细胞色素C的制备及测定

细胞色素C的制备及测定
一．摘要
本实验以猪心为原料提取细胞色素C，通过三氯乙酸溶液沉淀、硫酸铵粉末抽提和透析等一系列步骤制备得细胞色素C溶液，并利用消光法对其进行鉴定。

由实验可得，重量为166.6g心肌可得到38.0ml的细胞色素C溶液，其中蛋白质含量为0.71724mg/ml，细胞色素C产量为9.9023mg，产率为59.44mg/公斤；从实验中还可得，氧化型样品的最大吸收峰应在410毫微米、530毫微米。

还原型样品的最大吸收峰应在410毫微米、520毫微米及550毫微米。

二．关键词：细胞色素C、猪心、制备、测定
正文
1.前言
细胞色素是包括多种能够传递电子或能够激活氧的含铁蛋白质的总称，是呼吸链中极重要的电子传递体，细胞色素 C 是其中的一种【1】。

自然界中，细胞色素C 的含量与组织的活动强度成正比。

以哺乳动物的心肌、鸟类的胸肌和昆虫的翼肌含量最多，肝、肾次之，皮肤和肺中最少。

细胞色素 C 是一种重要的细胞呼吸激活剂，常作为组织缺氧治疗的急救用药和辅助用药，如 C O 中毒、安眠药中毒、初生婴儿窒息、严重休克期缺氧、麻醉前处理以及肺部疾患引起的呼吸困难、高山缺氧、各种脑部疾病引起的脑缺氧、各种心脏疾患的缺氧。

也用于脑血管障碍、中风后遗症、乙型脑炎后遗症等的治疗。

另外细胞色素 C 还能促进受损肝细胞的再生、骨髓造血机能修复以及显著减轻由放疗引起的白细胞减少症。

通常外源性细胞色素 C 不能进入健康细胞，但在缺氧时，细胞膜的通透性增加，细胞色素 C 便有可能进入细胞及线粒体内，增强细胞氧化，提高氧的利用，最终在一定程度上恢复损伤的电子传递链【2-4】。

因文献中有关细胞色素C的研究鲜见，本实验采用猪心为原料对其进行研究。

2．实验部分
2.1实验原理
向心肌中加入三氯乙酸溶液，一起进行匀浆，大部分的蛋白质都沉淀下来，细胞色素C则存留在三氯乙酸溶液中。

将硫酸铵粉末加入到三氯乙酸抽提液中，硫酸铵与抽提液中的肌红蛋白、血红蛋白等一起沉淀下来，细胞色素C仍留于溶液中。

进一步用三氯乙酸溶液，细胞色素C就沉淀出来，然后透析并鉴定之。

鉴定及测定细胞色素C用消光法。

在550毫微米波长下，细胞色素C的克分子消光值为：氧化型细胞色素C：K1=0.9×10^4/克分子/厘米
还原型细胞色素C：K2=2.77×10^4/克分子/厘米
其含义为浓度为1克分子/升或1毫克分子/毫升的氧化型细胞色素C溶液，通过1厘米的光程，其消光值为0.9×10^4。

样品较纯时，从氧化型转变为还原型或者从还原型转变为氧化型，消光值的情况相同。

若样品不纯，含有其他色素，则测得的变化不可靠。

2.2试剂与器材
试剂：
1、猪心(购于翠苑农贸市场)；
2、10%氢氧化钠溶液（100克/升）；
3、硫酸铵粉末；
4、20%三氯乙酸溶液（200克/升）；
5、0.145mol/L三氯乙酸溶液；
6、饱和硫酸铵溶液；
7、10mmol/L铁氰化钾溶液；
8、饱和连二亚硫酸钠溶液；
9、0.1mol/LpH7.4磷酸钠缓冲溶液
器材：
1、大烧杯、搅拌棒；
2、JB―3型定时恒温磁力搅拌器；
3、细布；
4、大玻璃漏斗；
5、大布氏漏斗；
6、透析袋；
7、6.9~8.4 Q/GHSC 1571―2006 pH试纸（上海三爱思试剂有限公司）；
8、721分光光度计；
9、HR1707 飞利浦二合一搅拌机(珠海经济特区飞利浦家庭电器有限公司);
10、LXJ―ⅡB 飞鸽牌离心机;
11、SH2―D(Ⅲ) 循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）
2.3实验操作
⑴细胞色素C的制备
取猪心若干，剔除脂肪，称重，搅碎。

加入等量0.145mol/L的三氯乙酸溶液匀浆，搅拌提取10min。

将此混合提取物于室温下放置2～3小时，然后用两层纱布过滤。

用10%氢氧化钠溶液将上述混合液调到Ph7.3，测量并记录此抽提液的体积，再于搅拌下慢慢地加入硫酸铵粉末（加入量按500克/升混合液计算）。

用布氏漏斗抽滤，除去沉淀。

经常更换滤纸，要防止倒灌，收集粉红色滤液。

测量并记录此滤液的体积，搅拌下再加入硫酸铵粉末（加入量按50克/升滤液计算）。

此盐析液于冰箱中放置过夜。

上述盐析液经放置后出现少量沉淀，用布氏漏斗抽滤才（双层滤纸），除去沉淀，保留上清液，向上清液中加入20%三氯乙酸溶液（加入量按25毫升/升上清液计算），以沉淀细胞色素C。

迅速地于3500转/分条件下离心10分钟、收集细胞色素C沉淀，再将这个砖红色的沉淀悬浮于饱和硫酸铵溶液中（饱和硫酸铵溶液的体积按150毫升/公斤心肌组织计算，可根据实验操作情况减少30-50%）。

将此悬浮液移于透析袋中，对水透析4-5小时，离心（3500转/分，10分钟）除去少量暗黄色（已变性的细胞色素C）沉淀，红色的细胞色素C溶液则储于零下15℃。

记录此溶液体积。

⑵测定细胞色素C的产量、纯度及产率
以上制得的细胞色素C溶液是还原型分子与氧化型分子的混合物。

下一个步骤是用铁氰化物氧化一份样品，用连二亚硫酸盐还原另一份样品，将这两份样品
于550毫微米储的消光值记录下来。

根据已知的氧化型细胞色素C及还原型细胞色素C的克分子消光值及测得的样品消光值，可以计算出每个样品相当于多少克分子（E/K）。

氧化型样品的消光值E1：按下表加入试剂及样品，于550毫微米波长下测出氧化型样品的消光值。

还原型样品的消光值E2：按下表加入试剂及样品，于550毫微米波长下测出还原型样品的消光值。

⑶测定产品的分光光度吸收值
最后，测定细胞色素C溶液的光吸收峰。

将操作2中的氧化型及还原型溶液取来测定可见光不同波长下的吸收值，绘出吸收曲线（波长—光密度值）。

3．结果与分析：
由实验可得，⑴心肌质量为166.0g的猪心可得38.0ml细胞色素C溶液；
⑵A280的紫外吸收值为0.956；A260的紫外吸收值为0.904；
则蛋白质含量=1.45 A280- 0.74 A260=0.71724mg/ml
⑶若测定体积为3毫升，细胞色素C溶液体积为V,则细胞色素C氧化型及还原型的产量分别为：
A550氧化型样品消光值为0.091，则Y1（毫克）=E1/K1×Mwt×3×V毫升×稀释倍数=14.2931mg
A550还原型样品消光值为0.108，则Y2（毫克）=E2/K2×Mwt×3×V毫升×稀释倍数=5.5115mg（细胞色素C分子量Mwt为12400）
由以上结果可以算出：产量=（Y1+Y2)/2=9.9023mg
产率=产量/心肌重量=59.44mg/公斤
⑷
由图可得，氧化型的最大吸收峰应在408毫微米、530毫微米；还原型的最大吸收峰应在415毫微米、520毫微米及550毫微米。

4．小结：通过本实验学习细胞色素C的理化性质及其生物学功能，掌握制备细胞色素C的原理，并掌握制备细胞色素C的操作技术。

样品的最终浓度还可用另一方法核算，即一种常用的测定蛋白质的方法，如Folin酚法、双缩脲法或紫外吸收法测定细胞色素C溶液的总蛋白含量，可与消光法测出的数据进行核对比较，求出其纯度：
纯度%=消光法测出的产量（毫克）/蛋白含量测定的总蛋白量（毫克）
在实验中应注意：①尽可能除掉猪心中的韧带、脂肪和积血；②使用离心机之前，一定要配平；③透析之前要检查透析袋；④在520nm处测得各管的光密度时，要加少许联二亚硫酸钠作还原剂。

参考文献：
【1】刘学浩, 宋东倩. 对冷藏加工企业减少食品干耗的研究.冷藏技术[J],2003,(3):12-17.
【2】杨萍, 徐正本, 陈蕴光等. 陈列柜内冷藏食品干耗及其解决措施的研究. 制冷与空调[J].2004,(2):37-40.
【3】徐小玉, 邱张华, 曹红奋等. 冷藏集装箱内冷藏食品干耗问题的研究. 机电设备[ J ] . 2005，( 5 ) :12-17.
【4】Refrigerated containers and CA technology, Containers Handbook，Cargo loss prevention information from German marine insurers.。