支原体生物膜研究进展_叶晓敏

·综述·支原体生物膜研究进展

叶晓敏，陆春

(中山大学附属第三医院皮肤科，广东广州510630)

［摘要］近几年，支原体生物膜研究逐渐受到研究人员的关注。多种支原体都被证实具有生物膜形成

能力，生物膜形成后支原体耐药性增加，研究生物膜对于防治临床支原体感染有着重大意义。本文从

目前报道的几种支原体生物膜的形成及结构、生物膜形成的影响因素、生物膜形成对支原体药物敏感

性的影响及可能机制等几个方面综述了目前对支原体生物膜的研究进展。

［关键词］支原体;生物膜

［中图分类号］R759［文献标识码］A［文章编号］1674－8468(2011)01－0060－04

生物膜(Biofilm，BF)是微生物在生长过程中附着于物体表面而形成的由微生物的细胞及其分泌的聚合物等所组成的膜样多细胞复合体［1］。生物膜的存在可以增强病原微生物对宿主免疫攻击及抗菌药物的抵抗力。目前对大量支原体的研究已发现很多支原体都具有形成生物膜的能力。生物膜形成后增强了支原体对环境压力如热、干燥、缺氧、高渗透压等［2-3］及对抗菌药物的抵抗力［4］。本文从支原体生物膜的形成及结构、生物膜形成的影响因素、生物膜形成对支原体药物敏感性的影响及可能机制等几个方面对目前支原体生物膜的研究进展作一综述。

1支原体生物膜的鉴定及其形成和结构

生物膜是微生物细胞不断粘附、聚集，并包裹在自身生成的胞外基质中形成的多聚复合物，体积上15%由细胞组成，85%由胞外基质组成。目前生物膜的培养多以玻片、细胞爬片、滤膜为载体，可在液体中或固体培养基表面培养，依靠扫描电镜或共聚焦显微镜观察，通常认为观察到多层复合结构即为生物膜结构［5-6］。

生物膜的形成是一个动态过程，先后包括5个步骤［7］:可逆性粘附、不可逆性粘附、早期形成阶段、成熟及消散阶段。虽然很多研究认为支原体培养24小时生物膜即已形成，并以此期生物膜为对象研究其对抗菌素等的抵抗力。但Laura McAuliff等［2］在研究了牛支原体生物膜时有不同的发现。作者利用共聚交显微镜结合SYTO9/PI 荧光探针对牛支原体生物膜形成的动态过程进行观测，发现形成的24及48小时大部分细胞是活的，而通过共聚交显微镜的观察及三维重构发现牛支原体生物膜在最初的24小时仅有一层细胞粘附，48小时才发展成一个非匀质的框架结构，有近20um高，还有通道样结构，此时的生物膜才趋于成熟，同时研究发现培养24小时的牛支原体生物膜对达氟沙星，恩氟沙星，土霉素与游离状态的细胞同样敏感，证明牛支原体培养24小时尚未形成成熟生物膜。可见不同微生物生物膜成熟的时间是存在差异的，在对生物膜特性进行研究之前因先确定其成熟时间点。

支原体生物膜形态与其他微生物相似，可呈网络样、蜂窝状、柱状、蘑菇样、塔样，其间可见水通道，同一种微生物可形成不同结构的生物膜。如肺炎支原体的生物膜最初可形成蜂窝状的区域，在此基础上向外生长成蘑菇状或塔状，塔的直接从小的10um到大于50um，并在塔结构内可见到通道。随着生物膜生长时间的延长，蜂窝状结构中的空洞减少而塔的直径增加，生物膜的形成逐渐趋于成熟［8］。生物膜在不断成熟、丰厚的过程中对内层细胞保护作用不断增强，但由于其深部的细胞营养物质及氧份缺乏也会抑制其生长，正如Laura McAuliff的研究发现培养72小时的生物膜中近70%的细胞都死亡了，活的细胞主要位于生物膜中心。

2影响支原体生物膜形成的因素

生物膜的形成过程中粘附是第一步也是最关键的一步，某些胞外多糖及蛋白质物质是介导粘附的重要基质。如大肠杆菌的表多糖［9］，铜绿假单胞菌的藻酸盐［10］等都可促进生物膜的形成。有关支原体的研究也发现支原体的生物膜形成也与某些多糖及蛋白质物质有关。

2．1多糖与生物膜形成

野生型的肺炎支原体可形成一种胞外多糖，即表多糖(exopolysaccharide，EPS)-Ⅰ，它是由当量克分子的葡萄糖

和半乳糖组成的。James M．Daubenspeck等［11］在研究中发现肺炎支原体编码此表多糖合成通路的基因的插入突变株可形成另一种胞外多糖EPS-Ⅱ(含有N-乙酰氨基葡萄糖)，突变株较野生株形成生物膜的能力明显增强。这种胞外多糖可能具有更强的粘附能力。但并不是只要能生成表多糖就能形成生物膜。绵羊肺炎支原体可以生成半乳糖并形成半乳糖基础的荚膜却不能形成生物膜。是否荚膜样结构不利于生物膜的形成呢?确有脑膜炎奈瑟菌［12］及创伤弧菌［13］荚膜抑制生物膜形成的报道。但无乳支原体、牛支原及解脲脲原体也可形成多糖荚膜，却也可形成生物膜。可见不同结构的表多糖物质对生物膜的形成有不同的作用，进一步检测这些大分子在生物膜形成中的作用将有利于我们更深入地了解生物膜的形成机制［2，4］。

2．2蛋白质与生物膜形成

肺炎支原体的可变性表面抗原(variable surface anti-gens，Vsa)蛋白，调控了支原体的很多性质，包括对补体的易感性、对噬菌体的易感性、红细胞粘附能力及形成生物膜的能力［14］。Warren L．Simmons等［8］的研究发现产生长的Vsa蛋白的肺炎支原体不能粘附到聚苯乙烯及红细胞，不能形成生物膜，但可以形成浮游状态的拥有大量细胞外基质的微菌落，并可抵抗补体的作用。而产生短的Vsa蛋白的菌株游离状态时易被补体杀死，但能形成生物膜。Vsa蛋白介导生物膜形成的具体机制还不清，但这种现象提示我们微生物的一个进化规律:为了更好地在环境中存活它们会形成更有利于存活的形式如生物膜的形式。James M．Daubenspeck等［11］在研究中也检测了Vsa蛋白，发现EPS-I突变株即使在生成长的Vsa蛋白时也能形成生物膜，且生物膜形成能力与产生短的Vsa蛋白的野生株相当，提示胞外多糖是影响生物膜形成更重要的物质。

Laura McAuliffe等［3］对丝状支原体丝状亚种的研究发现生物膜形成后的定植细胞较游离细胞高表达一些蛋白分子如:延伸因子Tu、丙酮酸脱氢酶α链、PTS系统葡萄糖特异性IIBC分子、磷酸烯醇丙酮酸蛋白磷酸转移酶、果糖二磷酸盐醛缩酶II、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶及磷酸丙糖异构酶。丙酮酸脱氢酶及延伸因子Tu在肺炎支原体与胞外基质中的纤维连接蛋白的结合过程中发挥了重要的作用［15］，也被认为是肺炎支原体细胞骨架的重要成分，与细胞粘附有关［16］。PTS系统蛋白及Tu也与肺炎支原体的压力反应有关［17］。果糖二磷酸醛缩酶，磷酸丙糖异构酶与碳水化合物的分解代谢有关。有关变形链球菌生物膜形成相关蛋白质表达的研究，也发现类似与Laura McAu-liffe研究发现的这些糖酵解酶的表达在生物膜形成早期有所增加［18］。可见蛋白质物质对于生物膜形成也具有重要意义，除了在粘附阶段外可在多方面影响生物膜的形成。

对于很多细菌研究都发现的生物膜的形成与一些调控系统如群体感应系统(quorum-sensing systems，QS)有关。金葡菌Agr QS系统［19］可促进生物膜的消散，铜绿假单胞菌的LasR-RhlR QS系统［19］可促进生物膜的形成。然而目前对支原体的研究还未发现有相关的调控系统存在。Maria Garcia-Castillo等［4］对解脲脲原体检测了在细菌中常见的与生物膜形成有关的基因如esp、bap、mus20及sty2875，但都未找到。

3支原体生物膜形成与基因型的联系

支原体生物膜的形成在种内也存在差异，这与分子型或基因型不同有关。Laura McAuliffe等［2］用结晶紫染色法对牛支原体生物膜进行半定量检测发现生物膜形成能力强(A560values＞0.15)的菌株属于B亚型，而生物膜形成能力差(A560values＜0.100)的属于A亚型。

牛支原体的可变表面脂蛋白(variable surface lipopro-teins，Vsps)家族中有几型具很强的免疫源性，与致病有关，如VspA，VspB，VspE，and VspF［21］。Vsp还可促进牛支原体粘附到牛支气管上皮，这种粘附与致病有关［21-22］。那么Vsp是否也可促进生物膜的形成呢，目前还无涉及这方面的研究报道。但Vsp的不同类型会影响生物膜的形成能力。Laura McAuliffe等［2］的研究就发现大部分(70%)形成生物膜弱的菌株用Western blotting检测发现表达VspF，而形成生物膜强的表达VspB(86%)及VspO (63%)。

4生物膜形成对支原体耐药性的影响

生物膜形成后可以增强细胞对多种环境压力如热、干燥、缺氧、高渗透压等［2-3］及抗菌药物的抵抗力［4］，但生物膜的形态结构与抵抗力有关。如前所述肺炎支原体在形成早期为蜂窝状，后期塔结构增多，生物膜形成趋于成熟。Warren L．Simmons等［8］为了检测肺炎支原体生物膜是否具有保护作用，将肺炎支原体形成的生物膜及从生物膜消散的细胞与补体或短杆菌肽(肺炎支原体鼠宿主产生的一种抗菌肽)共孵育。结果发现生物膜确实可以抵抗补体及短杆菌肽杀伤作用保护支原体细胞，但这种保护作用主要位于生物膜的塔结构中，而处于生物膜蜂窝状结构中的细胞会被补体或短杆菌肽溶解。这与塔结构区域的细胞密度最高并有大量的多糖物质覆盖有关。有研究表明胞外多糖是能够保护细菌免受抗菌肽的溶解作用的［23-24］。由此我们可以推测胞外基质尤其是其中的多糖物质的屏障