小鼠脾脏中分离淋巴细胞之欧阳光明创编
医学免疫学实验四 小鼠脾脏、胸腺单个核细胞分离及流式染色实验
正确抓取小鼠并处死
颈椎脱臼处死小鼠：用拇指和食指用力往下按住 鼠头，另一只手抓住鼠尾，用力稍向后上方一拉 ，使之颈椎脱臼，造成脊髓与脑髓断离
实验步骤：
（一）取小鼠脾脏： 小鼠颈椎脱位处死，置70%乙醇溶
液中浸泡3-5min； 取其后右侧卧位，消毒左侧背腹交
界处皮肤，取脾脏并尽量将去脂肪 及筋膜组织。
（二）制备单个核细胞悬液：
1. 将取出的脾脏置于盛有PBS缓冲液(10ml)的平皿中，然后再 置于尼龙指套中。用针芯轻轻碾磨使单个核细胞通过尼龙指 套悬浮于平皿中；
2. 吸取平皿中细胞悬液置于15ml离心管中，再取5mlPBS冲 洗培养皿后移入15ml离心管。以1500rpm离心5min。弃 去上清，轻轻弹散细胞沉淀,加红细胞裂解液ACK至2-3ml ，轻轻吹打混匀并放置3-4min，以破坏红细胞。然后加 PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心5min；
上，待它与混合体系中的细胞反应后，利用磁力的作用，使与致 敏结合的细胞与其它物质分离，达到纯化、分离的目的。
密度梯度离心法
Ficoll-Hypaque密度梯度离心法：人外周血单个核细 胞(peripheral blood mononuclear cell PBMC)包 括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形状和比重与其他细 胞不同，利用密度在1.077±0.001g/L之间近于等渗的 Ficoll-Hypaque混合溶液(称为淋巴细胞分层液)作密 度梯度离心时,•各种血液成分将按密度梯度重新分布聚 集。
当脾功能亢进时可破坏大量血小板及血细胞。脾有丰富 的血窦，可储存一定量（约200毫升）的血液，在机体 剧烈运动或爬山或突然失血时，脾的平滑肌收缩，放出 储存血液以补充机体的需要。
胸腺（thymus）
【CN110016462A】从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法【专利】
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910125091.4(22)申请日 2019.02.20(71)申请人 优睿赛思（武汉）生物科技有限公司地址 430000 湖北省武汉市东湖开发区高新大道666号生物创新园C6栋C6221室(72)发明人 娄阳 吴海 (74)专利代理机构 武汉河山金堂专利事务所(普通合伙) 42212代理人 胡清堂(51)Int.Cl.C12N 5/0781(2010.01)(54)发明名称从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法(57)摘要本发明公开了一种从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法，本发明利用采用多重淋巴细胞表面标记物抗体的负筛选，以及快捷的荧光标记抗原物质方法的建立和利用荧光标记抗原物质来进行高特异性的筛选，从而实现对单个抗原特异性B淋巴细胞的高通量快速筛选，并且使最终获得抗体特异性B淋巴细胞的阳性率从传统杂交瘤方法的不足5％，提高至30％。
所以，该方案不但能够极大程度缩短单克隆抗体开发的时间，而且能够大大提高所获得单克隆抗体的数量和多样性。
权利要求书1页 说明书5页 附图3页CN 110016462 A 2019.07.16C N 110016462A权 利 要 求 书1/1页CN 110016462 A1.一种从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法，所述脾脏细胞为经过普通抗原免疫的脾脏细胞，其步骤如下：1)利用以生物标记的非B细胞淋巴细胞表面标志物抗体对脾脏细胞进行负筛选，再利用亲和素磁珠与磁性分离原理去除非B细胞，以提高脾脏细胞中B淋巴细胞相对丰度；2)利用荧光标记的IgM多克隆抗体和预标记筛选用抗原，对步骤1得到的脾脏细胞进行进一步负筛选，以流式细胞技术去表面不表达IgG分子的B细胞，保留与预标记筛选抗原结合的目标淋巴细胞；3)利用7-AAD进行分选，去除死细胞；4)用流式细胞仪，进行单细胞的筛选，得到目标淋巴细胞。
实验四脾淋巴细胞分离 邵(1)
活细胞 死细胞
自动化细胞计数器Luna™ 韩国Logos Biosystems公司
一块计数板/2组
在5×104 – 1×107 细胞/ml的浓度范围 3-60 µm的细胞直径范围内
注意事项
1. 通常分离细胞是为了下一步实验。有些实验如需要对细胞 作进一步培养，则在分离细胞时一定要严格无菌操作。
阴性实验结果的原因分析？
个性问题 抗原和抗体反放是否会出现结果？
判断抗原的阳性程度？
弧形沉淀及沉淀倾斜的原因分析？
（四）计算细胞活力
1. 50μl细胞悬液+ 50μl的0.2% 苔盼兰溶液并混匀；
2. 显微镜下观察：
如果细胞被染成蓝色，旋转显 微镜微调节钮，细胞无反光， 则为死细胞；而细胞不被染色， 晶莹透亮，旋转显微镜调节钮， 细胞明显反光而且有立体感， 为活细胞；
3. 计算细胞活力：计数100个 细胞中活细胞的百分率，一般 活力应在95%以上。
2. 在用ACK破坏红细胞时，不要时间过长，以免破坏其他 细胞。
预实验结果
Control
50ul PBS+ 0.5ul Ab
50ul PBS+ 2ul Ab
APC-CD3 T cells
PE-CD19 B cells 分析数据时建议只放一组实验组，各人可自行安排
实验二报告分析
共性问题： 不能结合本组实验进行结果分析
MACS
➢ 磁性微珠是20世纪80年代初以高 分子材料和金属离子（如Fe3O4） 为原料聚合而成的一种以金属离 子为核心、外层均匀地包裹高分 子聚合体的固相微粒。
➢ 以磁性微珠为载体，包被上针对 某种细胞表面抗原的特异性抗体 即可制成免疫磁性微珠。
流式细胞仪（flow cytometer）是一种能够探测和计数以单细胞液体流形 式穿过激光束的细胞检测装置，由于在检测中使用的细胞标志示踪物质 为荧光标记物，因此，用来分离、鉴定细胞的流式细胞仪有被称为荧光 激活细胞分类仪（fluorescence activated cell sorter, FACS）,是分离和鉴 定细胞群及亚群的一种强而有力的应用工具。
医学免疫学实验四 小鼠脾脏、胸腺单个核细胞分离及流式染色实验
NK细胞表面标志
人类细胞表面标志主要以 CD16、CD56来 认定，临床上将CD3-CD56+CD16+淋巴 细胞认定为NK细胞。
流式细胞术(FCM)
流式细胞术(FCM)是一种对处在液流中的单个细胞或其它生物微 粒（如细菌）等进行快速定量分析和分选的技术，它将免疫荧光 与细胞生物学、流体力学、光学和电子计算机等多种学科的高新 技术结合，进行细胞和分子水平的基础理论与临床应用研究。
MACS
磁性微珠是20世纪80年代初以高分子材料和金属离子（如Fe3O4 ）为原料聚合而成的一种以金属离子为核心、外层均匀地包裹高 分子聚合体的固相微粒。
以磁性微珠为载体，包被上针对某种细胞表面抗原的特异性抗体 即可制成免疫磁性微珠。
通常有二种分离方式：阳性分离和阴性分离。 基本原理及步骤：首先将抗特异细胞表面抗原的抗体致敏到磁珠
胸腺功能： （1）产生T淋巴细胞 （2）产生和分泌胸腺素和激素类物质
免疫细胞分离方法
1. 根据不同免疫细胞表面标志:FAC： 1）根据细胞比重差异：自然沉降法、密度梯 度离心法、改变细胞密度法 2）根据细胞黏附特性：B细胞黏附于尼龙棉 3）根据细胞对渗透压变化的敏感度：红细胞 对低渗敏感
（二）制备单个核细胞悬液：
1. 将取出的脾脏置于盛有PBS缓冲液(10ml)的平皿中，然后再 置于尼龙指套中。用针芯轻轻碾磨使单个核细胞通过尼龙指 套悬浮于平皿中；
2. 吸取平皿中细胞悬液置于15ml离心管中，再取5mlPBS冲 洗培养皿后移入15ml离心管。以1500rpm离心5min。弃 去上清，轻轻弹散细胞沉淀,加红细胞裂解液ACK至2-3ml ，轻轻吹打混匀并放置3-4min，以破坏红细胞。然后加 PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心5min；
脾脏分离淋巴细胞
从小鼠脾脏中分离淋巴细胞
方法一:
１用注射器内芯或者研棒研磨过100目筛网，Hank’s液冲洗，收集分离的脾细胞悬液。
２另取无菌试管，先加入淋巴细胞分离液，然后将试管倾斜，略放平，吸取刚刚制备的细胞悬液缓慢的加入试管中，一般分离液和细胞悬液的体积比为１：２，要轻要慢，不要冲破了淋巴细胞分离液和细胞悬液的界面。
室温水平离心2000转/分钟，30分钟。
３离心后取出试管，可以看到不同的分层，一般上面是非细胞成分和细胞碎片，接下来是单个核细胞，再往下是红细胞等。
吸走上层非细胞层弃之，吸出单个核层在另外无菌试管中，因为淋巴细胞分离液对细胞有毒性作用，加入PBS离心洗两遍（1000转/分钟，10分钟）。
４倾倒上清，用RPMI-1640重悬细胞。
方法二：
用注射器内芯或者研棒研磨过100目筛网，Hank’s液冲洗，收集分离的脾细胞悬液，2000r/min离心3min，弃上清。
加红细胞裂解液8mL，混匀脾细胞，静置5-6min，待红细胞完全破碎，2000r/min离心3min，弃上清去除红细胞，Hank’s液洗1-2遍，用RPMI-1640（含10%胎牛血清）重悬细胞。
小鼠免疫器官的解剖实验报告
小鼠免疫器官的解剖实验报告一、实验目的1、明确各免疫器官分布与形态结构，能熟练找到各免疫器官，弄清中枢免疫器官与外周免疫器官的区别与联系。
2、学握密度梯度离心法分离小鼠脾脏淋巴细胞的方法，熟悉脾脏淋巴细胞的形态与功能。
二、实验原理脾脏是外周免疫器官之一，是人体最大的淋巴器官。
它生在腹腔左上方，质地比较脆，容易外伤。
一般来讲，脾脏有三大功能：首先它是人体的“血库”，当人体休息、安静时，它贮存血液，当处于运动、失血、缺氧等应激状态时，它又将血液排送到血循环中，以增加血容量；其次，脾脏犹如一台“过滤器”，当血液中出现病菌、抗原、异物、原时，脾脏中的巨噬细胞、淋巴细胞就会将其吃掉此外，脾脏还可以制造免疫球蛋白、补体等免疫物质，发挥免疫作用。
脾是血循环中重要的滤过器，能清除血液中的异物、病菌以及衰老死亡的细胞，特别是红细胞和血小板。
因此，脾功能亢进时可能会引起红细胞及血小板的减少。
脾脏还有产生淋巴细胞的功能。
我们利用小鼠来观察脾脏的淋巴细胞。
小鼠淋巴细胞的比重为1.088，利用比重为1.088的淋巴细胞分离液，将脾细胞是液置于分离液上层，通过梯度离心的方法，在分离液与脾细胞是液交界液面处分离得到脾脏淋巴细胞。
三、实验器材KM种小鼠，PBS缓冲液，淋巴细胞分离液，200目不锈钢网，解剖器械四、实验步骤1、杀死老鼠，取出小鼠的脾脏，在pbs缓冲液中冲洗干净。
2、将小鼠脾脏至于200目铜网中，铜网绑定在烧杯上面，剪碎、碾磨，边碾磨边加PBS冲洗，制得脾细胞是液。
3、将制得的脾细胞悬液转移到10ml的离心管中，1000r/min5min离心洗涤，倒掉上清，加入5mlPBS再离心洗涤一次。
4、加入5mlPBS将洗涤的脾脏细胞吹散、是浮，缓慢加入淋巴细胞分离液上层，细胞悬液与分离液体体积比为1：1。
5、2000r/min离心30min。
6、小心吸取中间层细胞，1000r/min5min离心洗涤两次。
7、将制得的淋巴细胞滴于玻片，镜检。
小鼠脾脏调节性T细胞分离纯化方法比较
小鼠脾脏调节性T细胞分离纯化方法比较范尔钟;李颖;锡琳;欧阳昱晖;张罗【期刊名称】《中国耳鼻咽喉头颈外科》【年(卷),期】2010()10【摘要】在变应性鼻炎的基础研究中,探讨调节性T细胞（T regulatory cell,Treg 细胞）中转录因子FoxP3对细胞因子受体Ebi3表达调控的分子机制,是以小鼠脾脏淋巴细胞为研究对象,可以通过CD荧光抗体标记,免疫磁珠分选法或流式细胞分选法获得Treg细胞。
因此,建立有效的小鼠脾脏淋巴细胞分离技术是至关重要的前期工作,是进行这些研究的先决条件。
本文采用了两种方法对小鼠脾脏Treg细胞进行分离,并对脾脏Treg细胞活性与获得率进行了比对分析。
【总页数】3页(P550-552)【关键词】T淋巴细胞,调节性;细胞分离;鼻炎,变应性,常年性;小鼠【作者】范尔钟;李颖;锡琳;欧阳昱晖;张罗【作者单位】北京市耳鼻咽喉科研究所;首都医科大学附属北京同仁医院耳鼻咽喉头颈外科;耳鼻咽喉头颈科学教育部重点实验室(首都医科大学)【正文语种】中文【中图分类】R735.704【相关文献】1.免疫磁珠两步法体外分离纯化小鼠脾脏CD4+CD25+调节性T细胞的应用研究[J], 黄克力;王巍;谢波;朱平;卢聪;朱小兰;麦明杰;沈二霞;吴若彬;刘怀普;黄晶晶2.流产模型孕鼠脾脏调节性T细胞分离纯化方法的初步建立 [J], 殷治华;赵富玺;穆雅琴;刘润花;王健;冯婷婷;齐彦3.免疫磁珠负性分离纯化小鼠脾脏CD8^+ T细胞 [J], 杨曌;傅晓岚;尚小云;吴玉章;赵建平;王莉4.小鼠脾脏自然杀伤性树突细胞纯化方法的比较 [J], 陈蓉明;郑秋红;龚福生;应敏刚;谢云青5.不同分离方法对小鼠脾脏调节性T细胞表达特征的影响 [J], 李颖;欧阳昱晖;范尔钟;锡琳;张罗因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
两种方法分离小鼠脾原始T淋巴细胞效果比较
小鼠三个不同部位巨噬细胞的分离培养与鉴定
小鼠三个不同部位巨噬细胞的分离培养与鉴定[摘要] 目的建立小鼠三种不同部位巨噬细胞体外分离培养的方法，并对其进行鉴定。
方法分别从小鼠腹腔、脾脏、骨髓中分离获取巨噬细胞，经台盼蓝染色计数后于含10%胎牛血清的DMEM培养液、1%小牛血清的RPMI-1640培养基中培养；通过活细胞形态观察；HE 染色光镜观察；吞噬鸡红细胞功能检测；酸性磷酸酶及非特异性酯酶染色测定细胞内酶的表达等生物学技术鉴定培养的贴壁细胞性质。
结果获得高纯度的巨噬细胞，具有巨噬细胞的形态特征，具备良好的吞噬功能，鸡红细胞吞噬率分别为腹腔94.68%，脾脏92.47%，骨髓93.11%；酸性磷酸酶染色阳性率为腹腔89.43%，脾脏85.21%，骨髓88.55%；α-醋酸奈酚酯酶染色阳性率为腹腔85.32%，脾脏81.81%，骨髓85.76%。
结论小鼠三个不同部位均可简便实用的分离出巨噬细胞，可以满足不同的研究目的。
巨噬细胞不仅是许多病原体的宿主细胞,而且在先天性和后天性免疫应答过程中起着关键性作用[1-3],比如调节促炎和抗炎细胞因子的释放、吞噬或杀死胞内微生物和肿瘤细胞、降解和提呈抗原等。
它还可以与其他免疫细胞协同发挥更大的功能，比如树突状细胞、粒细胞、NK细胞和T细胞等。
小鼠巨噬细胞吞噬作用是反映机体非特异性免疫功能的主要指标，也是临床免疫学实验常用的方法之一。
现将已有的巨噬细胞分离方法改进，从3种不同部位分离小鼠巨噬细胞，并做以对比。
1 材料与方法1.1主要试剂和仪器DMEM培养基（Hyclone）；RPMI-1640培养基（GIBCO）；胎牛血清（GIBCO）；倒置显微镜（Olympus）；CO2培养箱（Binder，Thermo）。
1.2 从小鼠腹腔中分离巨噬细胞（1）取6~8周龄左右的小鼠，腹腔注射2mL无菌的液体石蜡。
待3~4d后收集腹腔细胞。
（2）颈椎脱臼法法处死小鼠，消毒，用注射器抽取5mL含双抗的RPMI1640培养基注入腹腔，用绵球轻揉腹部1~2 min，静置5min，用眼科镊稍提起腹腔，并用眼科剪剪开一个小口，用吸管吸取细胞悬液，移入离心管中。
小鼠淋巴细胞的分离培养
小鼠淋巴细胞的分离培养
一、血液中淋巴细胞的分离：
1在1.5ML离心管中加入淋巴细胞分离液0.7ML；
2眼部采集小鼠的抗凝血，抗凝剂20%.。
3轻轻将血液加入淋巴细胞分离液的表面，立即以2000—2500转/分离心10MIN。
4小心吸取上层细胞，转移至另一1.5ML离心管中,再用HANK’S 悬浮至1.5ML，再离心，去上清，再悬浮，等待分型用。
二、鼠脾脏中淋巴细胞的分离：
1无菌采集鼠的脾脏，且灭菌注射器的弯针头轻轻扎取，尽可能使单个细胞分离，再分别用4层灭菌纱布过滤2次。
2将滤液小心加入淋巴细胞分离液中。
离心。
3 吸取上层淋巴细胞，HANK‘S液洗涤2次（尽可能去除淋巴
细胞分离液）。
4加入1640培养液进行培养。
、
*淋巴细胞分离液不低于全部液体的50%。
一种从小鼠肠粘膜中分离纯化固有淋巴细胞的方法[发明专利]
![一种从小鼠肠粘膜中分离纯化固有淋巴细胞的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/c9d0953d53ea551810a6f524ccbff121dc36c553.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810208300.7(22)申请日 2018.03.14(71)申请人 南京鼓楼医院地址 210008 江苏省南京市鼓楼区中山路321号(72)发明人 刘颂 管文贤 王萌 缪骥 (74)专利代理机构 南京钟山专利代理有限公司32252代理人 戴朝荣(51)Int.Cl.C12N 5/078(2010.01)(54)发明名称一种从小鼠肠粘膜中分离纯化固有淋巴细胞的方法(57)摘要本发明提供一种从小鼠肠粘膜中分离纯化固有淋巴细胞的方法，具体过程如下：获取动物小肠，经清洗、剪碎后置于离心管中，加入上皮剥离液搅拌剥离；移除上清液，加入中和液1，搅拌；移除上清液，加入中和液2，静置分离；移除上清液，加入消化酶混合液，搅拌消化；加入HBSS离心，移除上清后，用HBSS重悬后过滤；所得滤液离心后用Percoll液重悬后移至底部铺有Percoll液的离心管；离心，中间层细胞收集，离心，收集沉淀；用稀释后抗体混悬所得的细胞团，离心，收集沉淀；用流式缓冲液重悬沉淀，上机流式细胞仪得到ILC。
该方法从小鼠肠粘膜中分离并纯化出固有淋巴细胞，获取细胞数量多、活率高、纯度高，为肠道黏膜免疫的研究奠定研究基础。
权利要求书2页 说明书5页 附图4页CN 108410820 A 2018.08.17C N 108410820A1.一种从小鼠肠粘膜中分离纯化固有淋巴细胞的方法，其特征在于，具体过程如下：1）获取动物小肠，经清洗、剪碎后置于离心管中，加入上皮剥离液搅拌剥离；2）移除上清液，加入中和液1，搅拌；3）移除上清液，加入中和液2，静置分离；4）移除上清液，加入消化酶混合液，搅拌消化；5）加入HBSS离心，移除上清后，用HBSS重悬后过滤；6）步骤5）所得滤液离心后用第一Percoll液重悬后移至底部铺有第二Percoll液的离心管；7）离心，取中间层细胞收集，再次离心，收集沉淀；8）用稀释后抗体混悬第7）所得的细胞团，离心，收集沉淀；9）用流式缓冲液重悬沉淀，上机流式细胞仪得到ILC。
小鼠脾脏淋巴细胞分离与计数实验报告
小鼠脾脏淋巴细胞分离与计数实验报告小鼠脾脏淋巴细胞分离与计数实验报告一、引言淋巴细胞是免疫系统中重要的细胞成分，其在免疫应答和抗体产生中发挥着关键作用。
为了研究淋巴细胞的功能和特性，需要将其从组织中分离出来并进行计数。
本实验旨在通过对小鼠脾脏进行淋巴细胞分离和计数，来获取关于淋巴细胞数量和纯度的信息。
二、材料与方法1. 实验动物：使用C57BL/6小鼠。
2. 仪器与试剂：离心管、离心机、PBS缓冲液、0.83%氯化铵溶液。
3. 实验步骤：A. 准备工作：i. 将离心管预冷至4℃。
ii. 准备PBS缓冲液，并保持在4℃。
B. 小鼠准备：i. 用无菌技术将小鼠安全固定在手术台上。
ii. 使用无菌器械，剪开腹部皮肤和腹壁，暴露脾脏。
iii. 小心取出脾脏并放入含有PBS缓冲液的离心管中。
C. 细胞分离：i. 使用无菌器械，将脾脏组织切碎至细胞悬浮液状态。
ii. 将细胞悬浮液通过70μm滤网过滤，以去除大块组织残渣。
iii. 向过滤后的细胞悬浮液中加入等体积的0.83%氯化铵溶液，进行红细胞溶解。
iv. 用PBS缓冲液洗涤淋巴细胞沉淀，重复此步骤2-3次。
D. 细胞计数：i. 取适量的淋巴细胞悬浮液，加入等体积的尝试涂片溶剂进行稀释。
ii. 在尝试涂片上使用布朗管计数室计数淋巴细胞数量。
三、结果根据实验操作所得数据，我们得到了以下结果：1. 成功分离出小鼠脾脏中的淋巴细胞。
2. 经过红细胞溶解和洗涤步骤后，淋巴细胞沉淀呈现白色悬浮液状态。
3. 在计数室中观察到淋巴细胞的形态特征，如小型、圆形和较大的核。
四、讨论本实验成功地分离出了小鼠脾脏中的淋巴细胞，并通过计数室观察到了其形态特征。
然而，有一些潜在问题需要考虑和改进：1. 纯度问题：尽管我们成功分离出淋巴细胞，但在实验过程中是否存在其他细胞类型的污染仍需进一步验证。
可以通过流式细胞术等技术来评估纯度。
2. 细胞活力：在实验过程中，我们没有对淋巴细胞进行活力测试。
小鼠脾脏淋巴细胞分离与计数实验报告
小鼠脾脏淋巴细胞分离与计数实验报告1. 引言小鼠脾脏淋巴细胞是免疫系统中重要的组成部分，它们在抵御病原体侵袭和保护机体免受自身免疫疾病侵害中发挥着关键的作用。
因此，为了研究小鼠脾脏淋巴细胞的特性和功能，我们需要将其从脾脏中分离出来并进行计数。
本实验旨在描述小鼠脾脏淋巴细胞的分离与计数方法。
2. 材料与方法2.1 实验材料•小鼠脾脏样品•细胞培养基•消化酶•离心管•细胞计数板•显微镜2.2 实验方法2.2.1 小鼠脾脏样品的获取1.选择适龄的小鼠，以确保其脾脏发育成熟。
2.用消毒工具将小鼠颈部暴露，进行脾脏的解剖。
3.将脾脏置于无菌的容器中，迅速将其转移到实验室。
2.2.2 小鼠脾脏淋巴细胞的分离1.将小鼠脾脏放置在无菌离心管中，并加入足够的细胞培养基。
2.使用搅拌器或离心机将脾脏组织均匀分散于培养基中。
3.加入消化酶，按照说明书中的浓度和时间进行消化。
4.在消化结束后，用细胞培养基冲洗脾脏组织，以去除余留的消化酶。
2.2.3 小鼠脾脏淋巴细胞的计数1.取适量的脾脏细胞悬液，加入细胞计数板中。
2.在显微镜下观察并计数细胞计数板中的淋巴细胞数量。
3. 实验结果3.1 小鼠脾脏样品的获取从适龄的小鼠身上成功解剖出脾脏，并将其转移到实验室。
3.2 小鼠脾脏淋巴细胞的分离经过消化酶的作用，小鼠脾脏细胞成功地被分离并悬浮于培养基中。
3.3 小鼠脾脏淋巴细胞的计数通过显微镜观察，我们计数了细胞计数板中的淋巴细胞数量，并记录了结果。
具体数据如下： 1. 格子1：20个淋巴细胞 2. 格子2：18个淋巴细胞 3. 格子3：22个淋巴细胞 4. 格子4：19个淋巴细胞根据计数结果求平均值，得到平均每格淋巴细胞数目为19.75个。
4. 结论根据我们的实验结果，我们成功地分离出小鼠脾脏淋巴细胞，并进行了有效的计数。
通过计数结果，可以推断小鼠脾脏淋巴细胞的数量在每格约为19.75个左右。
这些实验结果为进一步研究小鼠脾脏淋巴细胞的特性和功能提供了基础数据。
小鼠脾脏淋巴细胞检测方法
小鼠脾脏淋巴细胞检测方法说实话小鼠脾脏淋巴细胞检测这事儿，我一开始也是瞎摸索。
我试过好多种方法，走了不少弯路呢。
我最早的时候，那就是按照一些书上的基本步骤来。
先得把小鼠处死，这一步可得小心点，千万不要把脾脏什么的给弄破弄坏了，就好比你拆一个特别精密的小零件，得小心翼翼的，不然就全乱套了。
然后取脾的时候，我就出过岔子。
有次取脾太着急，结果把旁边的一些组织也带出来了不少，这就会影响后面步骤的准确性。
我后来就明白了，得用镊子特别小心地把脾脏完整地分离出来才好。
取出来脾脏之后就要研磨来制备细胞悬液。
我研磨的时候一开始总是掌握不好力度，要么就是研磨得太轻了，细胞没有完全释放出来，就像你榨果汁，但是力气小了，好多果肉还在果渣里一样；要么就是研磨得太重，把细胞弄破了一些，这就惨了。
经过好多回试验，我才逐渐掌握了那个合适的力度，就像你慢慢找到了开锁的正确手感一样。
制备好细胞悬液后下面就是分离淋巴细胞了。
有密度梯度离心法，可这方法里那个离心的转速啊，就像一个神秘的数字，我试了好几个不同的转速，才找到了最适合的那个数值，能把淋巴细胞比较干净地分离出来。
刚开始的时候要么转速不对，淋巴细胞和别的细胞混在一起分不开，要么就是纯度不够。
对于检测淋巴细胞数量和活性这一步，我以前用过台盼蓝染色的方法。
但这个染液的量得用好，有一次染液加多了，结果看细胞都花了眼，都辨不清死活了。
后来知道就只能加那么一点点，就够覆盖细胞就好，然后在显微镜下仔细看蓝的就是死细胞，没着色的就是活细胞。
而且这个观察的时候，也得有耐心，要多个视野都看看统计，不能就看一眼就下结论。
这就像你数一堆东西一样得仔细都数到。
还有用流式细胞术检测淋巴细胞的各种亚群，这个仪器老高级了，但操作起来参数设置很关键，我一开始也是晕头转向的，老是测不准。
后来向做过的同事请教，又自己不断尝试不同的参数组合，才慢慢能得到准确的结果。
比如说那个门的设置，就像是给不同的人群划区域，要是划得不好，就把类型分错了。
小鼠脾细胞悬液制备之欧阳光明创编
小鼠脾细胞悬液制备
欧阳光明（2021.03.07）
一、小鼠眼球取血（眼静脉取血）
二、小鼠脾细胞悬液的制备：
1．小鼠颈椎脱臼处死，75%乙醇浸泡3分钟，取出小鼠置于无菌纸上，左腹侧朝上；
2．在小鼠左腹侧中部剪开小口，撕开皮肤，暴露腹壁，可见红色长条状脾脏；
3．在脾脏下侧提起腹膜，剪开后上翻，暴露脾脏，用镊子提起脾脏，眼科剪分离脾脏下面的结缔组织，取出脾脏。
放入盛有5ml Hanks液的培养皿中；
4．A：梳刮法：脾脏可用镊子轻轻梳刮，避免将脾脏弄成碎片，将细胞悬液吸入离心管中，自然沉降5分钟，将悬液移至另一离心管中，弃去较大
的组织块，离心沉淀细胞；
B：钢网研磨法：将脾脏放置不锈钢网（100或200目）上，用注射器针芯轻轻研压脾脏，获细胞悬液；
C：酶消化法：将脾脏用镊子夹碎，加入400
u/ml胶原酶（III型）5ml/只脾脏，37度消化20分钟，用尼龙网过滤，得到单细胞悬液。
5、脾脏研磨：轻轻研压（顺同一方向），用吸管吸取脾细胞悬液，放入试管中。
6、镜下细胞计数：40倍镜头，观察脾细胞。
7、试取胸腺
注：一般6-8周龄小鼠，根据品系不同，可得5-20×107细胞/只。
2．手术器械灭菌：术前高压灭菌外，也可将手术器械泡在95%酒精的小容器中，使用前取出器
械，在酒精灯上烧灼去除酒精，即可保证无菌，此法较为简便。
小鼠脾脏中分离淋巴细胞之欧阳语创编
从小鼠脾脏中分离淋巴细胞
１小鼠断颈处死，酒精浸泡５分钟，超净台内打开左侧腹部皮肤，小心分离皮下组织和腹部肌肉暴露出脾脏，提起，剪去周围结缔组织，放入有PBS的小瓶中。
无菌镊子夹碎，挤压脾脏，将获得的细胞悬液移入无菌试管中。
２另取无菌试管，先加入淋巴细胞分离液，然后将试管倾斜，略放平，吸取刚刚制备的细胞悬液缓慢的加入试管中，一般分离液和细胞悬液的体积比为１：２，要轻要慢，不要冲破了淋巴细胞分离液和细胞悬液的界面。
选用适合自己分离目的细胞的离心力和时间进行离心。
个人用1500转/分钟，20分钟。
３离心后取出试管，可以看到不同的分层，一般上面是非细胞成分和细胞碎片，接下来是单个核细胞，再往下是红细胞等。
吸走上层非细胞层弃之，吸出单个核层在另外无菌试管中，因为淋巴细胞分离液对细胞有毒性作用，加入PBS 离心洗两遍（PBS1000转/分钟，10分钟）。
４，洗好的细胞加入１６４０培养液和２０％的血清中重悬，缓慢加入已经制备好的尼龙毛柱子中，封好，放３７度孵育一小时。
一小时后取出，超净台内将柱子立起，针头下面放无菌试管（我们的柱子是用大号注射器做的），以HANKS液和血清先后缓慢冲洗，巨噬细胞贴在尼龙毛上不下来，B细胞也相
对吸附冲洗下来的不多，所以冲洗来的大多是T细胞，纯度可打到８０％到９０％，再次冲洗并且用力挤压，这样得到的就是B细胞。
得到的细胞可以以１６４０加血清配制的培养液进一步培养或做它用。
但是淋巴细胞分离液得到的细胞只能算是粗分，如果实验要求高最好选用磁珠或流式分离。
实验二：淋巴细胞分离实验
4.沿管壁周缘轻轻吸取淋巴细胞层移 入另一试管中
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实验步骤
5.加足量稀释液充分洗涤，1000 r/min 离心5min ，弃上清
6. 适量的培养基重悬细胞 ，计数
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注意事项
1.在Ficoll上加入稀释外周血时，应缓慢 加，以免冲散界面
2. 吸取单个核细胞层时，应避免吸出过 多的上清液或分层液而导致血小板污染
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实验步骤
5、计算：将结果代入下式，得出细胞密度 细胞数/毫升原液 =（4大格细胞数之和/4）×104
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注意事项
1.取样计数前，应充分混匀细胞悬液 2.加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带
气泡 3.细胞压中线时，数上不数下，数左不数右 4.本法要求细胞密度不低于104细胞/ml 5.镜下计数时，细胞数过少或过多，说明稀
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细胞计数
实验步骤 注意事项
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实验步骤
1、准备计数板： 2、制备细胞悬液：收集细胞，制成单个细胞
悬液 3、加样：用吸管轻轻吹打细胞悬液，取少许
细胞悬液，在计数板上盖玻片的一侧加微量细 胞悬液， 4、计数：在显微镜下，用10×物镜观察计数 板四角大方格中的细胞数
实验二
小鼠脾脏淋巴细胞的分离
小鼠脾脏淋巴细胞的分离
目的 原理 实验步骤 注意事项
精选2021版课件2 Nhomakorabea 目的熟悉淋巴细胞和外周血单个核细胞 （PBMC）的分离方法
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原理
脾脏各种血细胞的密度不尽相同， 利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作 密度梯度离心，使一定比重的细胞 群按相应密度梯度分布，从而将各 种血细胞加以分离。
小鼠脾脏内皮祖细胞的分离和培养
小鼠脾脏内皮祖细胞的分离和培养赵晓辉;黄岚;尹扬光;周健;方玉强;朱光旭;陈剑飞;刘兰;崔斌【期刊名称】《心脏杂志》【年(卷),期】2006(18)5【摘要】目的探讨小鼠脾脏内皮祖细胞(endothelial progen itor cell,EPC)的体外分离,定向分化和培养方法。
方法梯度密度离心法从小鼠脾脏中分离单个核细胞,用含血管内皮生长因子的M199培养液培养,每4 d更换培养基去除非贴壁细胞,观察经过不同时间培养后的细胞形态、结构和功能变化。
结果培养4 d可发现梭形贴壁细胞,7d后细胞成集落状,14 d左右可观察到条索状、网状血管样结构,原代细胞培养21 d左右接近融合并呈典型的鹅卵石样排列。
培养7 d透射电镜可见特征性的W e ib le-Palade小体存在,细胞CD31表达阳性,细胞D iI-LDL摄取试验阳性,FITC-UEA-I染色阳性;流式细胞仪检测细胞Sca-1及VEGFR-2的总阳性率分别为(34.6±3.8)%和(50.5±4.9)%,且该细胞具有体外成血管能力。
结论通过密度梯度离心联合贴壁筛选可以获得脾脏EPC。
【总页数】4页(P532-535)【关键词】内皮祖细胞;细胞培养;脾脏;小鼠【作者】赵晓辉;黄岚;尹扬光;周健;方玉强;朱光旭;陈剑飞;刘兰;崔斌【作者单位】第三军医大学新桥医院全军心血管内科中心【正文语种】中文【中图分类】R363【相关文献】1.大鼠脾脏内皮祖细胞的分离培养及鉴定 [J], 邓梦杨;陶剑群;朱晋坤;王航;赵晓辉;崔斌;尹扬光;黄岚2.小鼠骨髓源性内皮祖细胞的分离培养与鉴定 [J], 罗伟;李翔翮;杨先腾;李森磊;王远政;张一;田晓滨;孙立3.小鼠骨髓来源内皮祖细胞的分离、培养及鉴定 [J], 胡若愚;承燕;李好;张雷;景华;吴海卫4.小鼠髓源性内皮祖细胞体外培养的两种不同分离方法的比较 [J], 吴瑞影;许建华5.小鼠骨髓源性内皮祖细胞的分离培养与鉴定 [J], 李美玲;刘凤姣;刘玲因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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从小鼠脾脏中分离淋巴细胞
欧阳光明（2021.03.07）
１小鼠断颈处死，酒精浸泡５分钟，超净台内打开左侧腹部皮肤，小心分离皮下组织和腹部肌肉暴露出脾脏，提起，剪去周围结缔组织，放入有PBS的小瓶中。
无菌镊子夹碎，挤压脾脏，将获得的细胞悬液移入无菌试管中。
２另取无菌试管，先加入淋巴细胞分离液，然后将试管倾斜，略放平，吸取刚刚制备的细胞悬液缓慢的加入试管中，一般分离液和细胞悬液的体积比为１：２，要轻要慢，不要冲破了淋巴细胞分离液和细胞悬液的界面。
选用适合自己分离目的细胞的离心力和时间进行离心。
个人用1500转/分钟，20分钟。
３离心后取出试管，可以看到不同的分层，一般上面是非细胞成分和细胞碎片，接下来是单个核细胞，再往下是红细胞等。
吸走上层非细胞层弃之，吸出单个核层在另外无菌试管中，因为淋巴细胞分离液对细胞有毒性作用，加入PBS 离心洗两遍（PBS1000转/分钟，10分钟）。
４，洗好的细胞加入１６４０培养液和２０％的血清中重悬，缓慢加入已经制备好的尼龙毛柱子中，封好，放３７度孵育一小时。
一小时后取出，超净台内将柱子立起，针头下面放无菌试管（我们的柱子是用大号注射器做的），以HANKS液和血清先后缓慢冲洗，巨噬细胞贴在尼龙毛上不下来，B细胞也相对吸附冲洗下来的不多，所以冲洗来的大多是T细胞，纯度可打到８０％到９０％，再次冲洗并且用力挤压，这样得到的就是B细胞。
得到的细胞可以以１６４０加血清配制的培养液进一步培养或做它
用。
但是淋巴细胞分离液得到的细胞只能算是粗分，如果实验要求高最好选用磁珠或流式分离。