发酵工程菌种保藏
发酵学第章生产菌种的培养与保藏[可修改版ppt]
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2、孢子的冷藏时间
关 如土霉素ห้องสมุดไป่ตู้产菌种孢子斜面培养4天左
冷藏时间宜短不宜长。
右冷藏，发现冷藏7~8天菌体开始自溶。 而培养5天后冷藏，20天未发现自溶。
冷藏时间对孢子的生产能力也有影响。 例如在链霉素生产中，斜面孢子在6˚ C
冷藏两个月后的发酵单位比冷藏一个月降
低18%，冷藏3个月后降低35%。
(四) 接种量
发酵学第章生产菌种的培养与保 藏
生产菌种的制备：
即种子制备，是发酵生产的第一道工序。即将保存 在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试 管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培 养,最终获得一定数量和质量的菌种的过程。
目的：
提供发酵产量高、生产性能稳定、数量充足、未被 杂菌污染的生产用菌种
(三) 种龄
种龄：种子罐中培养液从开始接种到移入下一级 种子罐或发酵罐的培养时间。
最适的种龄为生命力极为旺盛的对数生长期， 菌体量尚未达到最高峰时移种。
种龄过短—→前期生长缓慢、整个发酵周期延长。 种龄过长—→生产能力下降、菌丝过早自溶
(四) 接种量
接种量：是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例
接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中生长繁殖的速度。采 用较大的接种量可以缩短发酵罐中菌丝繁殖到达高峰的时间， 使产物的形成提前到来。
生产上多以加大种子量及采用丰富培养基作为获得高产的措施。 双种法：二只种子罐接一只发酵罐 倒种法：以适宜的发酵液倒出适量给另一发酵罐作种子
三、种子质量标准
细胞或菌体：以单细胞菌体为种子的质量要求菌体健壮、
种子罐种子制备：
一级种子、二级种子……N＋1级发酵 种子罐的级数主要决定于菌种的性质、菌体生长速度、 发酵设备的合理应用。
发酵工程考试必备简答题
五.简答题1.菌种保藏的原理与方法？答：菌种保藏的方法很多，其基本原理都是根据微生物的生理生化特性，人为的创造条件，是微生物处于代谢不活跃(泼)，生长繁殖受到抑制的休眠状态，以减少菌种的变异。
一般可以通过降低培养基营养成分、低温、干燥和缺氧等方法，达到防止突变、保持纯种的目的。
常用菌种保藏方法有①斜面冰箱保藏法；②沙土管保藏法；③石蜡油封保藏法；④真空干燥冷冻保藏法；⑤液氮超低温保藏法⑥低温冷冻保藏。
2.培养基成分选择要考虑的问题？答：（1）菌体的同化能力（2）代谢的阻遏和诱导，（3）合适的碳氮比，（4）pH的要求。
3.培养基营养成分包括那几类？答：培养基的成分包括：能源物质、 碳源物质、氮源物质、无机盐、微量元素、特殊生长因子、前体、促进剂和抑制剂、水分。
4.发酵培养基由哪些成份组成？答：（1）碳源 构成菌体和产物的碳架及能量来源（2）氮源 构成微生物细胞物质或代谢产物中氮素来源的营养物质（3）无机盐和微量元素（4）生长因子：微生物生长不可缺少而细胞自身不能合成的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。
（5）水、产物形成的诱导物、前体和促进剂5.简述培养基的类型有哪些？答：培养基的类型有很多，按照组成成分，有合成培养基和天然培养基，按照培养基的状态，可以分为固体，液体和半固体培养基，也可以按照用途分为孢子培养基，种子培养基和发酵培养基。
6.什么是一类发酵？二类发酵？三类发酵？（分类依据发酵类型可分哪几类？）答：根据产物形成与底物利用的关系，即碳源利用与产物形成速度的关系，将微生物发酵过程分成以下三个类型：第Ⅰ型（又称为与生长相关型）、第Ⅱ型（又称为与生长部分相关型）、第Ⅲ型（又称为与生长不相关型）。
一类发酵：产物形成与底物利用直接相关，为生长联系型，又称简单发酵型，产物直接由碳源代谢而来,产物生成速度的变化与微生物对碳源利用速度的变化是平行的，产物生成与微生物的生长也是平行的。
微生物工程4--菌种保藏原理和方法
微生物工程4--菌种保藏原理和方法微生物工程4--菌种保藏原理和方法一、菌种保藏的意义---菌种是从事微生物学以及生命科学研究的基本材料，特别是利用微生物进行有关生产如抗生素、氨基酸、酿造等工业，更离不开菌种。
所以菌种保藏是进行微生物学研究和微生物育种工作的重要组成部分。
其任务首先是使菌种不致死亡，同时还要尽可能设法把菌种的优良特性保持下来而不致向坏的方面转化。
二、菌种的衰退和复壮-----菌种经过长期人工培养或保藏，由于自发突变的作用而引起某些优良特性变弱或消失的现象称为菌种衰退。
1.菌种衰退的原因:菌种衰退的主要原因是有关基因的负突变。
所谓负突变是指生产菌株的生产性状下降的突变2.防止菌种衰退的方法有①控制传代次数②选择合适的培养条件③利用不同类型的细胞进行传代④选择合适的保藏方法1.斜面低温保藏法：将菌种接种在不同成分的斜面培养基上，待菌种充分生长后，便可放在4℃左右的冰箱中进行保藏。
细菌、酵母菌、放线菌和霉菌都可使用这种保藏方法。
保存期为3-6个月。
原理：低温下微生物代谢慢②砂土管保藏法：适合于产孢子或芽胞的微生物。
一般保存期为2年左右，有的可达十～几十年。
沙、土洗净，烘干，过筛，按1-2：1混匀，分装小试管中，高度1cm左右，121℃高压蒸汽灭菌2-3次，烘干，检验无菌备用。
ν试管中加入菌悬液或孢子，干燥，真空封口即可。
原理：干燥，寡营养③真空冷冻干燥保藏法：加有保护剂的菌悬液在冻结状态下予以真空干燥。
适用于各种微生物，便于大量保藏，菌种存活时间长，是目前最好的保藏方法。
原理：干燥，低温。
④液氮保藏法：将菌种置于保护剂中，预冻后保存在液氮超低温冰箱中（-196℃）。
适用于各种微生物的较理想的保藏方法。
对一些不产孢子的菌丝体用其它保藏方法不理想，可用液氮保藏法。
其保存期最长。
原理：低温⑤悬液保藏法（寡营养保藏）：将微生物悬浮在不含养分的溶液中，如水、缓冲液、生理盐水，室温保藏，一般为一年。
发酵菌种：菌种建库流程及管理安全性问题
发酵菌种：菌种建库流程及管理安全性问题1. 菌种建库流程1.1菌种筛选菌种筛选是微生物菌种建库的第一步，其目的是从自然环境、生物体或实验室保存的菌种中，筛选出具有特定生理生化特征或能够合成特定代谢产物的菌株。
这一过程包括样品采集、菌种分离、初筛和复筛等环节。
1. 样品采集：从目标环境（如土壤、水、空气）或目标生物体（如植物、动物）中采集样品。
2. 菌种分离：将采集的样品经过适当的处理（如稀释、培养、纯化），分离得到单一菌株。
3. 初筛：通过生理生化实验，对分离得到的菌株进行初步筛选，以选择具有特定特征的菌株。
4. 复筛：对初筛中具有特定特征的菌株进行进一步的筛选，以确定最佳菌株。
1.2菌种鉴定在筛选出具有特定特征的菌株后，需要对菌种进行鉴定，以确定其分类学地位和生物学特性。
菌种鉴定主要包括形态学鉴定、生理生化鉴定和分子生物学鉴定等方法。
1. 形态学鉴定：观察菌株的形态、大小、结构、染色等特征，以确定其分类学地位。
2. 生理生化鉴定：对菌株进行一系列生理生化实验，如对碳源、氮源的利用，pH、温度等生长条件的适应性，以及代谢产物等的分析，以了解其生物学特性。
3. 分子生物学鉴定：通过基因序列测定、多态性分析等方法，对菌株进行分子水平的鉴定，以更准确地区分不同微生物物种。
1.3基因组测序基因组测序是微生物菌种建库的重要环节，其目的是获得菌株的全部基因组序列，从而为后续的基因组分析提供基础数据。
基因组测序一般采用第二代测序技术（如Illumina HiSeq、MiSeq等）或第三代测序技术（如PacBio RS II等）。
1. 基因组提取：从菌株中提取高质量的基因组DNA。
2. 测序建库：将基因组DNA构建成适合测序的文库。
3. 测序：将文库上机进行高通量测序。
4. 质控：对测序得到的原始数据进行质量控制，去除低质量序列和噪声。
5. 拼接：将高质量的序列拼接成完整的基因组序列。
1.4数据库构建数据库是微生物菌种建库的核心部分，其目的是将菌株的基因组数据存储起来，以便后续的数据分析和挖掘。
菌种保藏方法_菌种应该怎么保存
菌种保藏方法_菌种应该怎么保存引导语：菌种应该怎么保存呢?以下是小编收集整理的关于菌种保藏方法相关内容，欢迎阅读参考!菌种保藏方法1、传代保存法：有些微生物当遇到冷冻或干燥等处理时，会很快死亡，因此在这种情况下，只能求助于传代培养保存法。
传代培养就是要定期地进行菌种转接、培养后再保存，它是最基本的微生物保存法，例如*奶等常用生产菌种的保存。
传代保存时，培养基的浓度不宜过高，营养成分不宜过于丰富，尤其是碳水化合物的浓度应在可能的范围内尽量降低。
培养温度通常以稍低于最适生长温度为好。
若为产*菌种，则应在培养基中添加少量碳*钙。
一般地，大多数菌种的保藏温度以5℃为好，像厌氧菌、霍乱弧菌及部分病原真菌等微生物菌种则可以使用37℃进行保存，而蕈类等大型食用菌的菌种则可以室温直接保存。
传代培养保存法虽然简便，但其缺点也很明显，如：①菌种管棉塞经常容易发霉;②菌株的遗传*状容易发生变异;③反复传代时，菌株的病原*、形成生理活*物质的能力以及形成孢子的能力等均有降低;④需要定期转种，工作量大;⑤杂菌的污染机会较多。
2、液体石蜡覆盖保存法：该法较前一种方法保存菌种的时间更长，适用于霉菌、酵母菌、放线菌及需氧细菌等的保存。
此法可防止干燥，并通过限制氧的供给而达到削弱微生物代谢作用的目的。
其具有方法简便的优点，同时也适用于不宜冷冻干燥的微生物(如产孢能力低的丝状菌)的保存，而某些细菌如固氮菌、乳*杆菌、明串珠菌、分枝杆菌、红螺菌及沙门氏菌等和一些真菌如卷霉菌、小克银汉霉、毛霉、根霉等不宜采用此法进行保存。
3、载体保存法：即将微生物吸附在适当载体上进行干燥保存的方法。
常用的有方法包括以下几种，如：①土壤保存法：主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌种的保藏。
方法是在灭菌的土壤中加入菌液，立即在室温下进行干燥或使菌体繁殖后再干燥，然后冷藏或在室温下密封保存。
保存用的土壤原则上以肥沃的耕土为宜，土壤需风干、粉碎、过筛和灭菌。
使微生物在土壤中繁殖后进行干燥保存的方法是：取适量土壤(5克)，置于塞有棉塞的试管中，加水或加入充分稀释的液体培养基(以含水量为土壤最大持水量的60%为宜)，然后高压灭菌。
实验室菌种保藏的方法
实验室菌种保藏的方法菌种是主要的生物资源，也是食用菌生产首要的生产资料。
一个优良的菌种被选育出来以后，必须保持其优良性状不变或尽可能地少变慢变，才不至于降低生产性能，能长期在生产中使用。
因此，菌种保藏在食用菌生产上具有重要的意义。
各种微生物由于遗传特性不同，因此适合采用的保藏方法也不一样。
一种良好的有效保藏方法，首先应能保持原菌种的优良性状长期不变，同时还须考虑方法的通用性、操作的简便性和设备的普及性。
下面介绍几种常用的菌种保藏方法：1斜面低温保藏法将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长完全后，置于4。
C左右的冰箱中保藏，每隔一定时间（保藏期）再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏，如此连续不断。
此法广泛适用于细菌、放线菌、酵母菌和霉菌等大多数微生物菌种的短期保藏及不宜用冷冻干燥保藏的菌种。
放线菌、霉菌和有芽匏的细菌一般可保存6个月左右，无芽抱的细菌可保存1个月左右，酵母菌可保存3个月左右。
如以橡皮塞代替棉塞，再用石蜡封口，置于4。
C冰箱中保藏，不仅能防止水分挥发、能隔氧，而且能防止棉塞受潮而污染。
这一改进可使菌种的保藏期延长。
此法由于采用低温保藏，大大减缓了微生物的代谢繁殖速度，降低突变频率；同时也减少了培养基的水分蒸发，使其不至于干裂。
该法的优点是简便易行，容易推广，存活率高，故科研和生产上对经常使用的菌种大多采用这种保藏方法。
其缺点是菌株仍有一定程度的代谢活动能力，保藏期短，传代次数多，菌种较容易发生变异和被污染。
2石蜡油封藏法此法是在无菌条件下，将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物）上，石蜡油层高出斜面顶端IC明使培养物与空气隔绝，加胶塞并用固体石蜡封口后，垂直放在室温或4。
C冰箱内保藏。
使用的液体石蜡要求优质无毒，化学纯规格，其灭菌条件是：150〜170。
C烘箱内灭菌Ih;或121。
C高压蒸汽灭菌60〜80min,再置于80℃的烘箱内烘干除去水分。
发酵工程原理与技术_江南大学-陈坚-7第七章生产菌种的扩大培养与保藏
– 种子级数太少，接种量小，发酵时间延长， 降低发酵罐的生产率，增加染菌机会
– 虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而 定。但也与所选用工艺条件有关。如改变种 子罐的培养条件，加速了孢子发芽及菌体的 繁殖，也可相应地减少种子罐的级数。
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第二节 种子质量的控制
素含量要高
• 营养成分要尽可能与发酵培养基相近。
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2，培养条件 （1）温度 （2）通气量
在种子罐中培养的种子除保证供给易被利用的 培养基外，有足够的通气量可以提高种子质 量。例如，青霉素的生产菌种在制备过程中 将通气充足和不足两种情况下得到的种子分 别接入发酵罐内，它们的发酵单位可相差1倍 。但也有例外，例如土霉素生产菌，一级种 子罐的通气量小对发酵有利。
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(3)二级种子的质量要求 种龄 7~8h pH 7.2左右 OD值 净增0.5左右 无菌检查 (-) 噬菌体检查(-)
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二、啤酒酵母的扩大培养
• 菌种在固体培养基上可呈现多种不同代 谢类型的菌落，氮源品种越多，出现的 菌落类型也越多，不利于生产的稳定。
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• 措施
– 培养基所用原料要经过发酵试验合格才可使 用
– 严格控制灭菌后培养基的质量 – 斜面培养基使用前，需在适当温度下放置一
定时间 – 供生产用的孢子培养基要用比较单一的氮源
，作为选种或分离用的培养基则采用较复杂 的有机氮源
• 通常接种量，细菌1~5%，酵母 菌5~10%，霉菌7~15%，有时
20~25%
30
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三、种子质量的控制措施
• 种子质量的最终指标是考察其在发酵罐 中所表现出来的生产能力。因此首先必 须保证生产菌种的稳定性，其次是提供 种子培养的适宜环境保证无杂菌侵入， 以获得优良种子。
发酵工程实验实验指导书
发酵工程实验指导书（2014版）宁波大学海洋学院2014.09发酵工程实验指导书目录实验一乳酸菌的分离与初步筛选实验实验二乳酸菌的初步鉴定实验实验三乳酸菌菌种保藏实验实验四乳酸菌的培养与发酵实验实验五乳酸菌发酵产物的分析与测定实验六发酵罐操作训练发酵工程实验指导书（2014版）３实验一 乳酸菌的分离与初步筛选实验一、 实验目的及要求1、 掌握从环境样品中分离所需微生物的一般操作2、 掌握平板划线分离菌种的原理和操作方法3、 掌握利用透明圈法获得单菌落菌株的原理。
二、 实验原理自然样品中存在混杂的微生物，通过选择性培养基及样品稀释使形成细胞分散液，再通过固体培养基在合适的培养条件下培养形成单菌落，由此得到分离的纯培养菌株。
乳酸菌最基本的代谢特性是发酵产酸，待分离样品在合适的培养基和培养条件下，乳酸菌在特定设计的培养基中由于生长产酸产生溶钙形象，从而在培养基中产生透明圈，透明圈直径大小可反映菌落生长产酸量的大小，而不是乳酸菌或不产生酸积累的细菌不能产生透明圈。
三、 实验器材1、 待用分离样品（腌菜，各种泡菜，酸奶，植物汁液，等）；2、 培养基：MRS 培养基或改良乳酸菌分离培养基；无菌水；3、 器皿与设备：培养皿、移液管、试管、三角瓶、接种环、涂布棒、超净工作台、天平、采样瓶，培养箱，等。
四、 方法和步骤 1、 分离样品的采集 采样须知：结合乳酸菌菌种特性（文献资料查阅），获取乳酸菌在自然界或相关产品等的分布规律，设计样品采集范围。
采集样品经适当保存或立即处理。
2、 菌种的分离称取样品5g 或5ml →加到45ml 无菌水的三角瓶中（30℃恒温处理20分为佳）→充分震荡后（含玻璃珠）使其自然沉淀→用1ml 移液管吸取上清菌悬液1ml 至9ml 无菌水试管中→依次进行10倍稀释至10-4~10-5→用移液管吸取1mL 菌悬液至含碳酸钙的MRS 培养基平板中，涂布均匀→30℃恒温培养2~3天→观察菌落，分别挑取生长良好的含透明圈的可疑乳酸菌单菌落，分别移接至普通乳酸菌培养基的斜面试管，菌种编号，30℃恒温培养1~2天，长菌后在4℃冰箱保存待用。
工业微生物菌种保藏技术和发酵过程
通过冷冻，使微生物代谢活动停止。一般而言， 冷冻温度愈低，效果愈好。为了获得满意的冷冻 结果，通常应在培养物中加入一定的冷冻保护剂 冷冻保藏时温度要求在-20℃以下，同时应认真掌 握好冷冻速度和解冻速变。 冷冻深藏的缺点之一是培养物运输较困难。
冷冻保藏种类
一、普通冷冻保藏技术(-20℃) 二、超低温冷冻保藏技术(-60一-80℃) 三、液氮冷冻保藏技术
NICPB
卫生部药品生物制品监察所
IV 中国医学科学院病毒研究所 CVCC 兽医微生物菌种保藏管理中心
CIVBP 中国兽医药品监察所
YM 云南省微生物研究所
中国微生物菌种保藏管理委员会组织机构
中 国 微 生 物 菌 种 保 藏 管 理 委 员 会 办 事 处 (CCCCM): 中 国 科 学 院 微 生 物 研 究 所 内 ,北 京 (AS),100080
应注意的是经过一次解冻的菌株培养物不宜再用 来保藏。
保藏过程中应注意控制保藏温度，培养瓶或试管 应严格密封。
这一方法虽简便易行，但不适宜多数微生物的长 期保藏。
二、超低温冷冻保藏技术(-60一-80℃)
要求长期保藏的微生物菌种，一般都要求在-60℃以下 进行保藏。 在超低温冷藏柜中保藏菌种的一般方法是：
普通冷冻保藏技术(-20℃)
将液体培养物或从琼脂斜面培养物收获的细胞分接到 试管或指管肉，然后贮藏于一冰箱的冷藏室中，或于 温度范围在-5～-20℃的普通冰箱(-20℃)中。或者， 将菌种培养在小的试管或培养瓶斜面上，待生长适度 后，将试管或瓶口用橡胶塞严格封好，同上置于冰箱 中保存。
发酵工程第2章2 菌种的选育与保藏
2.3传代保藏
将菌种定期在新鲜琼脂培养基上传代，然后在一定的 生长温度下生长和保存的传代保藏方法。
可用于实验室中若干菌种的保藏。 此法最为简单和经济，且不要求任何特殊的设备。 但此方法易发生培养基干枯、菌体自溶、基因突变。
2.3 传代培养法
实验原理：保藏的菌种通过斜面、穿刺或疱肉培养基（用于 厌氧细菌）培养好后，置4C˚冰箱中存放，定期 进行传代培养、再存放。 可用胶塞代替棉塞或在斜面上覆盖一层无菌液体 石蜡来进一步延长保存期。
冷冻干燥过程中必须使用冷冻保护剂，目前国内常 用脱脂乳和蔗糖，国外尚有运用动物血清等。
大部分微生物菌种可以在冻干状态下保藏10年之久 而不丧失活力。而且经冻干后的菌株无需进行冷冻 保藏，便于运输。
培养物的冻干过程
冷冻真空干燥操作流程
配制保护剂 灭菌
菌种 培养 制备菌悬液
分装安培瓶 预冻
真空干燥 测定水分
操作方法 1、斜面保藏法 将菌种转接在适宜固体斜面培养基上，待其充分生长后，
用牛皮纸将棉塞部分包扎好（棉塞换成胶塞效果更好），置 4C˚冰箱中包藏。
保藏时间依微生物的种类而定。霉菌、放线菌及芽孢菌保 存2－4个月移种一次，酵母菌间隔两个月，普通细菌一个月， 假单胞菌两周传代一次。
此法优点是操作简单、使用方便，缺点是保藏时间短、易 被污染。
加速保藏试验可用于预测保藏过程中保藏培养物的 稳定性。
在一给定温度下通过对高温下短期活力丧失程度检 测，可以用来预测嗜酸乳杆菌的稳定性。
成功的菌种长期保藏方法之有价值的指标包括：在 保藏6个月、1年或更长时间后存活百分率(或存活单 位)、细胞群体的形态学特征或一些特别的生化特征 应在菌种保藏前后保持同一性，以及实验室中、中 试车间中和生产发酵中产品滴度的稳定性，后者极 为重要。
食品营养与检测《菌种的保藏 菌种保藏的措施》
菌种的保藏
菌种保藏的措施
斜面传代保藏方法
是将菌种定期在新鲜琼脂斜面培养逐上、液体培养基中或穿刺培养，然后在低温条件下保存。
它可用于实验室中各类微生物的保藏，此法简单易行，且不要求任何特殊的设备。
但此方法易发生培养基于枯、菌体自溶、基因突变、菌种退化、菌株污染等不良现象。
因此，要求最好在基本培养基上传代，目的是能淘汰突变株，同时转接菌量应保持较低水平。
斜面培养物应在密闭容器中于5℃保藏，以防止培养基脱水并降低代谢活性。
此方法一般不适宜作工业生产菌种的长期保藏，一般保存时间为3～6个月。
例如，放线菌于4～6℃保存，每3个月移接1次；酵母菌于4～6℃保存，每4～6个月移接1次；霉菌于4～6℃保存，每6个月移接1次。
菌种保藏+菌种储藏管理监督制度
菌种保藏（culture preservation）首先挑选典型优良纯种，其次创造一个有利于休眠的环境条件，还要考虑方法的通用性与简便性。
1、低温保藏：冰箱、超低温。
2、干燥保藏：土壤、细砂、硅胶等。
3、隔绝空气保藏：石蜡油封。
4、冻干保藏：综合低温、干燥、真空。
5、活体保藏：病原微生物、病毒。
实验室常用方法：1、斜面冰箱保藏法：斜面保藏是一种短期、过渡的保藏方法，用新鲜斜面接种后，置最适条件下培养到菌体或孢子生长丰满后，放在4℃冰箱保存。
一般保存期为三个月到六个月菌丝速冻法：对于不产孢子或芽孢的微生物，一般不能用沙土管保藏。
为了方便可以采用甘油菌丝速冻法。
由于该法的保藏温度为-20℃，为了避免微生物受损伤致死，需要甘油作为保护剂。
甘油的最终浓度为25%。
2 、沙土管保藏法：适合于产孢子或芽孢的微生物。
将斜面孢子制成孢子悬浮液接入沙土管中或将斜面孢子刮下直接与沙土混合，置干燥器中用真空泵抽干，放在冰箱内保存。
一般保存期为1 年左右。
3、石蜡油封存法：向培养成熟的菌种斜面上，倒入一层灭过菌的石蜡油，用量要高出斜面一厘米，然后保存在冰箱中。
此法可适用于不能利用石蜡油作碳源的细菌、霉菌、酵母等微生物的保存。
保存期约一年左右。
4、真空冷冻干燥保藏法：目前常用的较理想的一种方法。
在真空中使水分升华。
微生物的生长和代谢都暂时停止，不易发生变异。
菌种保存时间一般５年左右。
需要一定的设备。
保护剂一般采用脱脂牛奶或血清等。
保护剂的作用可能是在冷冻干燥的脱水过程中代替结合水而稳定细胞成分(细胞膜)的构型，防止细胞膜因为冻结而破坏。
保护剂还可以起支持作用，使微生物疏松地固定在上面。
5、液氮超低温保藏法：适用范围最广的微生物保藏法。
尤其是一些不产孢子的菌丝体，用其它保藏方法不理想，可用液氮保藏法，其保存期最长。
原理：用液氮能长期保存菌种。
这是因为液氮的温度可达-196℃，远远低于其新陈代谢作用停止的温度(－130℃)，所以此时菌种的代谢活动已停止，化学作用亦随之消失。
食品发酵工程-2(微生物菌种的选育及保藏)
02
微生物菌种保藏
低温保藏法
总结词
通过降低温度来抑制微生物的生长和代谢，从而延长菌种保 藏时间。
详细描述
将微生物菌种保存在低温环境下，通常为-18℃至-70℃，可以 显著减缓菌种的生长和代谢速度，从而延长菌种保藏时间。低 温保藏法适用于大多数微生物菌种的长期保存。
干燥保藏法
总结词
通过去除水分来降低微生物的生存能 力，从而延长菌种保藏时间。
详细描述
将微生物菌种干燥至一定含水量，通常 为5%-10%，以降低菌种的生存能力。 干燥保藏法适用于耐干燥的微生物菌种， 如霉菌和酵母菌等。
冷冻真空干燥干燥保藏法
总结词
结合低温、干燥和真空条件来更有效地延长菌种保藏时间。
详细描述
在冷冻真空干燥机中，将微生物菌种在低温、真空条件下进行干燥处理，去除 水分，从而延长菌种保藏时间。冷冻真空干燥保藏法适用于对湿度敏感的微生 物菌种，如病毒和细菌等。
03
微生物菌种鉴定
形态学鉴定
总结词
通过观察微生物的形态、大小、颜色、生长速度等特征，初步判断微生物的种类。
详细描述
形态学鉴定是微生物鉴定的基础方法，通过显微观察，可以了解微生物的形态、大小、排列、运动性等特征，从 而判断其大致的分类。
生理生化鉴定
总结词
通过测定微生物对不同碳源、氮源、能源的利用以及产生的代谢产物，进一步确定微生物的种类。
详细描述
根据产物的性质选择合适的分离纯化方法，如离心、 过滤、萃取、沉淀等。通过实验确定最佳的工艺参数 和操作条件，以提高产物的纯度和收率。同时，可以 探索联合使用多种分离方法，以达到更好的分离效果 。
THANKS
感谢观看
的时间和较大的培养规模。
菌种保藏的要点
菌种保藏的要点
菌种保藏的要点包括以下几点：
1. 菌种的分离与培养：选择合适的方法将所需菌种从样品中分离出来，并进行适当的培养，确保纯净度和菌株的健康状态。
2. 菌种的保存介质：选择适合菌种保存的介质，常见的包括琼脂、液体培养基、冰冻保存液等。
保存介质要符合菌株生长的需求，并具备较长的保存时间。
3. 冷冻保存：将菌种培养物经过适当处理后保存在低温环境中，常见的冷冻方式包括冷冻干燥、液氮冷冻等。
冷冻保存可以有效地延长菌株的保存时间。
4. 恒温保存：将菌种培养物保存在稳定恒温环境中，如恒温培养箱或恒温冰箱。
保存温度要根据菌株的生长特性进行调整，通常为4-8摄氏度。
5. 定期传代：定期传代菌株，避免菌株在长期保存过程中发生遗传变异或失活。
6. 保存记录：建立并及时更新菌株的详细保存记录，包括菌株的来源、保存时间、保存方式、特性描述等信息，以便于菌株的溯源和使用。
7. 双重保存：对于重要的菌种，可以考虑进行双重保存，即同时进行冷冻保存和恒温保存，以增加保存的安全性。
8. 定期检测：定期检测保存的菌株，包括菌株的纯度、生长状况和遗传特性等，确保保存的菌株依然具有所需的特性和活力。
以上是常见的菌种保藏要点，可以根据具体的实验需求和菌种特点进行调整和优化。
同时，注意进行合理的菌种管理和使用，以减少菌株的失活和遗传变异，保证科研的可靠性和稳定性。
发酵工程菌种的衰退复壮和保藏
国外菌种保藏机构
3）英国的国立标准菌种收藏所（NCTC） 英联邦真菌研究所（CMI）
4）冷泉港研究室（CSH） 美国
5）日本东京大学应用微生物研究所（IAM） 6）日本大阪发酵研究所（IFO）
……
菌种保藏的原理
微生物菌种保藏，原理基本一致，即采用低温、 干燥、缺氧、缺乏营养、添加保护剂或酸度中 和剂等方法，挑选优良纯种，最好是它们的休 眠体，使微生物生长在代谢不活泼，生长受抑 制的环境中。
举例： 产链霉素放线菌菌种分离（从退化菌 种中筛选）
取工业发酵液（含孢子）样品1环 放入带玻璃珠的装有10ml 无菌水的小三角瓶中，摇匀
采用稀释法制平板，获取单菌落
根据高产菌的特点，选择目的菌落
斜面保藏 高产菌恢复 放大培养，发酵液性能测试
三、 菌种保藏的原理和方法
菌种保藏的意义 菌种是从事微生物学以及生命科学研究的基本材 料，特别是利用微生物进行有关生产如抗生素、 氨基酸、酿造等工业，更离不开菌种。所以菌种 保藏是进行微生物学研究和微生物育种工作的重 要组成部分。其任务首先是使菌种不致死亡，同 时还要尽可能设法把菌种的优良特性保持下来而 不致向坏的方面转化。
菌种衰退的原因
1）基因自发突变（根本原因）
粘质赛氏杆菌（Serratia marcescens)H2892 菌株生产力： 18g/L 组氨酸， 五次传代后菌株生产力：4g/L
菌种衰退的原因
2）变异菌株性状分离
随着菌种传代和核的分离也会使性状表现多样化， 产量也会随之变化，即使是单核孢子发生突变时， 如果双链DNA上仅一条链上某个位点发生变化， 经移殖后也会出现性状分离。因此一个较稳定的 变异株的获得必须经过多次分离纯化。
衰退是发生在微生物细胞群体中的一个由量 变到质变的逐步演变的过程。
发酵工程-第四章 菌种的复壮与保藏
培养： 将接种后的培养基放入培养箱中，在适宜的条件下培养 至细胞稳定期或得到成熟孢子。细菌培养温度一般为30～ 37℃，真菌培养温度一般为25～28℃。 保藏： 培养好的菌种于4～6℃保存，根据要求每3～6个月移植 一次。某些菌种，如芽裂酵母，阿舒假囊酵母，棉病囊霉 等，须1～3个月移植一次。 保藏湿度用相对湿度表示，通常为50%～70%。 斜面菌种应保藏相继三代培养物以便对照，防止因意外 和污染造成损失。
4）控制好碳源、氮源等培养基成分和pH、温度等培养条件，使之有利 于正常菌株生长，限制退化菌株的数量，防止衰退。
3、利用不易衰退的细胞移种传代
在放线菌和霉菌中，由于它们的菌丝细胞常含几个细胞核，甚至 是异核体，因此用菌丝接种就会出现不纯和衰退，而孢子一般是单核 的，用它接种时，就不会发生这种现象。 另外，有些霉菌（如构巢曲霉）若用其分生孢子传代就易衰退， 而改用子囊孢子移种则能避免衰退。
安徽医科大学微生物学教研室
第四章：菌种的衰退、复壮与保藏
陈
振
办公室：基础医学院711
E-mail：ottovb@
本章内容
＊一、菌种的衰退和复壮 ＊二、菌种的保藏
第一节
菌种的衰退和复壮
一、菌种的衰退
菌种衰退（degeneration）是指菌种经 过长期人工培养或保藏，由于自发突变的作 用而引起某些优良特性变弱或消失的现象。
2、宿主体内复壮法
对于寄生性微生物的衰退菌株，可通过接种到相应昆 虫或动植物宿主体内来提高菌株的毒性。 例如： 苏云金芽孢杆菌——感染菜青虫的幼虫，然后再从病死的 虫体内重新分离典型菌株。 根瘤菌属——回接到相应豆科宿主植物上,令其侵染结瘤, 再从根瘤中分离出根瘤菌,其结瘤固氮性能就可恢复甚至 提高。
最新酵母菌菌种保藏技术规程
酵母菌菌种保藏技术规程1范围本规程规定了酵母菌菌种保藏的技术和程序。
本规程适用于酵母菌菌种的保藏。
2术语和定义下列术语和定义适用于本规程2.1定期移植法subculturing亦称传代培养保藏法，指将菌种接种于适宜的斜面培养基上，最适条件下培养，待得到健壮的菌体后，于4～6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的一种短期菌种保藏方法。
2.2蒸馏水法preservation in distilled water指将欲保藏的菌种细胞悬浮于无菌蒸馏水中，密封后置于4～6℃保存的一种菌种保藏方法。
2.3液体石蜡法preservation in liquid paraffin亦称矿物油保藏法，定期移植保藏法的辅助方法。
指将菌种接种在适宜的斜面培养基上，最适条件下培养至待得到健壮的菌体后注入灭菌的液体石蜡，使其覆盖整个斜面，再直立放置于低温（4～6℃）干燥处进行保存的一种菌种保藏方法。
2.4－80℃冰箱冻结法preservation at －80℃指将菌种悬浮于保护剂中，在－80℃冰箱中冻结保存的一种长期菌种保藏方法。
2.5液氮超低温冻结法preservation in liquid nitrogen指悬浮于保护剂中的菌种经程控降温后，移置于－196℃的液氮或－150℃左右的液氮气相中保存的一种长期菌种保藏方法。
2.6真空冷冻干燥法freeze-drying指将欲保藏的菌种细胞或孢子悬浮于保护剂中，经预冻后在真空条件下使水分升华，再经真空封存后保存的一种长期菌种保存方法。
3保藏准备工作3.1菌种待保藏的酵母菌菌种必须进行分离纯化，得到纯培养后再进行保藏。
3.2工具、材料接种针或接种环、吸管、镊子、75%酒精棉球、酒精灯、试管架、量筒、烧杯、平皿、标签、波美计等。
3.3器皿3.3.1试管选用平口试管，规格一般为15×150mm。
3.3.2安瓿管制安瓿管的材料应为中性玻璃，质地软硬度要适当。
管的内径为8mm，长度不小于100mm。
菌种保藏的原理
半固体穿刺保藏法
方法：适宜半固体→培养→4℃保藏 原理：缺氧、低温 适用：好气性细菌，酵母等 保藏期：6-12个月 步骤： 用接种针从原菌种斜面上挑取少量菌体，从柱状培养 基中心自上而下刺入，至培养基的1/2处，待微生物生长良 好后覆盖2-3mm无菌液体石蜡.石蜡可防止培养基失水又隔 绝氧气,降低代谢.但不适用于可以石蜡为碳源的微生物.
步骤
1安瓿管的处理
菌备用。
直径8-10mm，长度不小于100mm，洗净高压灭
2 保护剂
低分子和高分子化合物，如氨基酸、糖类、蛋白质等。 常用的是脱脂奶和血清。
3 菌悬液制备
最适培养条件、生长后期。产孢子的微生物须适 当延长培养时间以获得成熟的孢子。
4 冷冻干燥
5 安瓿管的保藏
4-5℃保藏
再次，添加保护剂或酸碱中和剂，避免保藏过程中细胞受 伤。
三、菌种保藏的方法
斜面保藏法 穿刺保藏法 沙土管干燥保藏法 真空冷冻保藏法 液氮保藏法 低温保藏法
斜面低温保藏法
方法：接种适宜斜面培养基 →培养→4℃保藏 原理：低温下，微生物代谢强度明显下降 适用：各大类 保藏期：3-6个月 缺点：保存期短，传代多，易退化
7种常用菌种保藏方法的比较
方法 主要措施 适宜菌种 保藏期 评价
斜面低温保藏法
冰箱保藏法 （半固体） 液体石蜡封藏法 砂土干燥保藏法 甘油悬液保藏法
低温（4℃）
低温（4℃），避氧
各大类
细菌，酵母菌
约1～6月
约6～12月
简便
简便
果酒酵母发酵及菌种保藏
果酒酵母发酵及菌种保藏选取1-2种酿酒酵母进行小型酿酒实验，在品尝合格并符合规定的感官及理化指标后，选用常用菌种保藏方法对有价值的菌种进行保藏。
1.实验目的和内容1）掌握果酒酿造的原理并对筛选果酒酵母菌种进行发酵性能测定（起酵时间、产酒精度、耐受性能）。
2）用选育果酒酵母进行小型酿酒实验，掌握果酒酿造一般工艺流程。
3）了解并掌握菌种保藏的常用方法及其优缺点。
4）学习几种常用菌种保藏方法：斜面传代保藏方法、液体石蜡保藏方法、沙土管保藏方法、冷冻干燥保藏方法。
2.实验原理果酒发酵：果浆或果汁中的葡萄糖和果糖在酵母菌的作用下，最后生成酒精和二氧化碳。
可用以下反应式来说明：果酒发酵是一个极其复杂的生物化学现象。
在每一步反应过程中都有酶的参与，除了最后生成酒精、二氧化碳和少量的甘油、高级醇类、醛类物质之外，还会生成二磷酸己糖、磷酸甘油醛、丙酮酸、乙醛等许多中间产物。
果酒的发酵分主发酵和后发酵两个阶段，主发酵是将发酵液的糖分变成酒精，后发酵是继续分解残糖为酒精，加速酒的转化，使酒更加稳定。
用人工培养的酵母发酵的称为人工发酵，利用天然酵母发酵的称为自然发酵。
按照工艺的不同又可分为渣汁混合发酵和渣汁分离发酵两种形式。
微生物具有容易变异的特性，因此经过分离纯化选育的酿酒酵母要经历长期的保存必须要用实验方法对其保藏，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。
低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因素而设计的。
保藏方法大致可分为以下几种：1）传代培养保藏法又称斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用），培养后于4-6℃冰箱内保存。
2）液体石蜡覆盖保藏法是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。
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2、液体石蜡覆盖保藏法
由于培养物表面覆盖液体石蜡后可隔绝空气，因 此降低了微生物菌体的物质代谢，延缓细胞的衰 老，同时也防止培养基水分蒸发，是一种简易的 菌种保藏方法。
此法的优点是制作简单，不需特殊设备，且不需 经常移种。缺点是保存时必须直立放置，所占位 置较大，同时也不便携带。
3、沙土管保藏法
5、真空冷冻干燥保藏法
此法为菌种保藏方法中最有效的方法之一，对一般生活力 强的微生物及其孢子以及无芽胞菌都适用，即使对一些很难保 存的致病菌，如脑膜炎球菌与淋病球菌等亦能保存。适用于菌 种长期保存，一般可保存数年至十余年，但设备和操作都比较 复杂。
6、低温保藏法
低温保藏法又叫冷冻保藏，是普通的保藏技术。 此法为菌种保藏方法中最有效的方法之一，对一般生活 力强的微生物及其孢子以及无芽胞菌都适用，即使对一些很 难保存的致病菌，如脑膜炎球菌与淋病球菌等亦能保存。适 用于菌种长期保存，一般可保存数年至十余年，但设备和操 作都比较复杂。
பைடு நூலகம் ㈢
菌种保藏注意事项
1、注意选择适当的保藏方法； 2、采用良好的培养基新鲜培育出来的菌种进行保藏，要求菌 体健壮或孢子丰满，种龄要适宜，细菌要求在稳定期； 3、必须进行严格的无菌操作，注意维持菌种的活性； 4、保藏期间，严格防止杂菌污染，为菌种创造最适宜的保藏 条件，如控制保藏温度等； 5、严格控制传代的次数，采用斜面低温保藏时尤其注意这点； 6、保藏菌种恢复培养时，要转接到保藏以前所用的同一代培养 基上进行培养，以维持优良性能的稳定性。
菌种沙土管保藏法多用于能产生孢子的微生物如霉 菌、放线菌，因此在抗生素工业生产中应用最广， 效果亦好，可保存2年左右，有的微生物可保藏10 年。 保藏效果较好，且微生物转接方便，经济简便。
4、悬液保藏法
悬液保藏法的基本原理是寡营养保藏，是将微生物 混悬于不含养分的媒液中加以保藏的方法。 此法适用于大部分的放线菌，酵母菌，霉菌以及肠 道科细菌等，其关键在于试管口必须防水密封，一般可 保藏1年左右。
菌种的保藏
（1）菌种保藏的目的及原理 （2）菌种保藏的方法 （3）注意事项
㈠菌种保藏的目的及原理
菌种保藏是保证生产菌种质量的重要环节，其目的 在于不污染杂菌，使退化和死亡降低到最低限度，尽可 能使菌种保持原来的优良性状。 基本原理：根据菌种的生理、生化特性，人为的创 造条件，使微生物的代谢处于不活泼、生长繁殖受到抑 制的休眠状态，以减少菌种的变异。
保藏时一般利用菌种的休眠体（孢子、芽 孢等）并创造有利于休眠状态的环境条件， 如降低培养基营养成分、低温、干燥、缺氧 和添加保护剂等，使菌种的代谢活性处于最低 状态，以达到防止菌种退化、死亡的目的。
㈡
常用的保藏方法
1、斜面低温保藏法
将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后， 棉塞部分用油纸包扎好，移至2-8℃的冰箱中保藏。 此法为实验室和工厂菌种室常用的保藏法，优点是操作简单， 使用方便，不需特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、 变异与污染杂菌等。缺点是容易变异，因为培养基的物理、化 学特性不是严格恒定的，屡次传代会使微生物的代谢改变，而 影响微生物的性状；污染杂菌的机会亦较多。
7、液氮超低温保藏法
液氮超低温保藏法简称液氮保藏法或液氮法。它是以甘油、 二甲基亚砜等作为保护剂，在液氮超低温（-196℃）下保藏的 方法。 此法操作简便、高效、保藏期一般可达到15年以上，是目前 被公认的最有效的菌种长期保藏技术之一。除了少数对低温损伤 敏感的微生物外，该法适用于各种微生物菌种的保藏 。 优点是可使用各种培养形式的微生物进行保藏，无论是孢子 或菌体、液体培养物或固体培养物均可采用该保藏法。其缺点 是需购置超低温液氮设备，且液氮消耗较多，操作费用较高。