小鼠胚胎干细胞mES小鼠iPS培养Protocol
iPS细胞制备技术
iPS细胞制备技术随着对iPS细胞重编程机制研究的不断深入，iPS细胞的制备体系不断完善，目前iPS细胞的制备方法多种多样，但以Yamanaka的“四因子”诱导体系较为经典，本书在此简要阐述此制备方法。
一、小鼠iPS细胞制备【实验步骤】1.建立小鼠胎儿成纤维细胞系（1）脱颈处死13.5天孕鼠，分离出子宫并用PBS浸洗。
（2）用手术镊将胚胎从胎盘和周围膜系组织分离开，去除头、性腺和内脏组织。
（3）将胚胎转移至一个新100mm皿进行PBS清洗，剪刀剪碎组织，放于含有0.1%胰酶/0.1mmol/L EDTA溶液的50ml离心管，于37℃消化20分钟，重新加酶，再次消化。
（4）加入等体积FP溶液（含10%FBS，50U&50mg/ml青霉素和链霉素的DMEM）中止消化，吹打数次以帮助组织破碎。
（5）室温（20～25℃）放置5分钟以沉降大块组织，取上悬液体于离心管进行离心，1200r/min×5min，弃上悬液并用新鲜液体重悬。
（6）计数细胞，并调节细胞浓度至1×106/ml。
一般约1×107细胞/胚胎，1×107细胞/100mm皿于37℃，5%CO2培养24小时。
（7）次日，PBS清洗去除未贴壁细胞，待细胞铺满皿底，换掉FP液，用PBS清洗一次，1ml 0.05%胰酶/0.53mmol/L EDTA消化5分钟，加入9ml FP液并吹打成细胞悬液，传代按1∶4进行（用于iPS 诱导的MEFs代次最好选用3代以内）。
2.饲养层细胞准备（1）复苏 SNL 细胞1）由液氮罐中取出SNL冻存管，迅速放入37℃水浴锅中，并晃动冻存管直到融化。
2）乙醇擦拭冻存管盖及冻存管壁，将管内冻存悬液转移入预先准备的SNL液体中，800r/min×5min，弃去上液。
3）重新加入10ml SNL液体重悬细胞，转入明胶铺被的100mm皿中，于37℃，5%CO2培养至细胞80%～90%汇合。
小鼠胚胎干细胞培养
以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。
不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol和培养基。
一般培养－－维持ES细胞处于未分化状态ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。
为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。
建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。
将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。
如果在Feed细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。
下文中暂不提及Feed细胞。
Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。
培养基ES:配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基－－见下文）。
分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。
通过将21ml该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。
贮存于4℃，时间不要超过2周。
贮存液DMEM（高糖）马血清（HS）L-谷氨酰胺（200mM）MEM NEAA（10mM）HEPES（1M）β-巯基乙醇（55Mm）PESTLIF复苏细胞细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。
然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。
步骤：1．从液氮中取出一管细胞；2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；3．将细胞转移到一15ml Falcon管中；4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；5．离心3分钟；6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿；8．孵育。
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤小鼠胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells，ESCs）是一类在小鼠早期胚胎内分化产生的多能干细胞。
培养和研究ESC可以为了解细胞发育和分化提供重要的实验材料。
下面将为您介绍小鼠胚胎干细胞培养的一般步骤。
一、准备实验所需材料和器械：1.小鼠胚胎干细胞系（ES细胞系）。
2.ESC培养基：一般使用含有LIF（鼠胚性干细胞生长因子）的培养基，如DMEM/F12或DMEM培养基，添加血清、LIF等。
3.ESC传代培养基：与ESC培养基相同，但不含LIF。
4.ESC学习培养基：免LIF和血清的无血清培养基，可以用于学习ES细胞的分化能力。
5. ESC传递板（T25细胞培养板、10 cm细胞培养板等）。
6.培养皿：培养皿的选择可以根据不同的实验目的选用，如离体实验可以选择培养皿或培养碟等。
7.显微镜：用于观察和鉴定细胞形态。
8.细胞培养箱：用于多肽瓶、培养皿等细胞培养。
9.无菌注射器、移液器、离心管等常见实验器材，以及媒液和试剂。
二、实验步骤：1.将小鼠胚胎干细胞系解冻至细胞存储液解冻的方法，迅速转移到预先加热培养皿中。
添加完整的ESC培养基，将细胞孵育在37℃、5%CO2的培养箱中。
2.每两天更换一次ESC培养基，观察细胞的形态和生长情况。
当细胞接近80%的密度时，可以进行传代。
3.小鼠胚胎干细胞的传代通常采用机械法和酶解法两种方法。
机械法是直接使用离心管头吸吸细胞，然后用超声波吹散细胞，最后转入新的培养皿中。
酶解法则是先用胰酶等酶溶解细胞，形成单细胞悬液，然后接种入新的培养皿中。
4.传代完成后，继续在37℃、5%CO2的培养箱中培养细胞，并定期更换培养基。
5.ESC的分化实验通常采用去除LIF和血清的无血清培养基。
将小鼠胚胎干细胞移到含有学习培养基的培养皿中，观察和记录细胞的分化情况。
6.对于特定的实验要求，如体外器官培养、离体实验等，可以将小鼠胚胎干细胞移至特定的培养皿或装置中，进行相关实验。
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤 一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化 ...
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化状态培养基细胞复苏冻存细胞明胶包被细胞传代体外分化培养基包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板（使用或不使用盖玻片）体外分化方法注：以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。
不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol 和培养基。
一般培养--维持ES细胞处于未分化状态ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。
为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。
建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。
将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。
如果在Feed 细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。
下文中暂不提及Feed细胞。
Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。
培养基ES:配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。
分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。
通过将21ml 该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。
贮存于4℃，时间不要超过2周。
贮存液DMEM(高糖)马血清（HS）L-谷氨酰胺（200mM）MEM NEAA（10mM）HEPES（1M）β-巯基乙醇（55Mm）PESTLIF复苏细胞细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。
然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤
细胞的原代培养点击次数：540 作者：佚名发表于：2009-03-06 16:26转载请注明来自丁香园一、原代细胞培养原理原代细胞培养是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。
借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制以及细胞的衰老、死亡等生命现象。
• 幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养• 掌握无菌操作技术• 了解小鼠解剖操作技术• 了解原代细胞培养的一般方法与步骤•了解培养细胞的消化分散• 了解倒置显微镜的使用二、实验材料• 实验动物：孕鼠或新生小鼠• 液体：细胞生长液（内含20%小牛血清）0.25%胰蛋白酶平衡盐溶液70%乙醇•器材：灭菌镊子、剪刀若干把灭菌培养皿、细胞培养瓶、小瓶、烧杯若干个吸管若干支酒精灯原代细胞培养方法三、胰酶消化法（1）胰酶消化法操作步骤——取材a. 用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。
b. 把整个孕鼠浸入盛有75%乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。
c. 用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。
d. 用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。
e. 剔除胚胎周围的包膜（若胚胎较大，应剪去头、爪），将胚胎放于无菌的含有平衡盐溶液的培养皿中。
f. 漂洗胚胎，去掉平衡盐溶液。
继续用平衡盐溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。
（2）胰酶消化法操作步骤——切割a. 将部分胚胎转移至一个无菌小瓶中，用平衡盐溶液漂洗。
b. 然后用眼科手术剪刀小心地绞碎胚胎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。
c. 静置，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。
（3）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养a. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。
b. 加入3-5ml细胞生长液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤以下是小鼠胚胎干细胞的培养实验步骤：1.准备培养基和细胞培养器材：-将培养基预热至37摄氏度。
-准备含有培养基的无菌试管、离心管和细胞培养板。
-洗手并戴上合适的培养操作手套。
2.预处理培养皿：-用无菌PBS（磷酸盐缓冲液）将细胞培养板彻底洗涤，去除残留的培养基和细胞残留物。
-用0.1%胰蛋白酶溶液或0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液将细胞培养板上的细胞进行脱落。
-将细胞均匀地分布在预处理的培养皿中，使其形成单层细胞。
3.检查细胞数目和品质：-用显微镜检查细胞的形态和活力。
-用细胞计数计算细胞的数目。
-计算细胞的分裂倍增时间。
4.细胞传代：-按照需要的细胞密度将细胞从一个培养皿转移到另一个培养皿。
-用0.05%胰蛋白酶-EDTA将细胞从培养皿上脱落。
-投入适当比例的培养基到新的培养皿中，使其形成单层细胞。
5.制备小鼠胚胎纤维母细胞：-从小鼠胚胎体内收集纤维母细胞。
- 将纤维母细胞转移到含有DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）和10%胎牛血清的细胞培养皿中。
-培养纤维母细胞在37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中直至细胞接触起离皿表面。
6.制备和维持小鼠胚胎干细胞：-转接分裂期的小鼠胚胎干细胞到新的培养皿中。
-用无菌吸管或离心管的尖端轻轻挑取细胞克隆。
-将细胞克隆转移到含有mESC培养基（如DMEM、15%胎牛血清、2mML-谷氨酰胺和1×LIF（小鼠白细胞介素-6）的细胞培养板中。
-在体外细胞培养中维持小鼠胚胎干细胞的自我更新和增殖。
7.细胞培养的常规维护：-定期更换新鲜的培养基。
-检查细胞的形态和活力。
-定期传代细胞，以保持其细胞数目和活力。
-控制培养基和细胞的污染。
以上是小鼠胚胎干细胞培养的一般步骤，实验过程可能因研究目的和实验室的要求而有所不同。
为了保证实验的准确性和可重复性，建议在实验过程中随时记录和保留实验数据，并使用正确的实验操作和生物安全规范。
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤
细胞的原代培养点击次数：540 作者：佚名发表于：2009-03-06 16:26转载请注明来自丁香园一、原代细胞培养原理原代细胞培养是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。
借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制以及细胞的衰老、死亡等生命现象。
• 幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养• 掌握无菌操作技术• 了解小鼠解剖操作技术• 了解原代细胞培养的一般方法与步骤•了解培养细胞的消化分散• 了解倒置显微镜的使用二、实验材料• 实验动物：孕鼠或新生小鼠• 液体：细胞生长液（内含20%小牛血清）0.25%胰蛋白酶平衡盐溶液70%乙醇•器材：灭菌镊子、剪刀若干把灭菌培养皿、细胞培养瓶、小瓶、烧杯若干个吸管若干支酒精灯原代细胞培养方法三、胰酶消化法（1）胰酶消化法操作步骤——取材a. 用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。
b. 把整个孕鼠浸入盛有75%乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。
c. 用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。
d. 用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。
e. 剔除胚胎周围的包膜（若胚胎较大，应剪去头、爪），将胚胎放于无菌的含有平衡盐溶液的培养皿中。
f. 漂洗胚胎，去掉平衡盐溶液。
继续用平衡盐溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。
（2）胰酶消化法操作步骤——切割a. 将部分胚胎转移至一个无菌小瓶中，用平衡盐溶液漂洗。
b. 然后用眼科手术剪刀小心地绞碎胚胎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。
c. 静置，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。
（3）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养a. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。
b. 加入3-5ml细胞生长液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。
小鼠胚胎干细胞培养实验具体步骤及方法
小鼠胚胎干细胞培养实验具体步骤及方法胚胎干细胞在体内外可以分化为各种类型的细胞。
我们的体外分化方法有利于神经前体细胞通过在最少量的培养基内选择（第3步），在有bFGF存在的情况下扩增（第4步）并最终分化在第5步。
细胞全程培养在37℃，5％CO2，100％湿度条件下。
一般体外诱导向神经细胞方向分化，也可以采用低浓度的RA进行诱导。
具体步骤一、ES培养基在LIF存在的条件下维持细胞培养。
二、EB培养基使用细菌培养皿去除LIF后胚状体的形成需要4天。
1. 分散纯化细胞（参见上面的细胞传代部分）。
2. 纯化2小时后将细胞转入含有ES培养基的50 ml Falcon管中，计数细胞取适量体积放入15 ml管中离心3分钟。
3. 用2mlEB培养基重悬细胞，吹打至少10次制成单细胞悬液4. 一个15 cm的细菌培养皿接种4～5x106个细胞（1个完全融合的组织培养皿通常足以接种4个同样规格的细菌培养皿）。
5. 2天后更换培养基，将胚状体转入锥形管中放置3～5分钟使细胞沉降。
弃去上清，将细胞重悬于新鲜培养基并接种在新的细菌培养皿中。
6. 用EB培养基培养的第4天将细胞转入没有包被的组织培养皿中（这即是细胞的移植步骤）。
1个组织培养皿之中放置1个细菌培养皿，在进行第3步之前一天将胚状体黏附在同样规格的培养板上。
7. 形成胚状体需要4天时间。
在EB培养基中再培养1天使胚状体粘附在组织培养皿的表面。
这一天被认为是第2步和第3步的分界。
三、ITSFn培养基在最少量培养基中选择神经前体细胞1. 胚状体接种在组织培养皿一天后将培养基换成ITSFn培养基。
2. 并非所有胚状体在这一时期都已经发生粘附，因此在移除培养基时要小心谨慎以使大部分胚状体留在培养皿内。
3. 保持细胞在ITSFn中培养大约10天，根据需要更换培养基--大约每隔一天。
4. 观察细胞形态，神经样细胞大约出现在第4到第7天。
当神经样细胞能够被鉴别时，转入到第4步。
《小鼠新型胚胎干细胞在不同培养条件下的转换》范文
《小鼠新型胚胎干细胞在不同培养条件下的转换》篇一一、引言小鼠胚胎干细胞（mESCs）作为生物学研究的重要工具，具有巨大的潜力和应用前景。
近年来，随着科研技术的不断进步，新型的mESCs培养条件和方法不断涌现，为干细胞的研究和应用提供了新的可能。
本文将探讨小鼠新型胚胎干细胞在不同培养条件下的转换过程及其影响。
二、小鼠新型胚胎干细胞简介小鼠新型胚胎干细胞（mESCs）是一种具有自我更新能力和多潜能性的细胞，可以分化为各种组织和器官的细胞类型。
由于其独特的生物学特性，mESCs在再生医学、药物研发、疾病模型构建等领域具有广泛的应用价值。
三、不同培养条件下的转换过程1. 传统培养条件下的转换传统培养条件下，mESCs通常在含有特定生长因子和血清的培养基中生长。
这些生长因子和血清为细胞提供了必要的营养和生长信号，使细胞得以维持其多潜能性和自我更新能力。
然而，这种培养方法存在一些局限性，如对培养基成分的依赖性较高，难以实现大规模的细胞培养等。
2. 新型培养条件下的转换随着科研技术的进步，新型的培养条件和方法不断涌现。
这些方法主要包括无血清培养、无动物成分培养、三维培养等。
在这些新型培养条件下，mESCs的转换过程发生了显著的变化。
无血清培养可以降低对血清成分的依赖性，提高细胞的纯度和稳定性；无动物成分培养可以避免动物源性污染和疾病传播的风险；三维培养则可以提高细胞的生长速度和分化效率。
四、不同培养条件对mESCs的影响1. 生长速度和分化效率不同培养条件对mESCs的生长速度和分化效率有着显著的影响。
在新型培养条件下，mESCs的生长速度通常较快，分化效率也较高。
这主要得益于新型培养条件下的营养供应和生长信号更加均衡和稳定，有利于细胞的生长和分化。
2. 细胞纯度和稳定性新型培养条件还可以提高mESCs的纯度和稳定性。
例如，无血清培养可以降低血清中的杂质和污染物的含量，从而减少对细胞的干扰；无动物成分培养则可以避免动物源性污染和疾病传播的风险，提高细胞的纯度和安全性。
胚胎干细胞和iPS细胞的分化分子机制
胚胎干细胞和iPS细胞的分化分子机制生物科技领域中，胚胎干细胞和iPS细胞是两个备受瞩目的研究方向。
这两者都具有广泛的分化潜能，但胚胎干细胞存在伦理争议，而iPS细胞相对较为安全。
分子机制的研究对于胚胎干细胞和iPS细胞的应用与开发有着重要的作用。
一、胚胎干细胞分化分子机制胚胎干细胞可以分化为多种类型的细胞，因此它们的分化分子机制十分重要。
研究发现，胚胎干细胞分化主要受到多种因素的调控，包括基因表达、细胞因子、激素和糖基化等。
其中，基因表达调控是主要的分子机制之一。
胚胎干细胞的基因调控网络十分复杂，包括多个信号转导通路和转录因子。
Wnt、BMP、Nodal等通路以及Nanog、Oct4、Sox2等转录因子都可以调控胚胎干细胞的分化和自我更新。
研究表明，这些因子之间相互作用，形成了一个动态平衡状态，才能维持胚胎干细胞的稳定性和多向分化潜能。
在特定的时期或环境下，这些因子的调控方式会发生改变，从而导致胚胎干细胞向某个特定细胞系的分化。
胚胎干细胞还对外界的生长因子与核受体激素作出反应，如FGF、Activin、LIF和Retinoic Acid等。
这些生长因子可以通过信号通路间接或直接调节胚胎干细胞的分化。
在内部，胚胎干细胞通过众多的库欣（Kuxin）蛋白质及其下游基因家族调控。
库欣是一个典型的重塑蛋白质，在细胞分化、形态学发育和肿瘤发展等过程中发挥着重要作用。
总之，胚胎干细胞的分化分子机制极其复杂，涉及多个通路和因子的相互作用及其动态平衡，其研究将对未来的干细胞治疗和再生医学有着至关重要的意义。
二、iPS细胞分化分子机制与胚胎干细胞相比，iPS细胞的来源更加安全。
iPS细胞通过基因重编程，使人体成熟细胞回到干细胞状态。
虽然iPS细胞的分化分子机制与胚胎干细胞有着相似之处，但也存在一定的差异。
目前，对于iPS细胞分化的控制主要是通过在培养液中添加不同的生长因子、生物纳米材料和小分子化合物等物质来实现的。
胚胎干细胞培养操作规程
胚胎干细胞培养操作规程胚胎干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞，具有无限的增殖能力和多能性分化潜能，对于组织再生和疾病治疗具有重要的应用价值。
为了进行胚胎干细胞的培养和扩增，下面给出一份胚胎干细胞培养操作规程。
1. 实验前准备：a. 清洗培养器具：用无菌水洗净培养皿、玻璃器皿和刷子。
b. 预热培养液：根据实验需要预热胚胎干细胞培养基和所需的其他培养液，以确保适宜的温度。
2. 细胞除菌：a. 必要时，用无菌棉签将细胞悬液接种到新的培养皿中。
b. 将枪头含有70％乙醇的吸管对准培养皿，喷洒乙醇并晾干。
c. 将培养皿放置在超净工作台内，进行进一步的消毒和清洁操作。
3. 细胞接种：a. 取出细胞悬液，并与培养基按照比例混合。
b. 将胚胎干细胞悬液均匀地接种到预先涂覆有明胶或者植物凝胶的培养皿上。
c. 确保培养皿中的细胞接种均匀且不过于密集，以便细胞能够自由生长。
4. 细胞培养：a. 将被接种的培养皿置于培养箱中，在37℃和5% CO2的条件下培养。
b. 每天检查和观察细胞的状态和生长情况，观察细胞的形态和数量。
c. 根据需要，定期更换新鲜的培养基。
5. 细胞分离：a. 当细胞达到足够密度时，可使用胰蛋白酶等酶来进行细胞的分离。
b. 向培养皿中加入足够的酶液，并将其均匀地涂抹在细胞上。
c. 在温度适宜的条件下，观察细胞的分离情况，并在适当的时间停止酶的作用。
6. 细胞传代：a. 轻轻将细胞悬液转移到新的培养皿中，避免细胞团的形成。
b. 加入新的培养基，使细胞能够继续生长和分化。
c. 定期观察和记录细胞的生长情况，监测细胞的纯度和分化状态。
7. 储存和保存：a. 使用液氮分装装置将细胞悬液分装到液氮管中。
b. 储存液氮管在液氮罐中，确保细胞的存活和完整性。
c. 定期检查和更新细胞的库存记录，确保细胞的有效使用和管理。
通过以上的操作规程，可以进行有效的胚胎干细胞的培养和扩增工作，为进一步的研究和应用奠定基础。
小鼠胚胎干细胞mES小鼠iPS培养Protocol
4.将冻存管内细胞悬液转移至含2 ml MEF完全培养液的15 ml离心管内，以1000 rpm，离心5 min，离心后将上清液吸除，另加入新鲜的MEF完全培养液1 ml，重悬后按照一个T25培养瓶铺1106的MEF细胞，平均加入到T25培养瓶中，轻轻摇匀后置于37℃细胞培养箱。24 h以后可以传入小鼠胚胎干细胞或小鼠iPS细胞。
冻存液配方：
小鼠胚胎干细胞完全培养液或小鼠iPS完全培养液60，ES级FBS30，DMSO 10
附：小鼠胚胎干细胞与MEF细胞分离的简易方法（差速贴壁法）：
1.培养中的小鼠胚胎干细胞，按传代的操作方法将细胞用胰酶消化并吹打成单细胞悬液后，加入适量的提前温育好的小鼠胚胎干细胞完全培养液重悬细胞，吹打混匀，细胞悬液分装到无MEF细胞的培养皿或培养瓶（一般地，一个T25培养瓶中培养的小鼠胚胎干细胞，在一个10cm培养皿中进行差速贴壁。不要事先铺明胶，如铺明胶则细胞贴壁速度过快无法有效分离小鼠胚胎干细胞与MEF细胞）中。
5.复苏或传代小鼠胚胎干细胞或小鼠iPS细胞前，将T25培养瓶中的MEF完全培养液吸除，加入2 ml小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液轻轻冲洗一遍后吸除，加入新鲜的小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液待用。
复苏：
1.将小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞冻存管从液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超净台内用75酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。
6.每天更换小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液。
thomson protocols iPS ES
Thomson Lab’s ProtocolsHuman Embryonic Stem Cell Protocols人ES细胞培养操作规程一、培养基与试剂终浓度 250ml原液的需用量80% DMEM-F12 200ml20% KO血清替代物 50ml1%非必需氨基酸 2.5ml 1mM L-谷氨酰胺（见配方） 2.5ml0.1mM 2-巯基乙醇部分L-谷氨酰胺的量4ng/ml bFGF（见配方） 0.5ml1%PS 2.5mlL-谷氨酰胺原液：现用现加0.146g L-谷氨酰胺；10ml 无钙/镁PBS；7μl 2-巯基乙醇bFGF原液：分装储存在-20℃或-70℃里10ug 每管的bFGF；5ml 含0.1%Ⅴ级BSA的PBS；往无菌小管里分装0.5ml，分装10管0.1%Ⅴ级BSA0.1gⅤ级BSA；100ml含钙镁(或不含钙镁)的PBS(另外加入终浓度为1mM的CaCl2和0.5mM的MgCl2)；灭菌滤器Ⅳ型胶原酶传代培养基：有效期2-3周在DMEM-F12培养基里的终浓度为1mg/ml（如50ml DMEM-F12培养基里加入0.05g Ⅳ型胶原酶）细胞冷冻介质冷冻液：终浓度 10ml原液的需用量60% DMEM-F12 6ml20%处理过的胎牛血清FBS 2ml 20%二甲亚砜（不要过滤除菌） 2ml 重悬培养基：终浓度 10ml原液的需用量80% DMEM-F12 8ml20%处理过的胎牛血清FBS 2ml二、hES细胞的解冻1、登记细胞冻融表格，将人ES细胞从液氮罐中拿出。
2、将冻存管置于37℃（建议用42℃，因为冻存管才从液氮中取出，会直接影响水浴的温度，因此不能保证水浴一直维持在37℃）水浴中轻微摇动解冻直至还剩下一小块冰，千万小心不要将冻存管完全没入水中。
3、将冻存管完全浸入95%乙醇里。
4、非常小心地将细胞从冻存管中吸取到15ml离心管中。
5、缓慢滴入9.5ml培养基（或PBS——不起泡沫）以减少渗透压。
利用小鼠胚胎干细胞进行活体动物模型构建的操作步骤和技巧
利用小鼠胚胎干细胞进行活体动物模型构建的操作步骤和技巧在生物学研究中，利用小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells，简称mESCs）进行活体动物模型的构建是一项重要的技术手段。
通过这种方法，科研人员可以研究不同疾病的发生机制、治疗方法以及新药的筛选等。
接下来，我们将介绍利用mESCs进行活体动物模型构建的操作步骤和技巧。
首先，需要获取小鼠胚胎干细胞。
通常，科研人员会选择小鼠的早期胚胎作为胚胎干细胞的来源。
在实验室条件下，将小鼠受精卵取出放入培养皿中，培养合适的时长，使其发育到内细胞团阶段。
随后，将内细胞团取出，并经过适当的处理，分离出胚胎干细胞。
接下来，将获得的胚胎干细胞进行扩增。
通过在适当的培养条件下给予合适的培养基和生长因子，可以促进胚胎干细胞的增殖。
这个阶段需要控制好培养基的组分和培养条件，以确保胚胎干细胞的健康生长。
一旦胚胎干细胞经过扩增达到足够数量，就可以开始进行活体动物模型的构建了。
首先，需要选择合适的小鼠品系作为宿主动物。
常用的小鼠品系有裸鼠和免疫缺陷小鼠等。
这些小鼠具有较弱的免疫力，能够更好地接受外源细胞的移植。
将胚胎干细胞进行基因编辑后，将其注射或移植到选择的宿主小鼠体内。
注射的部位可以根据具体实验需要来确定，常见的有皮下注射和体腔注射等。
如果是构建特定器官的模型，可以将胚胎干细胞移植到对应的器官内。
注射或移植完成后，需要对小鼠进行适当的后续处理。
这包括观察小鼠的行为、收集样本进行分析和实验等。
需要注意的是，由于注射或移植过程对小鼠可能产生一定的创伤，因此需要进行必要的护理和监测，确保宿主小鼠的健康状况。
除了基本的操作步骤外，在利用mESCs进行活体动物模型构建的过程中，还有一些技巧和注意事项。
例如，在选择胚胎干细胞时，可以根据实验的需要选择具有特定基因突变的胚胎干细胞，以模拟特定疾病的发生机制。
此外，需要控制合适的细胞数量和注射或移植的时间点，以确保实验的准确性和稳定性。
干细胞常用实验技术protocol
实验室内部的人胚胎干细胞protocol人类胚胎干细胞 H1和H9维持方案一、试剂配制 饲养层细胞培养基Fibroblast-DMEM Media (F-DMEM) DMEM (GIBCO 11960-044) 450mlFCS GIBCO 16000-04450ml10%Pen/Strep 2.5ml50IU/mlL-glutGIBCO 25030-0815ml2uM/ml人类胚胎干细胞培养基HESC-MediaKO-DMED GIBCO 10829-018480mlKOSR GIBCO 10828-028120ml20%10mM NEAA GIBCO 11140-050 6ml0.1mM L-glut(0.2M) GIBCO 25030-0816ml2mMPen/Strep 3ml55mM BME GIBCO 21985-0231.1ml0.1mMITSGIBCO 41400-0456ml4-80C 避光保存。
用前每 50毫升加200-400ng bFGF细胞冻存培养基FBS-DMSO FCS GIBCO 16000-0449ml 90% DMSO SIGMA D26501ml10%细胞消化液Trypsi n-EDTAMito C 的终浓度为10ug/ml 即40吸ul 工作液加到 2ml F-DMEM 中。
0.1% Gelatin( 用于培养皿的包被)1% Gelatin40ml0.25% Trysi n-1mM EDTA 0.05%,0.2mM PBS(-)14190-144 MEF 细胞有丝分裂终止液 Mito C Mitomycin C0.2mg dd-H2O 15230-162避光保存。
GIBCO 25200-056 8ml0.05mg/ml4ml2ml0.1%二、培养方案 一）饲养层细胞的培养1、 主要实验材料（1 ）培养液为F-DMEM 。
（2 ）小鼠 周龄为7〜8w 的性成熟母小鼠和周龄为 8w 的种公鼠。
《小鼠新型胚胎干细胞在不同培养条件下的转换》范文
《小鼠新型胚胎干细胞在不同培养条件下的转换》篇一一、引言近年来，小鼠新型胚胎干细胞（mESCs）的研究在生物学和医学领域引起了广泛关注。
这些细胞具有自我更新能力和多潜能性，为研究细胞发育、疾病模型以及再生医学提供了重要的工具。
然而，mESCs的增殖和分化受培养条件的影响显著。
本文旨在探讨小鼠新型胚胎干细胞在不同培养条件下的转换，以了解其生长特性和潜在应用。
二、材料与方法1. 实验材料实验所需的小鼠新型胚胎干细胞、培养基、生长因子及其他试剂均购自正规生物公司，并符合实验要求。
2. 实验方法（1）细胞培养：mESCs分别在常规培养条件（对照组）、低氧环境、不同浓度生长因子等条件下进行培养。
（2）细胞生长特性观察：记录各组细胞的生长速度、形态变化及克隆形成情况。
（3）细胞分化鉴定：通过免疫荧光、RT-PCR等方法检测各组细胞的分化情况。
（4）数据统计与分析：采用SPSS软件进行数据分析，比较各组间的差异。
三、实验结果1. 细胞生长特性在低氧环境下，mESCs的增殖速度较对照组有所减慢，但细胞形态更加稳定，克隆形成率提高。
在添加不同浓度生长因子的条件下，mESCs的增殖速度和克隆形成率均有所提高，其中高浓度生长因子组效果最为显著。
2. 细胞分化鉴定低氧环境有利于mESCs向特定方向分化，如神经元和心肌细胞等。
不同浓度生长因子对mESCs的分化方向和比例也有影响，高浓度生长因子组更易诱导mESCs向特定类型细胞分化。
通过免疫荧光和RT-PCR检测，发现各组细胞的分化标志物表达情况与预期相符。
3. 数据分析与比较通过SPSS软件对实验数据进行统计分析，发现不同培养条件对mESCs的增殖、形态、克隆形成及分化方向均有显著影响。
各组间差异具有统计学意义（P<0.05）。
四、讨论本实验结果表明，小鼠新型胚胎干细胞在不同培养条件下的转换受到显著影响。
低氧环境有利于mESCs的稳定性和特定方向分化，而不同浓度的生长因子则能促进mESCs的增殖和分化。
《XistTaleR-dTFs来源的小鼠iPS细胞系的建立及多能性鉴定》范文
《Xist Tale R-dTFs来源的小鼠iPS细胞系的建立及多能性鉴定》篇一一、引言近年来，诱导多能性干细胞（iPS细胞）的研究已成为生物学和医学领域的重要课题。
iPS细胞技术为再生医学、疾病模型构建以及药物研发等领域提供了新的可能性。
本文旨在详细介绍以Xist Tale R-dTFs为来源的小鼠iPS细胞系的建立过程及其多能性鉴定。
二、材料与方法1. 实验材料（1）Xist Tale R-dTFs细胞系；（2）小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）；（3）相关培养基、试剂及耗材。
2. 方法（1）小鼠iPS细胞系的建立：通过将Xist Tale R-dTFs与小鼠胚胎成纤维细胞共培养，利用重编程因子诱导其成为iPS细胞。
（2）多能性鉴定：通过细胞形态学观察、基因表达分析、胚胎发育能力及分化潜能等手段，对iPS细胞的多能性进行鉴定。
三、小鼠iPS细胞系的建立1. 细胞培养与重编程因子诱导将Xist Tale R-dTFs细胞与小鼠胚胎成纤维细胞共培养，并加入重编程因子，如Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc等。
在适宜的培养条件下，诱导Xist Tale R-dTFs细胞成为iPS细胞。
2. iPS细胞的筛选与扩增经过一定时间的培养后，筛选出形态学上符合iPS细胞特征的细胞克隆，并进行扩增。
通过多次传代，获得稳定的小鼠iPS 细胞系。
四、多能性鉴定1. 细胞形态学观察观察iPS细胞的形态学特征，如细胞大小、核质比例、核型等，以初步判断其多能性。
2. 基因表达分析通过RT-PCR、qPCR等分子生物学技术，检测iPS细胞中与多能性相关的基因表达情况，如Oct3/4、Sox2、Nanog等。
3. 胚胎发育能力鉴定将iPS细胞注射到早期胚胎中，观察其是否具有形成胚胎的能力，以及在胚胎中是否能够正常发育并形成各种组织。
4. 分化潜能鉴定通过将iPS细胞诱导分化为不同类型的细胞（如神经元、心肌细胞、肝细胞等），检测其分化效率和分化后细胞的表型及功能，以评估其多能性。
《小鼠新型二倍体孤雌胚胎干细胞系的建立》范文
《小鼠新型二倍体孤雌胚胎干细胞系的建立》篇一一、引言小鼠胚胎干细胞（Mouse Embryonic Stem Cells, mESCs）的研究对于生物医学领域具有深远的意义。
近年来，关于小鼠二倍体孤雌胚胎干细胞系的建立与发展受到了广大研究者的关注。
本论文主要阐述如何通过科学的实验设计与操作，成功建立小鼠新型二倍体孤雌胚胎干细胞系，并对其生物学特性进行详细分析。
二、材料与方法1. 材料实验所需小鼠孤雌激活卵母细胞、胚胎培养基、培养箱、显微操作设备等。
2. 方法（1）孤雌激活卵母细胞的获取与培养；（2）孤雌胚胎干细胞的诱导分化与筛选；（3）二倍体孤雌胚胎干细胞的建立与鉴定；（4）生物学特性的分析。
三、实验过程1. 孤雌激活卵母细胞的获取与培养通过超排技术获取小鼠的孤雌激活卵母细胞，在胚胎培养基中培养至成熟。
2. 孤雌胚胎干细胞的诱导分化与筛选将成熟的卵母细胞进行体外受精或激活，诱导其分化为胚胎干细胞。
通过特定的筛选方法，筛选出具有干细胞特性的细胞。
3. 二倍体孤雌胚胎干细胞的建立与鉴定将筛选出的干细胞进行基因组检测，确保其具有二倍体染色体组。
通过形态学、生长特性、分化能力等多方面的鉴定，确认其为二倍体孤雌胚胎干细胞。
4. 生物学特性的分析对建立的二倍体孤帕胚胎干细胞进行生长曲线测定、多能性检测、基因表达分析等，以了解其生物学特性。
四、结果与讨论1. 结果成功建立了小鼠新型二倍体孤帕胚胎干细胞系，具有稳定的生长曲线和良好的多能性。
通过基因组检测和生物学特性分析，证实了其具有二倍体染色体组和良好的生物学特性。
2. 讨论（1）在孤帕激活卵母细胞的获取与培养过程中，需要优化培养条件和方法，以提高卵母细胞的成熟率和质量。
同时，通过改进体外受精和激活方法，可进一步提高胚胎干细胞的诱导效率和质量。
（2）在筛选和鉴定过程中，应采用多种方法和技术，如形态学观察、生长曲线测定、基因组检测、多能性检测等，以确保筛选出的细胞具有理想的二倍体孤帕胚胎干细胞特性。
《小鼠新型二倍体孤雌胚胎干细胞系的建立》范文
《小鼠新型二倍体孤雌胚胎干细胞系的建立》篇一一、引言近年来，小鼠胚胎干细胞（mESCs）在生物学和医学领域的应用越来越广泛。
而其中，二倍体孤雌胚胎干细胞系作为一种新型的细胞系，其独特的遗传特性和分化潜力使得其成为重要的研究工具。
本文旨在详细介绍如何建立小鼠新型二倍体孤雌胚胎干细胞系，以期为相关研究提供理论和实践参考。
二、材料与方法1. 实验材料（1）小鼠卵母细胞和受精卵（2）饲养层细胞（如STO细胞）（3）培养基、血清等培养材料（4）其他实验仪器和试剂2. 方法步骤（1）孤雌激活：采用化学或电刺激方法激活小鼠卵母细胞，使其进入孤雌发育状态。
（2）胚胎培养：将激活后的卵母细胞置于培养基中培养，使其发育成囊胚。
（3）干细胞诱导：从囊胚中分离出内细胞团，通过特定条件诱导形成胚胎干细胞。
（4）筛选和鉴定：通过遗传学和生物学特性对诱导出的干细胞进行筛选和鉴定，筛选出二倍体孤雌胚胎干细胞系。
三、实验过程与结果分析1. 孤雌激活与胚胎培养采用化学或电刺激方法成功激活小鼠卵母细胞，使其进入孤雌发育状态。
在适宜的培养条件下，卵母细胞发育成囊胚，囊胚结构完整，细胞数量和活力均达到实验要求。
2. 干细胞诱导与筛选从囊胚中分离出内细胞团，通过特定条件诱导形成胚胎干细胞。
在诱导过程中，观察到细胞形态变化，逐渐形成具有干性特征的细胞群。
通过遗传学和生物学特性对诱导出的干细胞进行筛选和鉴定，成功筛选出二倍体孤雌胚胎干细胞系。
3. 结果分析通过对筛选出的二倍体孤雌胚胎干细胞系进行遗传学和生物学特性分析，发现其具有稳定的遗传背景、较高的分化潜力和较低的异源性等特点。
与传统的mESCs相比，新型二倍体孤雌胚胎干细胞系在遗传学和生物学特性上具有一定的优势。
此外，通过实验数据比对和分析，我们还发现新型二倍体孤雌胚胎干细胞系的建立过程中具有一定的可重复性和可操作性。
四、讨论与展望小鼠新型二倍体孤雌胚胎干细胞系的建立为生物学和医学研究提供了新的工具。
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复苏：
1.将小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞冻存管从液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超净台内用75酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。
6.每天更换小鼠胚胎干细胞、小鼠iP23天传代，视克隆大小和密度而定。
2.吸除废液。
3.用PBS（不含钙镁离子）轻轻冲洗一遍。
4.加入1.0 ml的0.25胰酶（含EDTA）至培养瓶，轻轻晃动，使胰酶覆盖底面，置于37℃培养箱内消化细胞。
5.在显微镜下观察，直至细胞层全部脱落（一般需要12 min）。
2.培养皿或培养瓶置于37°C培养箱内静置1小时。
3.1小时后，绝大部分MEF细胞已贴在培养皿或培养瓶底面，而大部分小鼠胚胎干细胞仍然悬浮在培养液中。
4.收取培养液，进行后续实验。
中国科学院干细胞库/干细胞技术平台
6.加2 ml小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液终止消化。
7.多次轻轻吹打细胞，制成单细胞悬液。
8.加入足量的小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液，吹打混匀，细胞悬液分装到铺好MEF细胞的T25培养瓶中。一般地，一个T25培养瓶加入56 ml培养液。
9.放入37℃培养箱内培养。
10.每天换液。
传代比例：1417
冻存：
1.按传代的方法将细胞消化下来，制成细胞悬液。
2.以1000 rpm，离心5 min，弃上清，逐滴加入已经预冷的冻存液，悬浮细胞。
3.按每支存管内加入500l细胞悬液分装到冻存管内，标记细胞名称、代数、冻存日期等基本信息。
4.将冻存管置于程序降温盒内，-80℃过夜，转入液氮。
2.将冻存管内细胞悬液转移至含34 ml小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液的15 ml离心管内，以1000 rpm，离心5 min。
3.离心后将上清液吸除，另加入新鲜的小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液2ml，吹打悬浮。
4.重复吹打，制成单细胞悬液，尽量避免气泡。
5.转移至1个已经铺好MEF细胞的T25培养瓶中培养。
冻存液配方：
小鼠胚胎干细胞完全培养液或小鼠iPS完全培养液60，ES级FBS30，DMSO 10
附：小鼠胚胎干细胞与MEF细胞分离的简易方法（差速贴壁法）：
1.培养中的小鼠胚胎干细胞，按传代的操作方法将细胞用胰酶消化并吹打成单细胞悬液后，加入适量的提前温育好的小鼠胚胎干细胞完全培养液重悬细胞，吹打混匀，细胞悬液分装到无MEF细胞的培养皿或培养瓶（一般地，一个T25培养瓶中培养的小鼠胚胎干细胞，在一个10cm培养皿中进行差速贴壁。不要事先铺明胶，如铺明胶则细胞贴壁速度过快无法有效分离小鼠胚胎干细胞与MEF细胞）中。
3.按实验需要：小鼠胚胎干细胞使用KM-r P3 MEF或CF-1 P3 MEF；小鼠iPS使用ICR-r P3 MEF，复苏MEF细胞若干支。将冻存管从液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超净台内用75酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。
4.将冻存管内细胞悬液转移至含2 ml MEF完全培养液的15 ml离心管内，以1000 rpm，离心5 min，离心后将上清液吸除，另加入新鲜的MEF完全培养液1 ml，重悬后按照一个T25培养瓶铺1106的MEF细胞，平均加入到T25培养瓶中，轻轻摇匀后置于37℃细胞培养箱。24 h以后可以传入小鼠胚胎干细胞或小鼠iPS细胞。
小鼠胚胎干细胞（mES细胞）、小鼠iPS细胞培养Protocol
MEF细胞铺制：
1.在T25培养瓶中加入0.2明胶，摇匀后覆盖底面即可，于37℃细胞培养箱至少放置15 min以上。
2.吸除0.2明胶，加入事先水浴加热至37℃的MEF完全培养液。一般地，一个T25培养瓶中加入5 ml MEF完全培养液。