生物样品超薄切片技术

第四章 透射电镜生物样品 制备技术
第一节 载网和支持膜 第二节 超薄切片的制作 第三节 负染色技术
第一节 载网和支持膜
一、载网：用于承载样品的(直径为3mm)网状材料。 1.载网的类型及选择： 70％的透过率
铜网：常规超薄切片(200目以上)
金属网 载网
惰性网：细胞化学
非金属网： X射线元素分析
2.载网的清洗：酸碱法或有机溶剂、蒸馏水等洗净干燥。
取材
固定
漂洗
50%
70%
80%
聚合
37~60℃
23
包埋
2
浸透
过渡
100%
95%
室温
90%
修块
切片
捞片
观察
染色
一、取材 从动、植物机体上或细胞及微生物培养物中 获取所需要的研究材料的操作过程。
取材 ↓ 1.取材的原则要求：准、快、小、冷、轻五字原则。
固定 •准确：根据研究目的确定取材部位，取到典型部位。 ↓
镜检
待组织适度硬化后再解剖取材，作常规固定。
用于解剖关系复杂的组织（神经组织、脑垂体）
6.影响固定效果的因素
取材 (1)固定液的酸碱度：
↓
固定 固定液的酸碱度必须与被固定材料的酸碱度基本一致。
↓
脱水 例如多数动物的pH值平均为7.4，所以常用PH7.2~7.4；
↓
植物体的pH值为6.8~7.1，所以常用PH7.0~7.2；
固定
理功能。适于配各种固定液和材料漂洗液。
↓
脱水
↓
包埋
二钾胂酸盐 有毒，稳定性好。适用于细胞化学和
↓
缓冲液
保存脂肪的样品处理、钙离子定位研究
切片
↓
可长期保存
染色
↓ 镜检
(4)固定时间、温度及样品块大小
取材
↓
固定 时间：因材料而异，单细胞和动物材料较短，植物材料
↓
及厚壁组织较长。1～12小时。
脱水
↓
二、样品支持膜 为了增强样品的强度，在载网表面先覆一层薄膜。
1.对膜的要求： ❖本身没有结构，薄而透明，电子束易通过； ❖有足够的机械强度，经得住电子束的轰击； ❖不与样品发生化学反应。 ❖厚度在10～15nm
2.常用支持膜及其制备 福尔莫瓦膜（Formvar):
化学名称：聚乙烯醇缩甲醛. 特点：机械强度高，制作简便. 制作：0.2～0.5％的氯仿溶液，玻璃片汆出,水面剥离法。
脱水 •快速：材料离体后应在1分钟内投入固定液。 ↓
包埋 •体积小：固定液渗透力所限，样品体积为1mm³
↓ 切片
或1×3mm长条。
↓ 染色
•低温：固定液及器材需预冷(0~4 ℃)，以降低自溶酶的活性。
↓ 镜检
•防损伤：器械要锋利，切割轻巧，防挤压、牵拉损伤 组织细胞的内部结构。
2.取材方法： 注意部位和方向性。
固定
状态的细节，尽量减少细胞的死后变化。
↓
脱水 2.固定的类型：
↓
物理固定法： 超低温快速冷冻固定法
包埋
固定 化学固定法：使用化学试剂快速杀死细胞
↓
3.固定液的作用：
切片
•迅速均匀渗透到细胞内部，稳定各种细胞成分；
↓
•破坏细胞的酶系统，阻止细胞的自溶；
染色
•通过化学作用建立分子交联，形成细胞骨架；
↓
包埋
原生动物及胚胎适于pH为8.0~8.5，胃黏膜pH为8.5
↓
源自文库效果最佳；
切片 (2)固定液的渗透压： 直接影响被固定细胞的原有特定形态
↓
染色 固定液与被固定组织之间必须保持渗透平衡。
↓
镜检
电解质：钾钠钙(0.5% CaCl)可防止膨胀 非电解质：蔗糖、葡萄糖膜系统稳定剂
（3）缓冲液类型
取材
↓ 磷酸盐缓冲液：仿效细胞外液成分配制，无毒且富有生
↓
蒸馏水洗净后再取材固定。
切片 ➢悬浮样品的获取：
↓
加入适量固定液悬浮固定后，低速离心收集成团块再固定。
染色 ➢ 野外取材： 保低温
↓
携带冰壶保存固定液和材料，确保动物材料的现场固定；
镜检
植物材料可保湿带回实验室再取材固定。
二、固定
取材
用化学或物理的方法迅速杀死细胞的过程
↓
1.固定的目的：在分子水平上真实地保存组织细胞生活
取材 ➢ 动物材料的获取：
↓
急性处死或麻醉后，在1～2分钟解剖出所需材料，切成
固定
标准块立即投入固定液，低温(0～4℃)保存；特殊难
↓
取的材料必须原位固定或灌流固定，再取材投入固定液。
脱水 ➢ 植物材料的获取： 需抽气使样品沉底
↓
叶片切取1×3㎜长条；根、茎切取标准块；表面有毛刺的
包埋 材料先用酶处理使之软化，表面有蜡质的叶片先脱蜡，
↓
包埋
配成2.0～5.0％。 选用：单细胞 微生物 动物组织 植物组织 厚壁组织
↓
切片
1~2.0
浓度
%
高
5.0%
↓
染色 锇酸(OsO4) 是唯一能保存脂肪的固定剂，具有电子染
色作用。能固定脂蛋白、核蛋白，不能保
↓
存核酸和糖类。
镜检
5.固定方法：
取材 ↓
(1)单固定法： 用于易于渗透的材料和酶的细胞化学
第二节 超薄切片的制作
超薄切片：是指厚度小于100 (50~70)纳米的切片。
要求：厚薄均匀、厚度符合标准； 无皱褶刀痕、震颤和沉淀； 细胞结构保存良好，具有良好的电子反差； 具有一定程度的机械强度。
制作流程：包括六大步，40多次操作
取材→固定→脱水→包埋→切片→染色→ 镜检
超薄切片制作流程图
0~4℃
•提供一定的电子反差。
镜检
4.常用固定剂及其特点
取材
↓ 醛类： 甲醛、戊二醛、多聚甲醛和丙烯醛
固定 戊二醛：穿透力强，能很好固定蛋白质和糖元、保存核
↓
酸、核蛋白，对微管、内质网等细胞膜系统保 存较好；不能保存脂类物质，无电子染色作用。
脱水 配制方法：常用0.1M的磷酸盐缓冲液(pH6.8~7.2)
固定 (2)双固定法： 戊二醛—锇酸双重固定
↓
脱水 (3)原位固定法：
↓
用于难解剖的、对缺氧敏感的组织器官，
包埋
在保持血液供应的状态，边解剖边滴加固定液，
↓
待组织适度硬化后再取材作常规固定。
切片
常用醛类固定：用于脑组织、植物叶片的气孔状态等
↓
染色 (4)灌流固定：
戊二醛
↓
通过血液循环的途径，将固定液灌注到相应部位，
温度： 低温以抑制酶的活性，通常在0~4℃条件固定。
包埋
↓ 切片
样品块大小：受固定液渗透能力影响，小块材料易得到 良好固定。
↓
染色
↓ 镜检
7. 注意事项
取材
↓
（1）控制固定温度0~4℃利于抑制酶的活性，减少细胞
火棉胶膜：1~2%醋酸戊脂溶液，平皿沉淀法。
碳膜：稳定性好，高分辨制样。
操作方法
1.福尔莫瓦支持膜的制作方法
膜
0.2~0.5%的 氯仿溶液
蒸馏 水
2.火棉胶膜用平皿水面展开法：
平皿中盛有双蒸馏水，滴两滴1~3%的火棉胶膜液， 待片刻溶剂挥发后，在膜上摆放洁净的铜网，滤纸捞起。
3.碳膜制作：用真空喷镀法制膜。