生物样品超薄切片技术
超薄切片名词解释
超薄切片名词解释
超薄切片技术是一种尖端的显微技术，能够揭示样品内部的微小结构和细胞形态。
通过将样品切成厚度小于100纳米的超薄切片，科学家们可以在高倍显微镜下观察到这些切片的内部结构和细胞活动。
这种技术以其高分辨率、高对比度和高清晰度的优点，成为了生物学、医学、材料科学等领域不可或缺的研究工具。
在生物学和医学领域，超薄切片技术发挥了重要的作用。
通过对细胞结构和功能的观察，科学家们可以深入了解疾病的发病机制、诊断方法和治疗策略。
例如，通过对肿瘤细胞的超薄切片观察，可以揭示肿瘤细胞的异常增殖和分化，为肿瘤的诊断和治疗提供重要的依据。
此外，超薄切片技术还可以用于研究神经元网络、免疫系统、心血管系统等复杂生物系统，帮助科学家们深入探究生命活动的奥秘。
在材料科学领域，超薄切片技术也被广泛应用于研究材料的微观结构和性能。
通过对材料的超薄切片观察，科学家们可以了解材料的晶体结构、相变行为、界面反应等重要信息，为新材料的研发提供重要的指导。
此外，超薄切片技术还可以用于研究材料的力学、光学、电学等性能，为材料的应用和优化提供重要的依据。
超薄切片技术是一种强大的科学研究工具，它能够提供对微小结构和细胞的深入了解，有助于推动科学研究的进展。
随着科技的不断发展，相信超薄切片技术将在未来的科学研究中发挥更加重要的作用。
超薄切片技术
半薄切片进行光学显微镜观察的目的：
(1) 定位：通过光学显微镜观察，确定所要观察 的范围，然后保留要用电镜观察的部分，修去 其余部分。
(2)便于对同一组织的同一部位进行光学显微镜和 电镜的对比观察。半薄切片定位以后，要对包 埋块作进一步的修整。通常将块的顶端修成金 字塔形，顶面修成梯形或长方形，每边的长度 为0.2mm～0.3mm。
3 脱水
为了保证包埋介质完全渗入组织内部，必 须事先将组织内的水分驱除干净，即用一种和 水及包埋剂均能相混溶的液体来取代水，常用 的脱水剂是乙醇和丙酮。
急骤的脱水会引起细胞的收缩，因此，脱 水应梯度进行： 15% 乙醇15分钟，30%乙醇 15分钟，50%乙醇15分钟， 70% 乙醇15分钟， 85%乙醇15分钟，95%乙醇15分钟，100%乙醇 １0分钟(二次)。游离细胞可适当缩短脱水时间。 过度脱水不仅引起更多物质的抽提，而且会使 样品发脆，造成切片困难。
2.3常用固定剂有:
(1)四氧化锇 (OsO4)
是一种强氧化剂，与氮原子有较强的亲和 力，因而对于细胞结构中的蛋白质成分有良 好的固定作用。它还能与不饱和脂肪酸反应 使脂肪得以固定。此外，四氧化锇还能固定 脂蛋白，使生物膜结构的主要成分磷脂蛋白 稳定。它还能与变性DNA以及核蛋白反应， 但不能固定天然DNA、RNA及糖原。四氧化 锇固定剂有强烈的电子染色作用，用它固定 的样品图象反差较好。锇固定的时间一般为 1-2小时。
2 固定
2.1 固定的目的 是尽可能使细胞中的各种细胞器以及大分子结
超薄切片样品制备的基本步骤
超薄切片样品制备的基本步骤
一、样品固定
超薄切片样品制备的第一步是对样品进行固定。
固定是为了使组织或细胞保持在自然状态，防止其在处理过程中发生自溶和腐败。
常用的固定方法有戊二醛固定法和锇酸固定法。
在固定过程中，要确保样品充分固定，以避免后续步骤出现问题。
二、样品包埋
固定后的样品需要用适当的介质进行包埋，以便于切片的制作。
包埋剂的选择应根据样品的性质和实验要求来决定。
在包埋过程中，要保证样品平整，无气泡，以免影响切片的制作。
三、切片制作
切片制作是超薄切片样品制备的关键步骤。
一般采用超薄切片机进行切片，得到厚度在50-100nm之间的超薄切片。
切片时要保证切片平整，无裂痕，无毛刺。
切好的切片需用蒸馏水冲洗，去除多余的介质。
四、染色处理
染色处理是为了使切片中的结构能够更好地显现出来。
常用的染色方法有免疫标记染色和重金属染色。
染色时要注意控制染色时间和浓度，以免造成过度染色或染色不足。
五、观察与成像
染色后的切片需在电子显微镜下进行观察和成像。
观察时要选择合适的放大倍数和观察条件，以便更好地观察到样品的结构特征。
成像时需注意控制曝光时间和亮度，以获得高质量的图像。
以上是超薄切片样品制备的基本步骤，每个步骤都需要严格按照操作规程进行，以保证制备出的样品质量可靠，满足实验要求。
第四章超薄切片技术
生物电子显微技术
4. 常用的脱水剂： 乙醇、丙酮、甲醇、乙二醇、聚乙二醇、 环氧丙烷、包埋剂的单体。
5. 脱水注意事项: ⑴ 脱水要彻底 ⑵ 更换液体动作要迅速 ⑶ 脱水时间不宜过长 ⑷ 固定后的 样品要充分漂洗
附加步骤：块染（Block Staining) 生物电子显微技术 块染：在脱水前或脱水时对组织块进行的染色 叫块染。（在切成片之后的染色可称为“片染”）
2、理想固定剂
生物电子显微技术
1优）点锇：酸（OsO4)
⑴ 几乎和细胞内所有成分发生化学结合
⑵ 对氮具有较强亲和力，对含有蛋白质的细胞结构固定作
用良好
⑶ 可保存脂肪,形成脂肪-锇复合物
⑷ Z=76，增加膜的反差 ⑸ 对磷脂蛋白、核蛋白保护很好
生物电子显微技术
锇酸缺点： ⑴ 不能固定糖元、碳水化合物、核酸，对 微管固定效果差 ⑵ 酶的钝化剂，不能用于细胞化学研究 ⑶ 分子量大,渗透能力差，要求组织块小 ⑷ 固定时间不宜过长 ⑸ 可与乙醇、醛类氧化还原反应生成沉积 ⑹ 有挥发性、剧毒
c. 原位固定 d. 灌流固定
生物电子显微技术
固定操作示意图
生物电子显微技术
漂洗操作方法
3、固定注意事项：
生物电子显微技术
1) 固定液的浓度:戊二醛1-5%,锇酸1-3%
浓度低→固定时间长→细胞质的抽提,组织肿胀
浓度高→易损细胞微结构,OsO4或KMnO4可使蛋
白质分子氧化而断裂
2) 固定液的渗透压：
操作规则:快,小, 冷,准,稳,轻(防损伤)
⑴ 快：动作迅速,快取,投入固定液
⑵ 小：样品体积小,动1mm3,植宽1，长3～4
⑶ 冷：0～4℃
⑷ 准：取的部位准，有代表性、目的性
超薄切片技术原理课件
技术优势
高分辨率
超薄切片技术能够提供高分辨率的显 微图像，有助于更精确地观察细胞结 构和细节。
无损伤检测
超薄切片技术对样品损伤较小，可以 保持样品的完整性，尤其适用于珍贵 样本的分析。
广泛适用性
超薄切片技术适用于各种样品，包括 生物、医学、材料科学等多个领域。
高对比度
超薄切片技术能够提供高对比度的图 像，使得细胞结构和组分更易于区分 和识别。
药物研发
超薄切片技术可以用于药物作用机制的研究，通过观察药 物对细胞结构和功能的影响，有助于发现新的药物作用靶 点。
半导体工业领域应用
01
集成电路制造
在集成电路制造过程中，超薄切片技术用于对半导体材料进行微观结构
和缺陷分析，为优化制造工艺和提高芯片性能提供支持。
02
纳米材料制备
超薄切片技术能够将纳米材料切成厚度在数纳米至数十纳米之间，制备
供更多有价值的信息。
05
CATALOGUE
超薄切片技术实际应用案例
生物医学领域应用
细胞结构和功能研究
超薄切片技术能够将生物样本切成厚度在数十至数百埃米 的超薄切片，揭示细胞内部的精细结构，为研究细胞功能 和生命活动提供重要信息。
医学诊断 超薄切片技术广泛应用于病理学诊断中，通过对病变组织 进行超薄切片制作，能够观察到细胞和组织的细微变化， 为疾病诊断提供依据。
切片厚度
超薄切片的厚度通常在50-100纳米之 间，这种厚度使得电子束可以穿透切 片，从而观察到样品的内部结构。
技术发展历程
起源
超薄切片技术起源于20世纪40年 代，最初用于生物学领域，后来
逐渐扩展到其他领域。
早期发展
在50年代和60年代，该技术得到 了迅速发展，并逐渐完善。
超薄切片技术
超薄切片技术·为透射电子显微镜观察提供超薄样品的专门技术·生物学中研究细胞、组织超微结构最常用技术·生物学中其他电子显微技术（电镜放射自显影、电镜细胞化学、免疫电镜技术等）的关键性技术。
目前有关生物体的各种细胞、组织的超微结构知识几乎都是这种技术提供。
超薄切片：一般厚度在10～100nm的切片。
这种切片的技术――超薄切片技术制作一般过程（与光学显微镜的石蜡切片过程原则上基本相似）：取材、固定、（浸洗）脱水、渗透、（胶囊）包埋、聚合、（样品修块）、切片、（捞片－切片沾在载网上）、染色等几个环节利用超薄切片技术制备样品的实验过程较长，从样品取材到电镜观察大约需要一周时间。
由于步骤多，时间长，操作时必须十分认真，做好每一步实验。
无论哪个环节出现问题，都不能得到理想的实验结果。
衡量超薄切片的质量：1．样品结构保存良好；2．切片厚度为60nm左右；3．切片均匀，表面无褶皱，无刀痕、无震颤及染色沉淀等现象；4．切片反差适中；5．样品支持膜耐受电子束轰击，观察时无膜的漂移和破裂现象。
I．取材II．固定1．固定的目的及良好固定的标准2．几种常用的固定剂3．几种常用的缓冲液4．几种常用的固定液及配方5．固定方法6．固定时注意事项III．脱水1．脱水的目的及其过程2．脱水过程中的注意事项IV．渗透与包埋1．常用的包埋剂及配方2．渗透与包埋的步骤3．渗透与包埋过程中的注意事项V．超薄切片1．超薄切片的准备工作2．切片VI．切片染色1．染色的作用2．染色的方式I．取材关键环节，取材正确与否与制备出来的样品能否符合观察要求直接有关。
肌体内酶作用下的代谢非常迅速，生物组织离体后，细胞将会立即释放出各种水解酶引起细胞自溶，使细胞内部微细结构发生变化。
这种微细结构的改变在光镜下无法看到，但电镜下呈现明显的人工假象。
尽可能避免人工假象，正确取材的几点要求：1．切取组织块时必须快速，以尽量保持材料的新鲜，一般要求在一分钟内把组织块浸入固定液；组织块要小，一般切成0.5～1.0mm3大小，太大则在短时间内固定液不能渗透到组织块内部；2．所用的固定液及容器都必须预冷，以降低离体细胞内水解酶的活性，尽可能减少细胞自溶；3．由于电镜观察视野小，具有很大的局限性，所以，选择部位要准确可靠。
超薄切片
摇匀,室温离心,1500rpm20min 摇匀,室温离心,1500rpm20min 血浆、白细胞层、红细胞层) 3层(血浆、白细胞层、红细胞层)
弃上清，沿管壁加入2 2.5%戊二醛 戊二醛2ml 室稳静置30min 弃上清，沿管壁加入2-2.5%戊二醛2ml 室稳静置30min
用针尖或细棒轻轻挑出透明层(白细胞层), 用针尖或细棒轻轻挑出透明层(白细胞层),切成小块 ),切成小块 2%戊二醛固定 小时,漂洗, 戊二醛固定1 2%戊二醛固定1小时,漂洗,锇酸后固定
(四)固定液的配制
1.常用的缓冲液 (1)磷酸盐缓冲液 最富有生理学功能,但易沉淀, 最富有生理学功能,但易沉淀,易被细菌污染 (2)二甲砷酸钠缓冲液 稳定,可长期保存, 稳定,可长期保存,但因含砷而有毒性
2.锇酸固定液的配制 3.戊二醛固定液的配制 多聚甲醛— 4.多聚甲醛—戊二醛固定液的配制
(五)固定方法 1.浸泡固定法 (1)常规组织块的戊二醛—锇酸双固定法 常规组织块的戊二醛 戊二醛— 1mm3组织块,2-4%冷戊二醛,4℃浸泡固定2小时 组织块,2-4%冷戊二醛 ℃浸泡固定2 冷戊二醛,4
电镜生物样品制备技术
超薄切片技术 厚度500 700Å 不超过1000 5001000Å 厚度500-700Å,不超过1000Å，是电镜生物样品制备方 法中最基本的技术。 法中最基本的技术。 制备过程 取材 固定 漂洗
脱水
渗透、包埋、 渗透、包埋、聚合
切片
染色
一. 取 材
（一）取材前注意事项 （二）取材的要领 1.部位准确 2.快.<3min 3.小.<1mm3 低温操作, 4.低温操作, 0-4oC 5.避免损伤 6.器材保持干净 （三）取材的方法 组织块 组织条 1mm3小块
(完整版)2-1、超薄切片技术原理
光学显微术中常用的长度单位是：“微米”（μ）,电镜是研究超微 观物体的工具,其分辨能力比普通显微镜大1000倍以上。
在电子显微术中,通常用“埃”（A）或毫微米（nm或mm）来表 示。它们之间的换算关系如下：
1毫米（mm）=1000微米（μ） 1微米（μ）=1000毫微米（nm或mu） 1毫微米（nm或mu）=10埃（A） 1毫米=103微米=106毫微米=107埃
一、取材和固定
轻：样品的超微结构脆弱，为防止各种人为的损伤，
在操作过程中要格外小心，最好选用新的锋利的 解剖工具，操作尽量轻巧，以避免挤压。
优：优质的固定是关键环节之一，遇到特殊情况时最
好根据样品本身的要求，经过反复实验选用最佳 的固定条件。
一、取材和固定
2．操作方法：
(1)动物组织块处理方法： 用乙醚使动物轻微麻醉，迅速解剖，准确地取下材料，立即浸入2％
我们把电镜观察的样品制备方法总称为样品制 备技术。
一、超薄切片技术
用超薄切片法，可得到25埃左右的分辨率； 同电镜本身早已达到2-3埃的分辨本领相比，还 有相当大的“差距”。
这种差距意味着许多结构细节尚未被人们发现 和认识，同时也告诫人们不能满足现今已有的制 样技术。
一、超薄切片技术
在电镜技术中，有两种分辨率： 一种是电镜本身的分辨率， 二是样品制备上的分辨率，
同一台电镜，谁的样品制备得好，它就能使细 节观察得更确切，更清晰，拍出更真实的照片。
对于研究生物医学的工作者来说，研究和熟练 地掌握制样技巧是极为重要的一环。
一、超薄切片技术
石腊切片机的最高水平可以把片子切到1-2微米。 现代的超薄切片机从改进石腊切片机出发寻求途 径。目前的超薄切片机可以以连续切片的方式把一 个细胞切成几十片或几百片来进行电镜观察。
简述电镜超薄切片制作技术及其在植物细胞生物学中的应用举例。
简述电镜超薄切片制作技术及其在植物细胞生物学中的应用举例。
摘要：一、电镜超薄切片制作技术简介1.超薄切片的定义与制作过程2.微型振荡器在超薄切片样品制备中的应用二、电镜超薄切片在植物细胞生物学中的应用举例1.观察细胞结构与组成2.研究细胞分裂与生长3.分析细胞功能与生物学意义正文：一、电镜超薄切片制作技术简介电镜超薄切片制作技术是一种将生物组织或材料制成厚度在几十纳米到几百纳米之间的薄片，以便于在电子显微镜下进行观察和分析的方法。
超薄切片的制备过程主要包括固定、脱水、透明、浸透和切片等步骤。
在制备过程中，微型振荡器发挥了重要作用，可以实现样品的精细切割和均匀分布，从而提高切片质量。
1.超薄切片的定义与制作过程超薄切片是指厚度在几十纳米到几百纳米之间的切片。
制作过程通常包括以下几个步骤：（1）固定：将生物组织或材料固定在载网上，以便于后续处理。
（2）脱水：通过逐渐升高温度，将组织中的水分挥发掉，以利于透明处理。
（3）透明：采用透明剂使组织变得透明，以便于在电子显微镜下观察。
（4）浸透：将组织浸入树脂或其他包埋材料中，使其充分渗透，增加切片的稳定性。
（5）切片：采用微型振荡器或超声波切割器将组织切成均匀的薄片。
2.微型振荡器在超薄切片样品制备中的应用微型振荡器在超薄切片样品制备过程中发挥了重要作用。
首先，微型振荡器可以实现样品的精细切割，提高切片的质量和均匀性。
其次，微型振荡器可以实现样品的均匀分布，确保制备过程中各个切片的一致性。
最后，微型振荡器可以减少人工操作的误差，提高切片制备的效率。
二、电镜超薄切片在植物细胞生物学中的应用举例电镜超薄切片技术在植物细胞生物学中有广泛应用，主要包括以下几个方面：1.观察细胞结构与组成通过电镜超薄切片技术，可以清晰地观察到植物细胞的细胞壁、细胞膜、细胞核、细胞质等结构，以及各种细胞器和细胞内组织的组成。
这有助于研究植物细胞的形态、结构和功能。
2.研究细胞分裂与生长通过观察超薄切片中的细胞分裂过程，可以了解植物细胞在分裂和生长过程中的形态变化和细胞器重塑等现象。
透射电子显微镜样品制备——超薄切片技术
二、仪器介绍
超薄切片机
显微镜
控制面板
样品臂
下刀架
厂家：美国RMC公司 型号： PowerTome-XL
二、仪器介绍
超薄切片机——常温切片附件
常温切片附件
厂家：美国RMC公司 型号： PowerTome-XL
二、仪器介绍
超薄切片机——冷冻切片附件
液氮罐 温度控制器
冷冻附件
厂家：美国RMC公司 型号： PowerTome-XL
*ERL-4221：二氧化乙烯基环，粘度低，聚合块硬度大。 *DER－736：聚丙二醇二缩水甘油醚，增韧剂 ，低粘度，可调节包埋块硬度。 *NSA：壬烯基琥珀酸酐，一种特殊硬化剂。 *DMAE：二甲基氨基乙醇，固化加速剂。调整DMAE的量，可调整固化时间。
3.1 包埋
包埋要求：包埋剂的硬度与样品相近，一般选用标准硬度 包埋方法 前三种试剂混匀后再加入DMAE，再搅拌均匀，保证没 有气泡。包入试样，放入烘箱固化。
一、切片原理
切片原理 对样品进行包埋，修样，得到足够小的样品头，用固定 的刀切割上下运动的样品。
上下运动的样品 固定的刀
一、切片原理
切片原理 切片采用机械推进式：刀固定，样品每上下运动一次时 向前推进一小段距离，进行切片 特点：在设定的切削行程区间，样品以可控速度切片
样品
切削行程（Cutting Window）, 切片速度可控 刀 刀
刀口
Z
无用的一边
3.2 制备玻璃刀
2、制刀槽 制好玻璃刀后，用塑料水槽围绕有用刀口制作一只水 槽，以便使超薄切片漂浮在水面上。装好水槽后，用 熔化的石蜡封固接口，防止漏水。
封蜡
塑料刀槽
玻璃刀
3.2 制备玻璃刀
超薄切片技术
操作步骤（以全身灌流固定法为例）
麻醉要进行灌流的动物,将动 物固定于实验台上,打开胸腔暴露 心脏,将针头刺入左心室，剪开右 心耳以引出血液和灌流液。用注射 器或输液器缓慢注入37 ℃、 0.9%NaCl,直至内脏血色消失或流 出液无血色为止,注入4 ℃固定液， 待组织变硬后取材。
三.脱
水
目的 –将组织内部游离的水分脱净，有利于 浸透和包埋 常用脱水剂 –乙醇:使组织收缩较小，但与包埋剂的互溶
多聚甲醛(Paraformaldehyde)
白色粉末，使用浓度为4％ 优点
–对组织的浸透力强 –保存抗原性物质，多用于免疫电镜技 术中 缺点 –高浓度时可使组织结构流失，多不单 独使用
常用缓冲液
用于配制固定液和漂洗 –0.2M磷酸盐缓冲液:较常用 –0.2M二甲砷酸盐缓冲液:用于电镜细 胞化学
超薄切片技术
概念: 指制备厚度低于100nm的切片技术。 特点： • 是透射电镜生物样品制备技术中最 常见、最基本的技术； • 是其他技术方法的基础； • 程序长、操作较复杂、精细。
生物医学样品的特点：
1、样品多样化，包括组织、细胞、微 生物级生物大分子。 2、含水量多、质地软、脱水时容易皱 缩变形。 3、机械程度低，对电子束轰击的耐受 力差。 4、多由低原子序数的元素组成，故导 电性能差。 5、样品形态对试剂的PH值及温度较敏 感
主要步骤
取材 固定 脱水 浸透及包埋 切片 染色
一.取材
从人体、动植物、细胞和微生物的培养物
中选取电镜观察材料的过程。 在活体取材时要做到： •快─离体1～2min内放入固定液 •准─取材部位要准，有代表性 •小─1mm×1mm×1mm大小，太小时结 构少，太大时固定不充分结构保存不 好 •轻─动作要轻，器械要锋利 •冷─0℃ ～ 4℃ ，器械、容器、固 定液均需预冷
超薄切片技术的步骤
超薄切片技术的步骤超薄切片技术是一种用于生物样本制备的重要技术，它可以将组织或细胞切成非常薄的切片，以便进行显微镜观察和分析。
本文将介绍超薄切片技术的步骤。
一、样品制备首先需要选择合适的样品进行制备。
通常情况下，选择新鲜组织或固定后的组织作为样品，也可以使用培养好的细胞。
对于组织样品，需要将其固定在4%的聚乙烯醇中进行固定处理，以保持其形态和结构不变。
对于细胞样品，则需要用PBS缓冲液洗涤并离心收集。
二、包埋处理包埋是超薄切片技术中非常重要的步骤。
首先需要将固定后的组织或收集好的细胞用70%乙醇进行去水处理。
然后使用甲苯或氨基甲酸乙酯等有机溶剂进行透明化处理，使得样品变得透明。
接着使用聚苯乙烯树脂等材料进行包埋处理，使得样品被完全嵌入到树脂中。
最后将树脂进行固化处理，使得样品被牢固地固定在树脂中。
三、切片处理切片是超薄切片技术中最核心的步骤。
首先需要使用超微型切片机进行样品的切割处理。
在切割过程中，需要使用钻石或玻璃刀片等材料进行切割，以保证样品被完全切成非常薄的切片。
接着将切好的样品放入冷却盘中，并用冷却盘冷却10-20分钟，使得样品变得更加坚硬和易于操作。
最后使用显微镜或电镜等设备对样品进行观察和分析。
四、染色处理染色是超薄切片技术中常用的一种方法，它可以使得样品更加清晰明了地显示出来。
通常情况下，可以采用吉姆萨染色、银染色、荧光染色等多种方法进行染色处理。
在染色过程中，需要注意不要过度染色以避免影响观察结果。
五、结果分析最后需要对观察到的结果进行分析和解读。
通过对超薄切片图像的观察和分析，可以了解样品的结构、形态、组成等信息，从而为后续的研究提供重要的参考。
总结：超薄切片技术是一种非常重要的生物样品制备技术。
它可以将组织或细胞切成非常薄的切片，以便进行显微镜观察和分析。
超薄切片技术包括样品制备、包埋处理、切片处理、染色处理和结果分析等多个步骤。
在实际操作中需要注意各个步骤的细节，以保证制备出高质量的样品。
超薄切片技术的步骤
超薄切片技术的步骤一、介绍超薄切片技术（Ultra-Thin Sectioning Technique）是一种在生物学和材料学领域中常用的实验技术，用于制备极薄的样品切片，以便于观察样品的微观结构和化学组成。
本文将详细介绍超薄切片技术的步骤和操作要点。
二、材料与设备准备2.1 材料准备•要制备切片的样品•乙醇、醋酸酯等有机溶剂•样品固定剂•样品染色剂•样品固化剂2.2 设备准备•切片机（可手动或电动）•金刀（可单刀或多刀）•玻璃刀片•玻璃载玻片•组织处理设备（真空冷冻干燥机、离心机等）三、样品处理步骤3.1 固定样品1.将要制备切片的样品进行固定。
不同的样品可能需要不同的固定方法，例如生物标本可以使用福尔马林进行固定，材料样品可以使用特定的固定剂。
3.2 染色样品1.如果需要观察样品的细胞结构或化学组成，可以在固定后对样品进行染色。
选择合适数量和类型的染色剂，根据样品的特性进行处理。
3.3 样品预处理1.将固定并染色的样品转移到过渡性有机溶剂中，逐渐脱水。
通常使用乙醇、醋酸酯等溶剂进行脱水处理。
3.4 样品浸透1.将样品转移到浸透剂中，溶剂与浸透剂逐渐混合。
常用的浸透剂有环氧树脂和丙烯酸树脂等。
浸透剂的选择应根据样品特性和实验需求。
3.5 样品固化1.将浸透后的样品转移到切片模具中，加入切片树脂，使其充分固化。
固化过程中通常需要一定的温度和时间。
3.6 去除玻璃刀片1.使用特定工具将固化后的切片和玻璃刀片分离，得到单独的样品切片。
四、超薄切片操作步骤4.1 切片机准备1.启动切片机，并确保刀片固定好且处于适当位置。
2.调整刀片的角度和位置，以适应样品的形状和大小。
4.2 切片操作1.将待切片的样品放置在切片机上，并固定好。
2.调整切片机的切割参数，包括切割速度、切割厚度等。
3.使用切片机进行切割操作，得到超薄的样品切片。
4.3 切片校正1.检查切片的质量和厚度。
可以使用显微镜观察切片的表面和边缘，确保切割到理想的厚度。
超薄切片技术的步骤
超薄切片技术的步骤超薄切片技术是一种非常重要的生物学技术，它可以帮助科学家们更好地观察细胞和组织的结构，从而更好地理解生命的本质。
在本文中，我们将介绍超薄切片技术的步骤，以帮助读者更好地了解这一技术的原理和应用。
第一步：样品制备超薄切片技术的第一步是样品制备。
在这一步中，科学家们需要选择合适的样品，并将其固定在载玻片上。
通常情况下，样品可以是细胞、组织或者器官，而载玻片则是一种透明的玻璃片，用于支撑样品并保持其形状。
在固定样品之前，科学家们需要先进行一些预处理工作。
例如，对于组织样品，他们需要将其切成薄片，并进行染色或者其他处理，以便更好地观察细胞和组织的结构。
对于细胞样品，科学家们则需要将其培养在适当的培养基中，并进行必要的处理，以便使其保持完整和健康。
第二步：切片制备在样品制备完成之后，科学家们需要将其切成超薄的切片。
这一步需要使用一种叫做超薄切片机的设备，它可以将样品切成厚度仅为几微米的薄片。
这些薄片可以非常清晰地显示细胞和组织的结构，从而帮助科学家们更好地了解它们的功能和特性。
在切片制备过程中，科学家们需要注意一些细节。
例如，他们需要选择合适的切片角度和切片速度，以确保切片的质量和准确性。
此外，他们还需要使用适当的切片刀片和切片液，以确保切片的光滑和均匀。
第三步：染色和封片在切片制备完成之后，科学家们需要对切片进行染色和封片。
这一步可以帮助他们更好地观察细胞和组织的结构，并确定它们的类型和功能。
在染色过程中，科学家们通常会使用一些特殊的染料，例如荧光染料或者金属染料，以使细胞和组织的结构更加清晰和明显。
在封片过程中，他们则需要使用一种叫做封片剂的物质，将切片和载玻片粘合在一起，并保护切片不受损坏。
第四步：显微镜观察在染色和封片完成之后，科学家们可以使用显微镜观察切片。
这一步可以帮助他们更好地了解细胞和组织的结构，并确定它们的类型和功能。
在显微镜观察过程中，科学家们需要选择合适的显微镜和镜头，以确保观察的清晰度和准确性。
超薄切片技术原理篇.
(2) 支持膜的制备 挑选并清洗好载网之后，要在载网上覆 盖一层薄膜，这层薄膜称支持膜，厚度为 10nm～20nm。对支持膜的要求是透明无结 构，并能承受电子束的轰击。常用的支持 膜有火棉胶膜及聚乙烯醇缩甲醛膜(formvar 膜)，一般采用后者。
5.5超薄切片机 超薄切片需用超薄切片机进行。 5.5.1超薄切片机分类 根据推进原理不同，将超薄切片机分为两大类： （1）机械推进式切片机，用微动螺旋和微动杠 杆来提供微小推进； （2）热胀冷缩式切片机，利用金属杆热胀或冷 缩时产生的微小长度变化来提供推进。
当加入胺类时，就引起末端环氧基相连，形 成首尾相接的长链状聚合物。这种促进末端相接 的交联剂叫做催化剂或加速剂。常用的加速剂有 2,4,6－三(二甲氨基甲基苯酚)(简称DMP(30)、二 乙基苯胺及乙二胺等。为了改善包埋块的切割性 能，某些环氧树脂包埋剂配方中还加有增塑剂， 使包埋块具有适当的韧性。常用的增塑剂为邻苯 二甲酸二丁酯(简称DBP)。 4.2包埋 包埋操作： 常规将组织块包埋在多孔橡胶包 埋模板中，然后置烤箱烘干，在45℃(12小时)、 60℃(24－36小时)烤箱内加温，即可聚合硬化， 形成包埋块。
半薄切片进行光学显微镜观察的目的： (1) 定位：通过光学显微镜观察，确定所要观察 的范围，然后保留要用电镜观察的部分，修去 其余部分。 (2)便于对同一组织的同一部位进行光学显微镜和 电镜的对比观察。半薄切片定位以后，要对包 埋块作进一步的修整。通常将块的顶端修成金 字塔形，顶面修成梯形或长方形，每边的长度 为0.2mm～0.3mm。 5.3制刀 超薄切片使用的刀有两种：一种是玻璃刀， 另一种是钻石刀。由于玻璃刀价格便宜，使用 者较多。制刀用的玻璃为硬质玻璃，厚度为 5mm～6.5mm。
2.3常用固定剂有: (1)四氧化锇 (OsO4) 是一种强氧化剂，与氮原子有较强的亲和 力，因而对于细胞结构中的蛋白质成分有良 好的固定作用。它还能与不饱和脂肪酸反应 使脂肪得以固定。此外，四氧化锇还能固定 脂蛋白，使生物膜结构的主要成分磷脂蛋白 稳定。它还能与变性DNA以及核蛋白反应， 但不能固定天然DNA、RNA及糖原。四氧化 锇固定剂有强烈的电子染色作用，用它固定 的样品图象反差较好。锇固定的时间一般为 1-2小时。
超薄切片名词解释
超薄切片名词解释
超薄切片是指通过显微镜技术对细胞、组织或材料物质进行切割
和制备的一种样品。
它通常使用专用设备，如超薄切片机，将样品切
割成非常薄的切片，通常只有几纳米到几十微米的厚度。
这些超薄切
片可以使科学家和医生更容易观察和分析样品的细节结构、形状和生
理功能。
超薄切片在生物医学研究中被广泛应用。
通过超薄切片，科学家
可以观察和研究细胞的形态、细胞器的分布和结构等。
在疾病诊断中，医生可以通过超薄切片观察组织病变的细节，帮助确定疾病的类型和
严重程度。
此外，超薄切片还广泛应用于材料科学研究中，可用于观
察材料的晶体结构、微观缺陷等信息。
为了制备超薄切片，通常需要将样品固定、浸泡和包埋，然后使
用切片机将样品切割成所需的厚度。
切片后，可以使用染色技术对切
片进行染色，以增强对细节和结构的观察。
在显微镜下观察超薄切片时，通常需要使用特殊的显微镜物镜和高倍率的放大镜头。
总之，超薄切片是一种重要的技术工具，可用于生物医学和材料科学研究中的细胞、组织和材料样品的观察和分析。
它帮助科学家和医生了解细胞和组织的结构和功能，促进疾病诊断和新材料的开发。
4生物样品超薄切片技术
↓
镜检
4.示踪性染色
取材 ↓ 固定 ↓
多用于免疫电镜技术和(酶)细胞化学技术
(1)概念：用各种大小的离子、分子等颗粒作为示踪物， 显示细胞间的连接部位与方式，研究细胞的通透屏障，测 量通透孔道的大小，追踪组织液的生理通路。
（2）常用示踪剂：硝酸镧（2nm），辽红（0.76nm）， 无机胶体金，草酸钙以及酶类，铁蛋白 保存脂肪的样品处理、钙离子定位研究
可长期保存
↓
镜检
取材 ↓ 固定 ↓ 脱水 ↓ 包埋 ↓ 切片 ↓ 染色 ↓ 镜检
(4)固定时间、温度及样品块大小 时间：因材料而异，单细胞和动物材料较短，植物材料 及厚壁组织较长。1～12小时。
温度： 低温以抑制酶的活性，通常在0~4℃条件固定。 样品块大小：受固定液渗透能力影响，小块材料易得到 良好固定。
操作方法
1.福尔莫瓦支持膜的制作方法
膜
0.2~0.5%的 氯仿溶液
蒸馏 水
2.火棉胶膜用平皿水面展开法： 平皿中盛有双蒸馏水，滴两滴1~3%的火棉胶膜液， 待片刻溶剂挥发后，在膜上摆放洁净的铜网，滤纸捞起。 3.碳膜制作：用真空喷镀法制膜。
第二节 超薄切片的制作
超薄切片：是指厚度小于100 (50~70)纳米的切片。 要求：厚薄均匀、厚度符合标准； 无皱褶刀痕、震颤和沉淀； 细胞结构保存良好，具有良好的电子反差； 具有一定程度的机械强度。 制作流程：包括六大步，40多次操作 取材→固定→脱水→包埋→切片→染色→ 镜检
↓ 包埋 ↓ 切片 ↓ 染色
(3)染色方法： 通常将示踪剂加入进所有的处理液中。 1%~2%硝酸镧或 0.05%~0.8%辽红 与戊二醛固定 含示踪剂的 缓冲液漂洗 含相同浓度 示踪剂的 1%锇酸
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二、样品支持膜 为了增强样品的强度，在载网表面先覆一层薄膜。
1.对膜的要求： ❖本身没有结构，薄而透明，电子束易通过； ❖有足够的机械强度，经得住电子束的轰击； ❖不与样品发生化学反应。 ❖厚度在10～15nm
2.常用支持膜及其制备 福尔莫瓦膜（Formvar):
化学名称：聚乙烯醇缩甲醛. 特点：机械强度高，制作简便. 制作：0.2～0.5％的氯仿溶液，玻璃片汆出,水面剥离法。
固定
理功能。适于配各种固定液和材料漂洗液。
↓
脱水
↓
包埋
二钾胂酸盐 有毒，稳定性好。适用于细胞化学和
↓
缓冲液
保存脂肪的样品处理、钙离子定位研究
切片
↓
可长期保存
染色
↓ 镜检(4)固定时间、温度及来自品块大小取材↓
固定 时间：因材料而异，单细胞和动物材料较短，植物材料
↓
及厚壁组织较长。1～12小时。
脱水
↓
↓
蒸馏水洗净后再取材固定。
切片 ➢悬浮样品的获取：
↓
加入适量固定液悬浮固定后，低速离心收集成团块再固定。
染色 ➢ 野外取材： 保低温
↓
携带冰壶保存固定液和材料，确保动物材料的现场固定；
镜检
植物材料可保湿带回实验室再取材固定。
二、固定
取材
用化学或物理的方法迅速杀死细胞的过程
↓
1.固定的目的：在分子水平上真实地保存组织细胞生活
第四章 透射电镜生物样品 制备技术
第一节 载网和支持膜 第二节 超薄切片的制作 第三节 负染色技术
第一节 载网和支持膜
一、载网：用于承载样品的(直径为3mm)网状材料。 1.载网的类型及选择： 70％的透过率
铜网：常规超薄切片(200目以上)
金属网 载网
惰性网：细胞化学
非金属网： X射线元素分析
2.载网的清洗：酸碱法或有机溶剂、蒸馏水等洗净干燥。
取材
固定
漂洗
50%
70%
80%
聚合
37~60℃
23
包埋
2
浸透
过渡
100%
95%
室温
90%
修块
切片
捞片
观察
染色
一、取材 从动、植物机体上或细胞及微生物培养物中 获取所需要的研究材料的操作过程。
取材 ↓ 1.取材的原则要求：准、快、小、冷、轻五字原则。
固定 •准确：根据研究目的确定取材部位，取到典型部位。 ↓
脱水 •快速：材料离体后应在1分钟内投入固定液。 ↓
包埋 •体积小：固定液渗透力所限，样品体积为1mm³
↓ 切片
或1×3mm长条。
↓ 染色
•低温：固定液及器材需预冷(0~4 ℃)，以降低自溶酶的活性。
↓ 镜检
•防损伤：器械要锋利，切割轻巧，防挤压、牵拉损伤 组织细胞的内部结构。
2.取材方法： 注意部位和方向性。
温度： 低温以抑制酶的活性，通常在0~4℃条件固定。
包埋
↓ 切片
样品块大小：受固定液渗透能力影响，小块材料易得到 良好固定。
↓
染色
↓ 镜检
7. 注意事项
取材
↓
（1）控制固定温度0~4℃利于抑制酶的活性，减少细胞
镜检
待组织适度硬化后再解剖取材，作常规固定。
用于解剖关系复杂的组织（神经组织、脑垂体）
6.影响固定效果的因素
取材 (1)固定液的酸碱度：
↓
固定 固定液的酸碱度必须与被固定材料的酸碱度基本一致。
↓
脱水 例如多数动物的pH值平均为7.4，所以常用PH7.2~7.4；
↓
植物体的pH值为6.8~7.1，所以常用PH7.0~7.2；
固定 (2)双固定法： 戊二醛—锇酸双重固定
↓
脱水 (3)原位固定法：
↓
用于难解剖的、对缺氧敏感的组织器官，
包埋
在保持血液供应的状态，边解剖边滴加固定液，
↓
待组织适度硬化后再取材作常规固定。
切片
常用醛类固定：用于脑组织、植物叶片的气孔状态等
↓
染色 (4)灌流固定：
戊二醛
↓
通过血液循环的途径，将固定液灌注到相应部位，
火棉胶膜：1~2%醋酸戊脂溶液，平皿沉淀法。
碳膜：稳定性好，高分辨制样。
操作方法
1.福尔莫瓦支持膜的制作方法
膜
0.2~0.5%的 氯仿溶液
蒸馏 水
2.火棉胶膜用平皿水面展开法：
平皿中盛有双蒸馏水，滴两滴1~3%的火棉胶膜液， 待片刻溶剂挥发后，在膜上摆放洁净的铜网，滤纸捞起。
3.碳膜制作：用真空喷镀法制膜。
固定
状态的细节，尽量减少细胞的死后变化。
↓
脱水 2.固定的类型：
↓
物理固定法： 超低温快速冷冻固定法
包埋
固定 化学固定法：使用化学试剂快速杀死细胞
↓
3.固定液的作用：
切片
•迅速均匀渗透到细胞内部，稳定各种细胞成分；
↓
•破坏细胞的酶系统，阻止细胞的自溶；
染色
•通过化学作用建立分子交联，形成细胞骨架；
↓
第二节 超薄切片的制作
超薄切片：是指厚度小于100 (50~70)纳米的切片。
要求：厚薄均匀、厚度符合标准； 无皱褶刀痕、震颤和沉淀； 细胞结构保存良好，具有良好的电子反差； 具有一定程度的机械强度。
制作流程：包括六大步，40多次操作
取材→固定→脱水→包埋→切片→染色→ 镜检
超薄切片制作流程图
0~4℃
↓
包埋
配成2.0～5.0％。 选用：单细胞 微生物 动物组织 植物组织 厚壁组织
↓
切片
1~2.0
浓度
%
高
5.0%
↓
染色 锇酸(OsO4) 是唯一能保存脂肪的固定剂，具有电子染
色作用。能固定脂蛋白、核蛋白，不能保
↓
存核酸和糖类。
镜检
5.固定方法：
取材 ↓
(1)单固定法： 用于易于渗透的材料和酶的细胞化学
•提供一定的电子反差。
镜检
4.常用固定剂及其特点
取材
↓ 醛类： 甲醛、戊二醛、多聚甲醛和丙烯醛
固定 戊二醛：穿透力强，能很好固定蛋白质和糖元、保存核
↓
酸、核蛋白，对微管、内质网等细胞膜系统保 存较好；不能保存脂类物质，无电子染色作用。
脱水 配制方法：常用0.1M的磷酸盐缓冲液(pH6.8~7.2)
取材 ➢ 动物材料的获取：
↓
急性处死或麻醉后，在1～2分钟解剖出所需材料，切成
固定
标准块立即投入固定液，低温(0～4℃)保存；特殊难
↓
取的材料必须原位固定或灌流固定，再取材投入固定液。
脱水 ➢ 植物材料的获取： 需抽气使样品沉底
↓
叶片切取1×3㎜长条；根、茎切取标准块；表面有毛刺的
包埋 材料先用酶处理使之软化，表面有蜡质的叶片先脱蜡，
包埋
原生动物及胚胎适于pH为8.0~8.5，胃黏膜pH为8.5
↓
效果最佳；
切片 (2)固定液的渗透压： 直接影响被固定细胞的原有特定形态
↓
染色 固定液与被固定组织之间必须保持渗透平衡。
↓
镜检
电解质：钾钠钙(0.5% CaCl)可防止膨胀 非电解质：蔗糖、葡萄糖膜系统稳定剂
（3）缓冲液类型
取材
↓ 磷酸盐缓冲液：仿效细胞外液成分配制，无毒且富有生