理。
他指出，PCR可以通过反复进行DNA的复制，在短时间内得到大量目标DNA分子。
1985年，库里斯和他的团队首次报告了一种有效的PCR方法，并应用于人类基因组计划的研究中。
这一突破性的发现引发了科学界对PCR技术的广泛关注。
随着对PCR的研究不断深入，科学家们开始改进PCR方法。
1988年，温肯普（Taq polymerase）酶被库里斯和他的同事们引入PCR体系中，它是一种可以在高温下稳定活性的DNA聚合酶。
1990年代，PCR技术逐渐成为分子生物学和遗传学等领域中的基础技术。
与此同时，一些改进的PCR方法相继被提出。
例如，逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）可以将RNA转录为DNA，并进行扩增。
实时荧光定量PCR（qPCR）使得可以实时监测PCR反应的进程，从而提高了PCR的精确性和灵敏度。
2000年以后，高通量测序技术的发展为PCR技术的应用带来了新的突破。
PCR的扩增产物可以用于测序，从而揭示了生物体内的DNA序列信息。
此外，德约尔（digital PCR）技术的出现，进一步提高了PCR的灵敏度和准确性。
总结起来，PCR技术在近几十年的发展中取得了巨大的突破。
它已经成为现代分子生物学中最重要的实验手段之一，广泛应用于基因组学、医学诊断、遗传研究等领域。
不断改进和创新使得PCR技术的应用范围不断扩大，为科学研究和医学诊断带来了许多便利和突破。
研究生课程PCR技术的新进展及其应用(共64张PPT)
Cloning (TA cloning)-Taq DNA Polymerase
OPTIMISING PCR – THE REACTION COMPONENTS
• Starting nucleic acid - DNA/RNA
Tissue, cells, blood, hair root,
saliva, semen Milestones of PCR
In this Lecture
Principle of PCR
PCR, the basics
Optimize the PCR and troubleshoot
Application of PCR
Reverse-Transcription PCR（反转录PCR〕 PCR cloning（PCR克隆技术〕 Real-Time PCR（实时定量PCR〕 History of PCR
COMPONENT
10 X PCR Buffer
VOLUME 5l
Final Concentration
1X
10 X dNTPs (2mM)
5l
200M
Forward and Reverse primer (10pmols/l)
MgCl2 (25mM)
DNA template
5l 5l
2l
1M (50pmols/50l)
e.g.Taq polymerase
• Oligonucleotides Design them well!
• Buffer
Tris-HCl (pH 7.6-8.0) Mg2+
dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
TITRATE YOUR Mg2+ CONCENTRATION!
分子生物学中的PCR技术发展历程
分子生物学中的PCR技术发展历程PCR技术（聚合酶链式反应）是分子生物学中的一项重要技术，它可以在极短的时间内复制一小段DNA序列，从而实现对DNA的分析和诊断。
PCR技术的发展历程大约可以分为三个时期：早期，中期和现代。
早期PCR技术最初由美国生物学家克里·穆利斯（Kary Mullis）在1983年首次提出。
他最初的研究目的是通过利用校正DNA序列来解决荧光中的误差。
然而，在1985年，他突然想到了一种新的DNA复制方法，这种方法可以使DNA复制得更快、更准确。
穆利斯最初的PCR反应仅仅包括三个步骤：加热、退火、增温。
这种方法虽然具有一定的实用价值，但是还远远无法满足实际需求。
近年来，其他研究人员则着手进行了大量的改进。
中期在PCR技术的中期，研究人员开始尝试改善PCR反应的速度和效率，从而进一步提高其应用价值。
这期间，一些关键性的技术革新发生了，包括模板DNA、试剂组合以及温度控制等方面。
模板DNA是PCR反应必不可少的一个组成部分，它为DNA 的复制提供了必要的信息。
有一些研究人员相信，通过改变模板DNA的性质，可以大大改善PCR反应的效率和精度。
例如，一些研究人员开始使用精选的单链DNA（ssDNA）作为PCR反应的模板，这种方法可以显著提高PCR反应的速度和精度。
试剂组合也是PCR反应的重要组成部分。
它包含了各种不同的酶、缓冲液和核苷酸，这些试剂可以协同作用，使PCR反应得到更好地推进。
在中期，研究人员不断改进试剂组合，以确保每个缺陷得到充分利用。
温度控制也是PCR反应的另一个关键因素。
在PCR中，必须在多个温度范围内控制反应体系。
这需要一种可靠的温度控制和反应环境控制机制。
由于这种需要，中期研究人员开始采用先进的技术来控制反应体系中的温度和密度。
现代现代PCR技术已经形成了一种较为成熟的技术体系，它主要包括自动PCR仪、PCR芯片、实时荧光PCR反应仪等。
这些技术具有经济实用、高通量、快速便捷等特点，大大拓展了PCR技术的应用领域。
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PCR技术发展与应用的研究进展摘要：聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)是最常用的分子生物学技术之一，通过变性、退火和延伸的循环来完成核酸分子的大量扩增．定量PCR技术是克服了原有的PCR 技术存在的不足，能准确敏感地测定模板浓度及检测基因变异等，快速PCR技术快速PCR在保证PCR反应特异性、灵敏性和保真度的前提下，在更短时间内完成对核酸分子的扩增．mRNA 差异显示PCR技术是在基因转录水平上研究差异表达和性状差异的有效方法之一．近年来已经开展了许多这三方面的研究工作，本文就定量PCR技术、快速PCR技术、mRNA差异显示PCR 技术作一综述，以便更好地理解及应用这项技术。
关键字：定量PCR；荧光PCR；快速PCR；DNA聚合酶；mRNA差异显示PCR聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)技术由于PCR简便易行、灵敏度高等优点，该技术被广泛应用于基础研究。
但是，由于传统的PCR技术不能准确定量，且操作过程中易污染而使得假阳性率高等缺点，使其在临床上的应用受到限制[1]。
鉴于此，对PCR产物进行准确定量便成为迫切的需要。
几经探索，先后出现了多种定量PCR (quantitative PCR，Q-PCR)方法，其中结果较为可靠的是竞争性PCR和荧光定量PCR(fluorescence quantitative PCR，FQ-PCR)。
随着生命科学和医学检测的不断发展，人们越来越希望在保证PCR反应特异性、灵敏性、保真度的同时，能够尽量缩短反应的时间，即实现快速PCR(Rapid PCR or Fast PCR)。
快速PCR技术不仅可使样品在有限的时间内可以尽快得到扩增，而且可以显著增加可检测的样品数量，显然，在大批量样本检测和传染病快速诊断等方面将会有重要的应用前景。
例如，快速PCR在临床检测中可大大加快疾病的诊断效率；在生物恐怖袭击时能有效帮助快速鉴定可疑物中有害生物的存在与否；同时，由于PCR已经渗入到现代生物学研究的各个方面，快速PCR的实现必然可以使许多科学研究工作的进展显著加快，最终影响到整个生物学发展的速度。
近年来，快速PCR技术得到了可喜的进展。
从聚合酶的改进、添加剂的开发以及热循环仪的革新创造三个不同途径上分别进行的研发表明。
生物的性状和生物对各种生物、理化及致病因子的应答，本质上都是基因在时间上或空间上选择性表达，即基因的差异表达的结果，因而，获取差异表达的基因信息，将有助于了解生物的生理变化和病理改变的分子机制[2]。
研究基因差异表达主要技术有：消减文库筛选、差异杂交、代表性差异分析、基因表达序列分析、电子消减技术[3]和mRNA差异显示PCR技术等(mRNA Differential Display PCR，简称DD-PCR[4] )。
迄今为止，上面的几种方法已成功地用于基因差异表达的研究。
尤其是mRNA差异显示PCR技术，虽然发明只有短短十几年，已经取得了令人瞩目的科研成果，原因是它具备需要总RNA 的量极少，不需要纯化的mRNA，操作简便、快速、灵敏等优点[5-8]，故已被许多生命科学实验室作为一种重要工具，应用于体内和体外差异表达基因的筛选，研究基因功能[9]。
现将定量PCR技术、快速PCR技术、mRNA差异显示PCR技术研究情况作一综述作简要综述。
1 定量PCR技术定量PCR（Polymerase Chain Reaction）技术有广义概念和狭义概念。
广义概念的定量PCR技术是指以外参或内参为标准，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，进行PCR起始模板量的定量。
狭义概念的定量PCR技术（严格意义的定量PCR技术）是指用外标法（荧光杂交探针保证特异性）通过监测PCR过程（监测扩增效率）达到精确定量起始模板数的目的，同时以内对照有效排除假阴性结果(扩增效率为零)。
广义概念下的定量PCR 技术可以分为五种类型：（1）外参法+终产物分析，是指样本与阳性参照在两个反应容器内反应。
这种类型没有对样本进行质控监测，易出现假阴假阳结果，没有监测扩增效率，定量不准。
（2）内参法+终产物分析，是指样本与阳性参照在一个反应容器内反应。
这种类型对样本进行质控监测，排除假阴结果，但是定量不准。
（3）外标法+过程监测，这种类型监测扩增效率，阳性样本定量准，但是无法排除假阴结果。
（4）内参法+过程监测，由于样本与阳性参照在一个容器内反应，用同样的Taq酶和反应参与物，存在竞争性抑制，起始模板量浓度高的反应会抑制起始模板量浓度低的反应，所以定量不准。
（5）外标法+过程监测+内对照，这种类型监测扩增效率，阳性样本定量准，同时排除假阴结果。
这种类型是应该提倡的。
1.1 竞争性PCR技术定量PCR技术是对传统PCR技术的进一步发展和补充，在定量过程中需借助各种形式的参照物。
参照物是一种已知含量的标准模板，按其是否与待测样品在同一反应体系中扩增而分为内参照和外参照。
鉴于PCR扩增过程中管与管之间的扩增效率存在差异，理想的定量PCR应该使用内参照。
竞争性PCR即是采用内参照的一种定量PCR方法，通过消除管间及样品间的变异，从而达到较为精确的基因定量[10]。
该方法是将待测基因与已知浓度的内参照模板在同一反应管中共同扩增，由于二者具有相同引物的结合位点并采用同一引物进行扩增，因此二者竞争引物、脱氧核苷酸以及DNA聚合酶，以致当一种模板量逐渐增加时，另一种模板的扩增产物就会逐渐减少。
两模板的扩增产物量可分别用以下公式表示：Y待测= X待测(1+E)n；Y内参照= X内参照(1+E)n，其中X待测为起始拷贝量；Y待测为扩增产物量。
由于在同一反应体系中扩增，两模板的循环次数n保持一致，如果使两者间的扩增效率E也相同，就存在如下关系：Y待测/Y内参照= X待测/X内参照。
当两模板的产物量相同时，则两模板的反应起始拷贝数相等，由此可对待测模板进行精确定量。
具体检测方法是将已知浓度的内参照模板倍比稀释后分别与恒定量的待测基因一起扩增，以参照模板的起始拷贝数为横轴，以两模板扩增产物量的比率为纵轴，作出标准曲线，纵坐标为1的点所对应的参照模板的起始拷贝数即为待测基因的拷贝数。
由上述定量原理可知，保持两模板扩增效率E的一致性是定量的关键，为此要求参照模板应与待测基因具有相似的大小及序列，相同的引物结合位点。
此外，参照模板还应在扩增后易于分离检测。
因此，对于竞争性PCR的研究重点主要集中在建立高效、稳定、可靠的模板方面，现已取得了较满意的结果[11-13]。
1．2 荧光定量PCR技术荧光定量PCR（RQ-PCR技术）是通过在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。
Ct值( cycle threshold，Ct )，即PCR扩增过程中扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数，它与模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，模板DNA量越多，荧光达阈值的循环数越少，即Ct值越小。
利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，因此只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
1.2.1 Taqman技术Taqman 技术由美国PE公司开发，现已广泛用于基因检测。
该技术的原理是利用Taq 酶的5’-3’外切酶活性，在传统PCR技术一对特异性引物的基础上增加了一条荧光双标记探针。
该探针可与上、下游引物之间的DNA模板序列特异性结合。
探针的5’端标以荧光报告基团，如FAM(62羧基荧光素)；3’端标以荧光淬灭基团，如TAMRA(62羧基四甲基诺丹明) 。
当探针保持完整时，两个基团的空间距离非常接近，构成荧光能量传递( FRET) 关系，5’端荧光报告基团发出的荧光信号被3’端淬灭基团吸收，使其不能被仪器检测。
当两个基团发生分离后，两者间的FRET关系被破坏，淬灭基团的抑制作用解除，报告基团的荧光信号便得到释放。
在PCR退火复性期，探针与DNA 模板特异性结合。
在PC R延伸阶段，Taq酶在引物的引导下，以四种脱氧核苷酸为底物，按碱基配对原则沿着模板合成新链，当移动至探针结合的位置时便发挥其5’-3’外切酶活性将探针降解成单核苷酸，使得荧光报告基团与淬灭基团分离，前者的荧光信号释放并被检测。
由此可见，每合成一条新链就有一个探针被裂解并释放出一个荧光信号。
根据这种关系，通过检测PCR反应液中的荧光强度，再经校正计算后即可得出初始模板的数量。
Taqman技术现主要用于病毒的定量分析，病原体的分型鉴定，基因的快速诊断分析[14-16]。
1.2.2 AmpliSensor 技术该技术与Taqman PCR的区别在于其采用的是复合探针。
一个探针上标以荧光报告基团，另一个探针上标以荧光淬灭基团，后者的5’端较前者多出7个碱基( GCGTCCC)。
两探针之间能因碱基互补而结合，此时两基团靠近而形成FRET结构，报告基团的荧光信号被淬灭基团吸收。
当两探针分开后，其间的FRET关系受到破坏，淬灭基团的抑制作用解除，报告基团的荧光信号得到释放。
在PCR扩增前需将该复合探针与一个半套式PCR引物连接，该引物的5’端应具有一段与长探针上多出的7个碱基互补的序列，以便DNA连接酶能将该引物与短探针连接。
扩增时该探针2引物复合物作为半套式引物掺入到模板，并释放出淬灭探针，使原有的FRET结构破坏，从而释放出报告基团的荧光信号，其强度与被扩增的模板数相对应。
Matera G等[17]用AmpliSensor技术对丙型肝炎病毒(hepatitis Cvirus HCV)的基因型进行检测，发现此方法具有很高的特异性，能准确检测待测标本中DNA的基因型和含量。
1.2.3 Lightcycler技术Lightcycler技术是Roche公司新近开发的一种PCR定量技术。
该技术的特点[18,19]也是将荧光报告基团和淬灭基团分别标记在两个不同的探针上，形成荧光探针和淬灭探针。
荧光报告基团标于探针的5’端，荧光淬灭基团标于探针的3’端，两探针能分别与模板同一条链中相邻的核苷酸序列进行杂交。
当探针游离时能检测到报告基团的荧光信号；如果反应体系中存在特异性模板，PCR复性阶段两探针即会与之杂交，此时两探针上的荧光报告基团和淬灭基团相距很近，形成FRET关系，前者的荧光信号被后者吸收，即发生荧光淬灭。
由于荧光淬灭的程度与被扩增的模板量相对应，因此可达到定量的目的。
Kearns AM等[20,21]报道，Light-cycler技术在对病毒DNA的快速分型和定量方面有特殊的优势。
1.2.4 Molecular beacon技术亦称分子信标技术是一种单链DNA 形成的发夹结构，在其一端有一报告基团，在另一端有一淬灭基团，当它形成发夹结构时，由于荧光报告基团与淬灭基团想互靠近，两者之间发生荧光信号能量共振转移( fluorescent resonance energy transfer FRET)，当热循环温度达到分子beacon的解链温度时，其构象改变，与模板结合而完全伸展成线性分子，使得FRET消失，报告基团发出荧光信号。