实验一凝胶过滤层析分离蛋白质 ppt课件
凝胶过滤层析法分离纯化蛋白质
凝胶过滤层析法分离纯化蛋白质实验六凝胶过滤层析法分离纯化蛋白质一、实验目的1. 了解凝胶层析的原理及其应用。
2. 掌握利用凝胶层析法分离纯化蛋白质的实验技能二、实验原理凝胶层析又称凝胶过滤，是一种按分子量大小分离物质的层析方法。
该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲液洗脱。
大分子不能进入凝胶颗粒中的静止相中，只留在凝胶颗粒之间的流动相中，因此以较快的速度首先流出层析柱，而小分子则能自由出入凝胶颗粒中，并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡，因此就要花费较长的时间流经柱床，从而使不同大小的分子得以分离。
凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。
这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而对某些小分子化合物则不能排阻，但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。
任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数Kav（被分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示。
Kav值的大小与凝胶床的总体积（Vt）、外水体积（Vo）及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关，即：Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo) 在限定的层析条件下，Vt和Vo都是恒定值，而Ve值却是随着分离物分子量的变化而变化的。
分离物分子量大，Kav值小；反之，则Kav值增大。
Ve（洗脱体积）为某一成分从加入样品算起，到组分的最大浓度（峰）出现时所流出的体积。
Ve随溶质的相对分子质量的大小和对凝胶的吸附等因素而不同。
一般相对分子质量较小的溶质，它的Ve值比相对分子量较大的溶质要大。
通常选用蓝色葡聚糖2000作为测定外水体积的物质。
该物质分子量大（为200万），呈蓝色，它在各种型号的葡聚糖凝胶中都被完全排阻，并可借助其本身颜色，采用肉眼或分光光度仪检测（210nm或260nm或620nm）洗脱体积（即Vo）。
但是，在测定激酶等蛋白质的分子量时，不宜用蓝色葡聚糖2000测定外水体积，因为它对激酶有吸附作用，所以有时用巨球蛋白代替。
蛋白质化学中的层析技术PPT课件
THANK YOU
感谢聆听
蛋白质化学中的层析技术PPT 课件
目
CONTENCT
录
• 层析技术简介 • 层析技术在蛋白质分离纯化中的应
用 • 层析技术原理 • 层析技术的应用实例 • 层析技术的优缺点及展望
01
层析技术简介
层析技术的定义
层析技术
是一种分离和纯化混合物中各组分的方法，基于各 组分在固定相和流动相之间的分配差异进行分离。
05
层析技术的优缺点及展望
层析技术的优点
分离效果好
层析技术能够根据分子间的吸附、分配等作用力 的差异，将混合物中的组分进行有效的分离，得 到高纯度的产物。
适用范围广
层析技术可以应用于不同性质的混合物分离，如 有机物、无机物、离子、蛋白质等，具有广泛的 适用范围。
分离过程可重复
层析技术是一种物理分离方法，不涉及化学反应 ，因此分离过程可以重复进行，适用于大规模分 离和制备。
凝胶过滤层析原理
原理概述
凝胶过滤层析是一种基于分子 大小差异的分离技术。通过不 同孔径的凝胶介质，不同大小 的分子会以不同的速度通过凝 胶，从而实现分离。
应用范围
凝胶过滤层析常用于蛋白质、 多糖等大分子物质的分离和纯 化。
技术特点
操作简便、分离效果好、分辨 率高。
离子交换层析原理
01 02
原理概述
1950年代
随着凝胶技术的发展，凝胶层 析、电泳等新型层析技术逐渐 兴起。
1970年代至今
层析技术不断改进和创新，应 用范围越来越广泛，成为生物 化学领域中重要的分离分析方 法。
层析技术的分类
根据固定相和流动相的物理状态
可分为液相层析和气相层析。液相层析又可分为液-固层析和液液层析，是生物分子分离纯化中最常用的技术。
层析技术分离生物大分子(凝胶过滤)
层析凝胶的选择
1. 型号 根据实验目的不同选择不同型号的凝胶。
2. 凝胶用量计算
干凝胶用量（克）=
3.柱的直径与长度
πr2经验，组别分离时，大多采用20-30cm长的层析柱。
分级分离时，一般需要100cm左右长的层析柱，其直径在1-5cm 范围内，长度L与直径D的比值L/D一般宜在7-10之间.
2、装柱
取洁净的玻璃层析柱垂直固定在铁架台上。 在柱中加入洗脱液（约1/3柱床高度），将凝胶浓浆缓
慢倾入柱中，待凝胶沉积1cm-2cm高度后打开出水口， 流速一般用3-5mL/10min（预先恒流泵调好，记录流 速）。胶面上升到柱上端1cm处则装柱完毕。
注意装柱过程中凝胶不能分层。然后关闭出水口，静置片 刻，待凝胶完全沉降，则接上恒流泵，用1-2倍床体积的 洗脱液平衡柱子，使柱床稳定。
一、凝胶层析原理
凝胶是一种具有立体网状结构且呈多孔的不溶性珠状 的颗粒物质。用凝胶层析来分离生物大分子主要是根据多 孔凝胶对近似于球形不同半径的生物大分子具有不同的排 阻效应实现的。即是依据分子量的不同来进行分离的。
大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外，只 能沿着颗粒间的缝隙流出柱外；而小分子不被排阻，可自 由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，一些中等大小的分子 介于大分子和小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔 隙，即被部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介 于大、小分子之间。这样样品经过凝胶层析后，分子便按 照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。
5、数据处理：
以A280为纵坐标，t为横坐标画出蓝色葡聚糖和蛋白质混合样品
的洗脱曲线。（电脑画出）
注意：实验完毕后，将凝胶全部回收处理，以备下次实验使用，
严禁将凝胶丢弃或倒入水池中。
实验一凝胶过滤层析分离蛋白质PPT讲稿
• 制备：
• 将干胶颗粒悬浮于5 ~ 10倍的蒸馏水或洗脱液
中
• 充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去
3. 凝胶装柱
• ①柱固定于架子上，垂直放置，关住出口 • ②自顶部缓缓加入葡聚糖悬液，使G-50 开始下沉， • 至1 ~2cm时，打开出口 • ③凝胶逐层上升，至顶部 2-3cm时，关闭出口
名称
操作形式
柱层析法
固定相装于层析柱内，使样品沿着一个方 向前移而达分离的层析法，包括一般柱层 析法、毛细管层析法和微粒填充柱层析法
平面层析法 层析过程在固定相构成的平面层内进行的 层析法，包括纸层析法、薄层层析法和薄 膜层析法
（3）层析技术的优点
分离效率高 分析速度快 具有极高的灵敏度 应用范围广
注意点：
垂直放置 防止气泡产生 防止柱的分层
4. 平衡
• 放置一段时间，约40分钟（使凝胶更好的压实）
注意：
防止床面干涸，可适当补充蒸馏水
5. 加样
• ① 加样前打开出口，使床面的蒸馏水流出，正好
露
• 出床面时，立即关闭出口（将干未干） • ② 用滴管将混合样品(0.6ml，即血红蛋白和溶菌酶 • 各0.3ml)缓缓沿柱内壁小心加于床表面 • ③ 打开出口，使样品进入床内，直到床面重新露
出,
• 立即加入1~2倍于样品体积的蒸馏水
6. 洗脱
① 当此少量蒸馏水接近流干时，反复多次加入蒸
•
馏水，进行洗脱，直到两带分开
② 检查Hb在层析床中色带位置，待Hb洗脱完后，
•
用试管分步收集洗脱液
• ③ 10d/管，每管加NaOH 2d，CuSO4 2d • ④ 检查溶菌酶洗脱情况，若为紫色，则为（+）
不同分子量蛋白质的分离—凝胶过滤层析法
不同分子量蛋白质的分离—凝胶过滤层析法一、实验目的1. 了解凝胶柱层析的原理及应用。
2. 掌握凝胶柱层析的基本操作技术。
二、实验原理凝胶层析又称凝胶过滤，是一种按分子量大小分离物质的层析方法。
该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲液洗脱。
大分子不能进入凝胶颗粒中的静止相中，只留在凝胶颗粒之间的流动相中，因此以较快的速度首先流出层析柱，而小分子则能自由出入凝胶颗粒中，并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡，因此就要花费较长的时间流经柱床，从而使不同大小的分子得以分离。
凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。
这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而对某些小分子化合物则不能排阻，但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。
任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数Kav（被分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示。
Kav值的大小与凝胶床的总体积（Vt）、外水体积（Vo）及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关，即：Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo)在限定的层析条件下，Vt和Vo都是恒定值，而Ve值却是随着分离物分子量的变化而变化的。
分离物分子量大，Kav值小；反之，则Kav 值增大。
通常选用蓝色葡聚糖2000作为测定外水体积的物质。
该物质分子量大（为200万），呈蓝色，它在各种型号的葡聚糖凝胶中都被完全排阻，并可借助其本身颜色，采用肉眼或分光光度仪检测（210nm或260nm或620nm）洗脱体积（即Vo）。
但是，在测定激酶等蛋白质的分子量时，宜用蓝色葡聚糖2000测定外水体积，因为它对激酶有吸附作用，所以有时用巨球蛋白代替。
测定内水体积（Vi）的物质，可选用硫酸铵、N-乙酰酪氨酸乙酯，或者其它与凝胶无吸附力的小分子物质。
本实验使用血红蛋白（分子量64,500左右）和二硝基氟苯－鱼精蛋白（DNP－鱼精蛋白分子量12,000左右）的混合物，通过Sephadex G－25层析后达到分离。
凝胶过滤法使蛋白质脱盐
实验步骤
1 溶胀凝胶：用去离子水浸泡Sephadex G-25凝胶24h以
上或用去离子水沸水浴溶胀约2h。 2 凝胶装柱：将溶胀的凝胶轻缓倒入柱中，使其自然沉 降，沉降后凝胶柱的高度为柱高的3/4~4/5切柱床面平整， 床面维持0.5cm高的洗脱液。 3 洗柱：除杂，一般洗脱液体积为柱床体积的2~3倍。 4 加样洗脱：取0.5mL的样品，取样器尖头沿管壁伸到床 面之上，慢慢将样品加到凝胶床面上。拧松夹子，待样 品全部进入凝胶柱中，接通洗脱液，开始洗脱并收集洗 脱液。
2 加入样品时应注意不要搅动床面，使样品与床 面的洗拖脱液混合，影响分离效果。
5 收集检测：用1.5mL离心管收集洗脱液，每管 收集1mL。边收集边进行蛋白质与铵盐的检测。 取洗脱液2滴置于小试管中，加入磺柳酸1滴，
如有蛋白质洗脱下来，则有白色混浊或沉淀 出现。取洗脱液2滴加入白瓷板中，加入纳氏 试剂1滴，如有铵盐洗脱下来，则有黄红色沉 淀。
注意事项
1 装柱时，凝胶中的水不宜过多，用玻棒搅动小 烧杯中的凝胶，轻缓倒入柱中，凝胶的高度 应是层析柱高度的3/4~4/5。如层析柱中凝胶 高度不够，应在凝胶床面未形成之前再加入 葡聚糖凝胶，要尽量防止由于加胶次数较多， 致使胶中出现节痕。同时，要避免柱床内产 生气泡。
凝胶过滤法使蛋白质脱盐
实验目的
学习凝胶过滤法分离纯化物质的原理与操 作技术。
实验原理
葡聚糖凝胶（Sephadex G-25）具有网状结 构，小分子物质能进入其内部，而大分 子物质却被排阻在外部，当一混合溶液 通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质 就按不同相对分子量被分开。
葡聚糖凝胶是葡萄糖通过α-1，6-糖苷键形成的葡聚糖长 链，与交联剂环氧氯丙烷以醚键相互交联而成的具有 三维结构的多孔网状结构物。
凝胶层析法分离蛋白质
实验一酵母蔗糖酶的提取及部分纯化一、实验目的：学习酶的提取和纯化方法，并为后续实验提供一定量的蔗糖酶。
二、实验原理：蔗糖酶（invertase）（β-D-呋喃果糖苷果糖水解酶）（fructofuranoside fructohydrolase）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的β—呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。
不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。
本实验提取啤酒酵母中的蔗糖酶。
该酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧，在细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖酶（external yeast invertase）, 其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50% 糖成分的糖蛋白。
在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖酶（internal yeast invertase），含有少量的糖。
两种酶的蛋白质部分均为双亚基，二聚体，两种形式的酶的氨基酸组成不同，外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸，Ser和Met，它们的分子量也不同，外酶约为27万(或22万，与酵母的来源有关)，内酶约为13.5万。
尽管这两种酶在组成上有较大的差别，但其底物专一性和动力学性质仍十分相似，因此，本实验未区分内酶与外酶，而且由于内酶含量很少，极难提取，本实验提取纯化的主要是外酶。
三、试剂与器材：1. 试剂：（1）啤酒酵母（2）二氧化硅（3）甲苯（使用前预冷到0℃以下）（4）去离子水（使用前冷至4℃左右）（5）冰块、食盐（6）1N乙酸（7）95%乙醇（预冷至－20℃）2. 器材：（1）研钵1个（2）离心管3个（3）滴管3个（4）量筒50mL 1个（5）水浴锅1个（6）恒温水浴（7）烧杯100mL 2个（8）广泛pH试纸（9）高速冷冻离心机四、操作步骤：1. 提取（1）准备一个冰浴，将研钵稳妥放入冰浴中（两组做一个）。
（2）取适量（5－10g）二氧化硅放入研钵中研细。
（3）称取5g干啤酒酵母放入研钵中，量取预冷的甲苯20mL缓慢加入酵母中，边加边研磨成糊状，约需30分钟，至酵母细胞大部分研碎。
凝胶分离法
观察凝胶与水分层, 此间不能使胶面干掉。
注：如床表面不平整，可在凝胶表面用玻璃棒轻轻 搅动，再让凝胶自然沉降，使床面平整。
③调节流速：调节凝胶床所能承受的最大水压，
使出口流速7-8d/min。
3、加 样、洗脱、收集
①.放水： 将出口打开，使床面上的蒸馏水缓慢下流， 达到床面将近露出为止，关紧出口。 （注意：不可使床面干掉，以免气泡进入凝胶）
交联葡聚糖凝胶（Sephadex）
• 葡聚糖和3-氯-1，2环氧丙烷以醚键相互交联形成。
• 按交联度大小分8种型号，G值代表不同交联度。
• Sephadex G-10，15，25，50，75，100，150，200
• 数字表示每克干胶膨胀时吸水量的10倍。 Sephadex
G-25代表每克干胶膨胀时可以吸水2.5克。
②加样：用吸管吸取0.5ml脲酶粗提取液，缓慢地沿着 层析柱内壁加于床表面 注意：尽量不使床面扰动
③洗脱、收集：接上贮液瓶，进行洗脱，流出的液体分别 收集在小离心管中， 流速：7- 8d/分钟， 收集量：为3ml/管 (先用一支刻度离心管, 后可根据高度用普通管) 数量：共收集约8-9管（澄清后在收集1-2管） 注意：必须保持床面平整，而且不能干，随时加蒸馏水。
实验2
脲酶的凝胶过滤 分离纯化
实验 原理
脲酶分子量较大，脲酶粗制品通过交 联葡聚糖Senhadex G－150层析柱 酶本身不能进入凝胶颗粒的网络内， 而其他小分子物质及分子量较小的蛋白质可 扩散进入凝胶颗粒。
用蒸馏水作为洗脱剂，分子量大的脲酶 首先被洗脱下来，从而达到与其他物质分离 的目的。
0.1ml 2.9ml 2滴
充分混匀
Nessler试剂 0.75ml 0.75ml 0.75ml
实验一凝胶过滤层析分离蛋白质PPT课件
（1）层析系统的基本组成
固定相 + 流动相
固体物质 / 固定于固体物质的成分
可以流动的物质： 如水和各种溶媒
8
待分离混合物（A、B）随流动相通过固定相
由于理化性质差异，与两相发生相互作用（吸附、 溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含 量对比）不同
与固定相相互作用力越弱的组分，随流动相移动时 受到的阻滞作用小，移动速度快
23
3. 凝胶装柱
①柱固定于架子上，垂直放置，关住出口 ②自顶部缓缓加入葡聚糖悬液，使G-50 开始下沉，
至1 ~2cm时，打开出口 ③凝胶逐层上升，至顶部 2-3cm时，关闭出口
24
注意点：
垂直放置 防止气泡产生 防止柱的分层
25
4. 平衡
放置一段时间，约40分钟（使凝胶更好的压实）
14
15
（2）凝胶的特点
属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条 件较温和，可在相当广的温度范围内进行，不需要
有机溶剂，对于高分胶
16
（3）凝胶的选择 多孔网孔结构
A. 葡聚糖凝胶 (商品名: Sephadex， Dextran) 型号: G-10 – G-200
CuSO4 碱性
肽键
紫 红色
29
四、实验结果
绘制洗脱结果示意图，并分析所得结果
五、讨论
下次实验：
《碱性磷酸酶的提取及其比活性的测定》 时间：4月18日上午9：00开始
30
2019/12/14
.
31
适用：
杂质多、含量少的复杂样品分析，尤其适用于生 物样品的分离分析
13
3. 凝胶过滤层析法 （gel filtration chromatography） （1）原理：
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
吸水能力，每g干胶吸水量的10倍
数字愈小,交联度越大,被筛分物质的分子量也愈小
例：
Sephadex G-50：
对多肽及蛋白质的筛分范围(分子量)为: 1500 – 30000
Sephadex G-200：
对多肽及蛋白质的筛分范围(分子量)为: 5000 – 80000
B. 琼脂糖凝胶
( 商品名: Sepharose , Bio- gel – A ) 对实验条件要求高 ( 温度, pH )
实验一凝胶过滤层析分离蛋白质
一、 实验目的
1.掌握凝胶过滤层析法的基本原理； 2.掌握凝胶过滤层析法分离蛋白质的过程。
实验一凝胶过滤层析分离蛋白质
1. 常用生化实验技术
分光光度技术 电泳技术 离心技术 层析技术
实验一凝胶过滤层析分离蛋白质
是利用混合物中各组分的理化性质差异（吸附 力、溶解度、分子形状和大小、分子极性、分子亲 和力等）建立起来的技术。
注意：
防止床面干涸，可适当补充蒸馏水
实验一凝胶过滤层析分离蛋白质
① 加样前打开出口，使床面的蒸馏水流出，正好露 出床面时，立即关闭出口（将干未干）
② 用滴管将混合样品(0.6ml，即血红蛋白和溶菌酶 各0.3ml)缓缓沿柱内壁小心加于床表面
③ 打开出口，使样品进入床内，直到床面重新露出, 立即加入1~2倍于样品体积的蒸馏水
名称
操作形式
柱层析法
固定相装于层析柱内，使样品沿着一个方 向前移而达分离的层析法，包括一般柱层 析法、毛细管层析法和微粒填充柱层析法
平面层析法 层析过程在固定相构成的平面层内进行的 层析法，包括纸层析法、薄层层析法和薄 膜层析法
实验一凝胶过滤层析分离蛋白质
分离效率高 分析速度快 具有极高的灵敏度 应用范围广
O
O
H2N - C - NH - C - NH2
CuSO4 碱 性
紫 红 色
肽键
＜40℃ 4.5- 9.0 工作的下限是葡聚糖凝胶工作的上限, 用于大分子物质的分离
C. 聚丙烯酰胺凝胶
商品名: Bio – gel – P（生物胶P）
实验一凝胶过滤层析分离蛋白质
1. 柱的选择 直径： 1~5 cm 一般长度：直径 = 10：1 ~ 20：1 本实验玻柱： 直径0.8~ 1.5cm 长度 17~ 20cm
分配层析法 各组分在流动相和固相中的分配系数不同
离子交换层 固定相是离子交换剂，各组分与离子交换
析法
剂亲和力不同而分离
亲和层析法 固定相只能与一种待分离组分专一结合， 以此和无亲和力的其它组分分离
凝胶层析法 固定相是多孔凝胶，各组分的分子大小不 同，因而在凝胶上受阻滞的程度不同
实验一凝胶过滤层析分离蛋白质
实验一凝胶过滤层析分离蛋白质
血红蛋白 溶菌酶 分离 （64500） （11400） 选择 Sephadex G-50
Sephadex G-50： 对多肽及蛋白质的筛分范围(分子量)为: 1500 – 30000
制备：
将干胶颗粒悬浮于5 ~ 10倍的蒸馏水或洗脱液中 充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去
实验一凝胶过滤层析分离蛋白 质
带教: 张学礼、戴薇薇 龚张斌、黎志萍
实验课要求
试剂用后及时归位 及时记录实验结果 按时完成实验报告 离开时做好清洁工作
实验一凝胶过滤层析分离蛋白质
标题日期 一、实验目的 二、实验原理 三、操作步骤 四、实验结果 五、分析讨论
实验一凝胶过滤层析分离蛋白质
一、玻璃仪器的洗涤 二、吸量管及微量取样器的使用 三、溶液的混匀 四、离心机的使用
实验一凝胶过滤层析分离蛋白质
固定相 + 流动相
固体物质 / 固定于固体物质的成分
可以流动的物质： 如水和各种溶媒
待分离混合物（A、B）随流动相通过固定相
由于理化性质差异，与两相发生相互作用（吸附、 溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含 量对比）不同
与固定相相互作用力越弱的组分，随流动相移动时 受到的阻滞作用小，移动速度快
分步收集流出液，可得到样品中所含的各单一 组分，从而达到将各组分分离的目的
实验一凝胶过滤层析分离蛋白质
按两相所处状态分类
流动相
液体
气体
液体 固定相 固体
液—液层析法 液— 固层析法
气—液层析法 气— 固层析法
实验一凝胶过滤层析分离蛋白质
名称
原理
吸附层析法 固定相为固体吸附剂，利用各组分在吸附 剂表面吸附能力不同而分离
适用：
杂质多、含量少的复杂样品分析，尤其适用于生 物样品的分离分析
实验一凝胶过滤层析分离蛋白质
（1）原理：
根据分子大小的差别进行分离。每个凝胶颗 粒好象一个筛子，小分子物质可以进入颗粒内部， 大分子物质被排阻在外。
又名分子筛过滤，排阻层析
实验一凝胶过滤层析分离蛋白质
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
实验一凝胶过滤层析分离蛋白质
实验一凝胶过滤层析分离蛋白质
①柱固定于架子上，垂直放置，关住出口 ②自顶部缓缓加入葡聚糖悬液，使G-50 开始下沉，
至1 ~2cm时，打开出口 ③凝胶逐层上升，至顶部 2-3cm时，关闭出口
实验一凝胶过滤层析分离 蛋白质
垂直放置
防止气泡产生
防止柱的分层
实验一凝胶过滤层析分离蛋白质
放置一段时间，约40分钟（使凝胶更好的压实）
属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条 件较温和，可在相当广的温度范围内进行，不需要
有机溶剂，对于高分子物质有很好的分离效果。
交联葡聚糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 琼脂糖凝胶
实验一凝胶过滤层析分离蛋白质 多孔网孔结构
A. 葡聚糖凝胶 (商品名: Sephadex，Dextran)
B.
型号: G-10 – G-200
实验一凝胶过滤层析分离蛋白质
① 当此少量蒸馏水接近流干时，反复多次加入蒸 ② 馏水，进行洗脱，直到两带分开 ② 检查Hb在层析床中色带位置，待Hb洗脱完后， ③ 用试管分步收集洗脱液 ③ 10d/管，每管加NaOH 2d，CuSO4 2d ④ 检查溶菌酶洗脱情况，若为紫色，则为（+）
缩二脲反应 （双缩脲反应）