水溶性维生素检测分析的研究进展

水溶性维生素检测分析的研究进展作者：赵明明彭茂民周有祥等

来源：《湖北农业科学》2013年第23期

摘要：维生素是维持生命活动必不可少的一类有机化合物，摄入不足或过量均可导致机体功能障碍，因其易在烹调、加工过程中损失，因此分析和评价食品和营养保健品中的维生素含量将对指导人群科学摄取维生素具有重要参考价值。水溶性维生素多为强极性化合物，其检测难度较大，因此系统介绍了微生物法、分光光度法、高效液相色谱法等水溶性维生素的检测方法，并针对多种水溶性维生素联合检测的高效液相色谱法，从同时提取、分离以及检测等方面进行综述，以期为今后开展水溶性维生素的高通量快速分析提供借鉴和参考。

关键词：水溶性维生素；联合检测；高效液相色谱法

中图分类号：O657.7 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）23-5676-05

维生素是一类人体不能合成或合成量不足、必须直接或间接从食品中摄取的化合物，广泛存在于谷类、果蔬、肉禽及蛋类等动植物细胞中。根据其溶解性差异，分为水溶性维生素（Water-soluble vitamins，WSVs）和脂溶性维生素（Fat-soluble vitamins，FSVs）。WSVs通常指极性较大，易溶于水的一类维生素，包括B族维生素、生物素（H）和抗坏血酸（VC）等。现已知WSVs具备多种生理生化功能。例如：B族维生素是多种辅酶的组成成分，参与有机体中的糖、脂肪、蛋白质及核苷酸的合成代谢；VC作为强氧化剂参与了氨基酸羟化反应和去除自由基等过程。目前已建立了单一WSV的检测方法[1-3]，现行分析方法（国标、欧盟指令条例和AOAC标准等）多数为微生物法、分光光度法，但这类方法耗时、费力，已难以满足当前分析要求和发展趋势。基于色谱技术的分析方法准确、快速、重现性好等特点，目前已在WSVs上得到了应用，高通量WSVs检测方法已有报道，但由于WSVs结构各异，理化性质差异大，导致建立高通量的维生素前处理和检测方法难度较大，本研究将围绕相关进展进行评述，以期为开展相关工作提供参考。

1 微生物法

1889年Beijerinck首次发现酵母菌的生长与其生长环境中的某些营养成分存在对应关系，由Williams首次提出微生物测定维生素的构想，随后B族维生素的微生物法相继建立，并于20世纪50年代广泛地应用于食物、药剂和饲料等各类样品的分析[4-6]。尽管早期微生物法是分析WSVs的标准方法，但是该方法检测时间长、操作复杂，检测结果的相对不确定度达到±20%，而且还存在培养污染、菌株个体差异、样品基质影响菌株生长等[7]不确定性因素，导致方法重现性较差。基于上述原因，目前微生物法在常规WSVs分析中已基本淘汰。

2 光度法

光度法（Spectrophotometry）是继微生物法之后开发的一类方法，包括紫外分光光度法和分子荧光法等。这类方法一般是测定维生素或其衍生物在特定波长或激发光下的吸光度或发射光强度从而进行定性定量分析的一类方法。紫外分光光度法的操作简单、快速、取样量小、成本低、选择性强，但吸光度值易受样品基质的干扰。分子荧光法的灵敏度通常比紫外分光光度法高2～4个数量级，因此检出能力更强。例如，分子荧光法可用于VB1、VB2、VB6的联合

检测，最小检出浓度依次为12、9、10 μg/L[8]，但由于目标物结构相似，荧光光谱重叠，存在干扰，其稳定性和选择性有待提高。

3 高效液相色谱法

高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是根据化合物性质差异，在固定相和流动相中反复分配，依次进入检测器产生信号的一类方法。目前几乎所有的WSVs均可采用HPLC法分析，检出限最低可达ng水平。但由于WSVs理化性质各异，尽管同时分析多种WSVs具有分析效率高、检测成本低等优点，但其难度较大。现有多种WSVs分析方法详见表1。需要指出的是，WSVs的同时检出方法受到前处理、色谱条件和检测器等因素影响极大，现简述如下。

3.1 提取方法

提取方法直接决定HPLC法检测的灵敏度和准确度。由于WSVs极性较大，这使得采用极性较大的试剂同时提取多WSVs成为可能。由于WSVs存在游离态或者结合态两种，因此WSVs的同时提取根据样品不同略有差异。游离态WSVs通常采用水提取，而对于婴儿营养配方食品或维生素强化饮料等复杂样品，通常先用醋酸锌或高氯酸等试剂先沉淀样品中的蛋白质，然后采用乙酸铵-甲醇或者乙酸-水溶液提取；结合态WSVs通常被基质中的蛋白质或糖等化合物偶联或包裹[9]，因此在提取前常需采用硫酸、盐酸或蛋白酶、淀粉酶水解样品，将结合态的WSV转化为游离态的WSV，并结合固相萃取净化，获得待测液[10，11]。例如天然食品中的VB2主要以黄素单核苷酸（FMN）和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）与蛋白质结合的形式存在。因此，分析VB2时通常采用先水解再酶解的方法将其转化为游离态VB2后再分析；检测样品中VB6总量时，将磷酸化和游离状态的类维生素（吡哆醛、吡哆酮）转化为吡哆醇[12]。但不管是酸水解还是酶水解，效率均较低，且WSVs多以辅基、辅酶形式存在，酸消化虽然能释放出部分维生素的游离形式，但易损坏某些种类的结构，比如叶酸在酸性溶液中对热不稳定，泛酸虽在pH 5～7的水溶液中最稳定，但遇酸或碱则水解，因此酸解并不适合于多种WSVs的联合检测。

超声处理属于物理前处理方法，在高频声波（>20 kHz）作用下，在液体中可产生强化传质、空化以及发热等多种效应，不仅有助于样品分散，更有助于样品中的WSVs进入提取液。目前，超声处理的方法已广泛应用于药物检验，并列入《中国药典》中VC、VB1以及VB2的前处理方法[22]。而近10年，恒温（低温）超声的方法也总被用于WSVs的提取（表1）。另外，在前处理中，为避免部分WSVs发生氧化反应，常在提取过程中使用抗氧化剂，包括丁羟甲苯、硫代硫酸钠、EDTA等[13]。并在操作过程中要尽量避光，降低WSVs的光解率。

3.2 液相色谱分析

由于WSVs极性较强，使得开发多种WSVs同时分离的方法难度较大。目前报道的WSVs 液相色谱分析方法主要包括3类：化学键合相色谱、离子交换色谱和亲水作用色谱等。