水中总大肠菌群检测方法
水中总大肠菌、大肠埃希氏菌和耐热大肠菌群的测定 光度法
水中总大肠菌、大肠埃希氏菌和耐热大肠菌群的测定光度法
水中总大肠菌、大肠埃希氏菌和耐热大肠菌群的测定是一项重要的环境监测工作，对于保障水质安全具有重要意义。
光度法是一种常用的测定方法，通过测定样品中细菌的光学密度来间接反映其浓度，具有操作简便、结果准确等优点。
本文将介绍水中总大肠菌、大肠埃希氏菌和耐热大肠菌群的光度法测定方法。
一、实验仪器与试剂
1. 实验仪器：分光光度计
2. 试剂：含有氯化铁的培养基、无菌水
二、样品处理
1. 取水样：从待测水体中取得一定体积的水样，使用无菌容器收集。
2. 过滤处理：将水样通过0.45μm的微孔滤膜过滤，以去除大颗粒悬浮物和杂质。
3. 稀释处理：取适量过滤后的水样，用含有氯化铁的培养基进行适当稀释，以提高细菌在培养基中的生长适应性。
三、菌落计数
1. 培养条件：将处理后的水样接种在含有氯化铁的培养基上，进行37℃培养24小时。
2. 计数方法：取适量培养好的菌落涂布在琼脂平板上，进行菌落计数。
四、光度法测定
1. 光学密度测定：取适量经过稀释处理的水样，用分光光度计在特定波长下进行吸光度测定。
2. 细菌浓度计算：根据吸光度值和标准曲线，计算出水样中细菌的浓度。
五、结果分析
根据测定得到的数据，可以对水样中总大肠菌、大肠埃希氏菌和耐热大肠菌群进行浓度分析，为水质安全评价提供参考依据。
通过光度法测定水中总大肠菌、大肠埃希氏菌和耐热大肠菌群的浓度，可以及时了解水质情况，为环境保护和公共卫生安全提供重要数据支持。
希望本文介绍的光度法测定方法对相关工作人员有所帮助。
总大肠菌的测定实验作业指导书
作业指导书 页码：第 1页，共11页 文件编号：JLQX-03-022 版次：2022版，第0次修订 文件名称：水中总大肠菌群的测定 发布日期：2022 年1 月1 日水中总大肠菌群的测定1、方法依据水质 水中总大肠菌群的测定 多管发酵法2、合用范围总大肠菌群是指那些能在37℃48h之内发酵乳糖产酸气的、需氧及碱性厌氧的革兰式阴性的无芽胞杆菌。
主要包括有埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属等菌属的细菌。
总大肠菌群的检验方法中，多管发酵法可合用于各种水样（包括底泥），但操作较繁，需要时间较长；滤膜法主要是用于杂质较少的水样，操作简单快速。
如果是使用滤膜法，则总大肠菌群可重新定义为：所有能在含乳糖的远腾氏培养基上，于37℃24h之内生长出带有金属光泽暗色菌落的、需氧的和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。
粪便中存在有大量的大肠菌群细菌，在水体中存活的时间和对氯的反抗力等于常道致病菌，如沙门氏菌、志贺氏菌等相似，因此将总大肠菌群作为水体受粪便污染的指示菌是合适的。
但在某些水质条件下，大肠菌群细菌在水中能自行繁殖，这是不利之处。
作业指导书 页码：第2页，共11页 文件编号：JLQX-03-022 版次：2022版，第0次修订 文件名称：水中总大肠菌群的测定 发布日期：2022 年1 月1 日3、测定原理3.1水中总大肠菌群的测定多管发酵是根据大肠菌群细菌能发酵乳糖、产酸产气以及具备革兰氏染色阴性、无芽孢、呈杆状等有关特性，通过三个步骤进行检验，以求得水样中的总大肠菌群数。
多管发酵法是以最可能数简称MPN来表示实验结果的。
实际上它是根据统计学理论，估计水体中的大肠杆菌密度和卫生质量的一种方法。
如果从理论上考虑，并且进行大量的重复检定，可以发现这种估计有大于实际数字的倾向。
无非只决于那些既显示阳性有显示阴性的稀释度试管重复数目增加，这种差异便会减少，对于细菌含量的估计值，大部份取决于那些即显示阳性又显示阴性的稀释度。
多管发酵法与纸片法测定水中总大肠菌群和粪大肠菌群
多管发酵法与纸片法测定水中总大肠菌群和粪大肠菌群李恒，等多管发酵法与纸片法测定水中总大肠菌群和粪大肠菌群Determination of Total Coliform Group and Fecal Coliform Group in Water by Multi-tube Fermentation and Paper Disk Method李恒张志君王光惠陈泓+（湖南省衡阳生态环境监测中心，湖南衡阳421000）［摘要］通过多管发酵法和纸片快速法对实际水样的总大肠菌群和粪大肠菌群进行实验比对，结果表明，两种方法的结果相差不大，但纸片快速法比多管发酵法操作简便、检测时间短，更适用于环境监测日常分析％［关键词］多管发酵法；纸片快速法；总大肠菌群;粪大肠菌群［中图分类号］X833［文献标识码］%引言粪大肠菌群是能在44.5!温度下生长并发酵乳糖产酸产气的耐热的大肠菌群，属于总大肠菌群的一部分，主要来自粪便。
水中粪大肠菌群和总大肠菌群的检验是研究水体污染和环境卫生的重要指标，具有广泛的卫生学意义。
目前，国内已颁布的标准主要是多管发酵法和纸片快速法［1+4］。
多管发酵法操作繁琐且时间过长（48~72h$,难以满足当前环境监测工作的需求［5］%纸片快速法不仅培养时间短（18~ 24h）,且无需提前准备培养基，可以避免培养基杂菌入侵和时间过长等不足。
为更精确、快速、可靠地进行监测，本文用多管发酵法和纸片快速法同步进行对比实验，并对两种分析方法的实验结果进行了比较分析。
1材料与仪器1.1材料水质粪大肠菌群、总大肠菌群快速检验纸片（广东达元绿洲食品安全科技股份有限公司）；粪大肠菌群、总大肠菌群、培养基、革兰氏染色液％1.2试剂EC培养基：胰豚20g,乳糖5g,胆盐三号1.5g，磷酸氢二钾4g,磷酸二氢钾1.5g,氯化钠5g%将上述成分加热溶于1000ml水中，灭菌后的pH应在6.9左右。
该培养基在低温无菌条件下可以保存一个月％无菌水：将纯水在115!高压蒸汽灭菌20min,备用。
水中大肠菌群的检测
水中大肠菌群的检测法——（多管发酵法）一、实验原理大肠菌群是评价水质好坏的一个重要的卫生指标，也是反映水体被生活污水污染的一项重要监测项目。
大肠菌群是一群以大肠埃希氏菌（Escherichia coli）为主的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，在37℃生长时，能在48小时内发酵乳糖并产酸产气。
我国生活饮用水卫生标准中规定一升水样中总大肠菌群数不超过三个。
多管发酵法包括初发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。
发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一德汉氏小套管。
乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气。
本实验为精简实验，所以省略了平板分离和复发酵试验后两部分，直接通过第一部分初发酵试验的颜色变化进行判断是否存在大肠菌群。
初发酵试验水样接种于发酵管内，37℃下培养，24小时内小套管中有气体形成，并且培养基混浊，颜色改变，说明水中存在大肠菌群，为阳性结果。
48小时后仍不产气的为阴性结果。
二、实验器材1.水样中心湖的湖水2．试剂三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管3．仪器及其它用品移液枪，16支试管（16支德汉氏小套管）三、实验步骤初发酵试验取16支发酵管，其中10支用移液管加入10ml一倍的乳酸蛋白胨培养液，5支加入5ml三倍乳糖蛋白胨培养液，1支加入9ml自然水。
然后往16支试管各倒置一支汉氏小套管。
完成后包装好，于121℃高压灭菌锅中灭菌30min左右。
将取回来的中心湖水样稀释20倍。
待试管冷却后，在无菌操作条件下，向装有三倍的乳酸蛋白胨培养液的5支试管加入10ml水样，向装有一倍的乳糖蛋白胨培养液的5支试管中加入1ml水样，向装有一倍的乳酸蛋白胨培养液的另5支试管中加入1ml 10-1水样。
将各试管充分混均，置于37℃恒温箱中培养24h。
四、实验结果同时观察其他两组也是用中心湖水样的，其结果全都是显示为黄色。
初步得出，取回来的水样的大肠菌群严重超标，比检测表的上限还要高，已经失去检测的意义了。
水中大肠菌群的检测
水中大肠菌群的检测法——（多管发酵法）一、实验原理大肠菌群是评价水质好坏的一个重要的卫生指标，也是反映水体被生活污水污染的一项重要监测项目。
大肠菌群是一群以大肠埃希氏菌（Escherichia coli）为主的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，在37℃生长时，能在48小时内发酵乳糖并产酸产气。
我国生活饮用水卫生标准中规定一升水样中总大肠菌群数不超过三个。
多管发酵法包括初发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。
发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一德汉氏小套管。
乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气。
本实验为精简实验，所以省略了平板分离和复发酵试验后两部分，直接通过第一部分初发酵试验的颜色变化进行判断是否存在大肠菌群。
初发酵试验水样接种于发酵管内，37℃下培养，24小时内小套管中有气体形成，并且培养基混浊，颜色改变，说明水中存在大肠菌群，为阳性结果。
48小时后仍不产气的为阴性结果。
二、实验器材1.水样中心湖的湖水2．试剂三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管3．仪器及其它用品移液枪，16支试管（16支德汉氏小套管）三、实验步骤初发酵试验取16支发酵管，其中10支用移液管加入10ml一倍的乳酸蛋白胨培养液，5支加入5ml三倍乳糖蛋白胨培养液，1支加入9ml自然水。
然后往16支试管各倒置一支汉氏小套管。
完成后包装好，于121℃高压灭菌锅中灭菌30min 左右。
将取回来的中心湖水样稀释20倍。
待试管冷却后，在无菌操作条件下，向装有三倍的乳酸蛋白胨培养液的5支试管加入10ml水样，向装有一倍的乳糖蛋白胨培养液的5支试管中加入1ml水样，向装有一倍的乳酸蛋白胨培养液的另5支试管中加入1ml 10-1水样。
将各试管充分混均，置于37℃恒温箱中培养24h。
四、实验结果同时观察其他两组也是用中心湖水样的，其结果全都是显示为黄色。
初步得出，取回来的水样的大肠菌群严重超标，比检测表的上限还要高，已经失去检测的意义了。
实验十二-水中细菌总数和大肠杆菌检测
30
2
1
150
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2
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2
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240
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0
160
3
1
20032Fra bibliotek240
95%可信限
上限
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360
13000
3
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1
4600
710
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2
11000
1500
48000
3
3
3
≥24000
大肠菌群测定
产酸判断：紫色培养液变成黄色
产气判断：发酵导管内有小气泡，如轻轻打动试 管有气泡沿管壁上浮，应考虑可能有气体产生， 需进一步试验。
稀释度选择及细菌总数报告方法
平均 菌落
水中总大肠菌群测定
水中总大肠菌群的测定－多管发酵法一、实验目的联合水净化工程中的细菌查验，掌握水环境监测中和给水水质查验中大肠杆菌群数的测定方法，同时经过大肠杆菌群的测定，认识大肠杆菌群的生化特征。
二、原理总大肠菌群可用多管发酵法或滤膜法查验。
多管发酵法的原理是依据大肠菌群细菌能发酵乳糖、产酸产气以及具备革兰氏染色阴性，无芽孢，呈杆状等相关特性，经过初发酵试验、平板分别和复发酵试验等三个步骤进行实验求得水样中的总大肠菌群数。
试验结果以最可能数（most probable number），简称MPN 表示。
三、仪器高压蒸气灭菌器；恒温培育箱；冰箱；生物显微镜；载玻片；酒精灯；镍铬丝接种棒；培育皿（直径 100mm）；试管（18× 180mm）；吸管（1、5、10mL）；烧杯；锥形瓶；采样瓶等等。
四、培育基的制备：1.乳糖蛋白胨培育液：将 10g 蛋白胨、 3g 牛肉膏、 5g 乳糖和 5g 氯化钠加热溶解于1000mL 蒸馏水中，调理溶液 pH 为—，再加入 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1mL，充足混匀，分装于试管中，于 115℃高压灭菌器中灭菌 20min，储存于冷暗处备用。
2.三倍浓缩乳糖蛋白陈培育液：按上述乳糖蛋白胨培育液的制备方法配制。
除蒸馏水外，各组分用量增添至三倍。
3.品红亚硫酸钠培育基（ 1）储备培育基的制备：于2000mL 烧杯中，先将20—30g 琼脂加到900mL 蒸馏水中，加热溶解，而后加入 3.5g 磷酸氢二钾及10g 蛋白胨，混匀，使其溶解，再用蒸馏水增补到1000mL，调理溶液pH 至—。
趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加10g 乳糖，混匀，定量分装于250 或 500mL 锥形瓶内，置于高压灭菌器中，在115℃灭菌20min，储存于冷暗处备用。
（2）平皿培育基的制备：将上法制备的储备培育基加热消融。
依据锥形瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按比率汲取必定量的5%碱性品红乙醇溶液（ 1000mL培育基约加 20mL5%碱性品红乙醇溶液），置于灭菌试管中；再按比率称取无水亚硫酸钠（ 1000mL 培育基约加 5g 无水亚硫酸钠），置于另一灭菌空试管内，加灭菌水少量使其溶解，再置于开水浴中煮沸 10min（灭菌）。
地下水总大肠菌群的测定方法
地下水总大肠菌群的测定方法
地下水中总大肠菌群的测定是非常重要的，因为它可以反映出
水质的卫生状况。
以下是一些常用的测定方法：
1. 膜过滤法，这是一种常用的测定方法，通过将地下水样品通
过0.45微米的膜过滤器，然后将膜放置在含有大肠菌群特异培养基
的琼脂平板上进行培养。
培养后，通过计数形成的菌落来确定水样
中大肠菌群的数量。
2. 荧光素基因定量PCR法，这是一种分子生物学方法，通过提
取地下水中的DNA，使用荧光素基因特异引物进行PCR扩增，然后
使用荧光素探针进行定量检测。
这种方法可以快速准确地测定大肠
菌群的数量。
3. 色素培养基法，使用含有某种特定底物的琼脂平板进行培养，通过大肠菌群对底物的特异反应产生的颜色变化来测定其数量。
4. 流式细胞术，这是一种高通量的测定方法，通过将水样中的
微生物染色标记，然后通过流式细胞仪进行快速准确地测定大肠菌
群的数量。
总的来说，测定地下水中总大肠菌群的方法有多种，可以从不同的角度对水质进行评估。
在实际应用中，可以根据实际情况选择合适的方法进行测定。
实验九水中总大肠菌群的测定报告
菌群数。
每组： 三倍浓缩乳糖蛋白胨（5 ml）15管 普通浓度乳糖蛋白胨（10 ml）15管 伊红美兰培养基 150 ml (5个平板) 三角瓶1个（装27mL蒸馏水灭菌）、 10ml吸管 2支、1ml吸管2支包扎灭菌
Байду номын сангаас
表2 最可能数(MPN)表
（接种5份10mL 水样、5份1mL水 样、5份0.1mL水 样时，不同阳性 及阴 性情况下 100mL水样中细 菌数的最可能数 和95%可信限值）
（2）水源水
在装有5ml 3倍浓度浓缩乳糖蛋白胨培养基的试管中加入10ml水样品；于各装有 10mL乳糖蛋白胨培养液的5个试管中（内有倒管），分别加入1mL水样；再于各 装有10mL乳糖蛋白胨培养液的5个试管中（内有倒管），分别加入1mL 1：10 稀释的水样。共计15管，三个稀释度。将各管充分混匀，置于37℃恒温箱内培养 48h。 （可以根据水的污染程度选择3个稀释度）
（3） 伊红美培养基：按照说明称取适量培养基，置于三角瓶中，加蒸馏
水溶解， 115℃高压灭菌15min，待冷却至45℃—50℃ ，倒平板待用。
培养基配制操作图示：
用漏斗分装培养基及摆斜面
培养基的分装：一般制作斜面培养基时，每只15×150毫米的试管，约装 3～4毫升（1/4～1/3试管高度），如制作深层培养基，每只20×220毫 米的试管约装12～15毫升。每只锥形瓶装入的培养基，一般以其容积的
实验九
水中总大肠菌群的测定
实验八 水中总大肠菌群的测定
一 实验器材 1 培养基
乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置小套管）培养基、伊红美兰琼脂平板
2 溶液和试剂 革兰氏染色液
3 仪器和其他用品
高压湿热灭菌器、显微镜、载玻片、灭菌培养皿、灭菌吸管、试管、三角 瓶、接种环
实验九水中总大肠菌群的测定
5 复发酵试验 上述涂片镜检的菌落如为革兰氏阴性无芽孢的杆菌;则挑选该菌落的另一
部分接种于装有普通浓度乳糖蛋白胨培养液的试管中内有倒置管;每管可接 种分离自同一初发酵管的最典型菌落1～3个;然后置于37℃恒温箱中培养24h; 有产酸 产气者;即证实有大肠菌群存在; 根据证实有大肠菌群存在的阳性管瓶 数查附表1大肠菌群检数表;报告每升水样中的大肠菌群数;
30min; 对热不稳定的培养基如含有葡萄糖 氨基酸等物时;应适当降低压力;
延长时间;
5灭
菌时间一到;切断电源;待压力降至零时;才能打开排气阀;然后打开灭菌器盖;
取出物品;
手提式高压蒸 汽灭菌锅
高压蒸汽自动 灭菌锅
斜面摆放与冷凝 倒平板操作法示意图
五 操作步骤 1 水样的采取 1检测自来水
先将自来水龙头用火焰烧灼3 min灭菌;再开放水龙头使水流5 min后;在 火焰旁打开灭菌三角瓶塞;以其接取水样;迅速地进行分析; 2检测池水 河水或湖水
培养基配制操作图示：
用漏斗分装培养基及摆斜面
培养基的分装：一般制作斜面培养基时;每只15×150毫米的试管;约装 3～4毫升1/4～1/3试管高度;如制作深层培养基;每只20×220毫米的试 管约装12～15毫升; 每只锥形瓶装入的培养基;一般以其容积的一半为宜;
包扎
1 培养皿：以旧报纸密密包紧;一般以6套做一包;待灭菌; 2 吸管：在距其粗头顶端约0 5cm处;塞一小段1 5cm长的棉花; 棉花要 塞得松紧恰当过紧;吹吸液体太费劲；过松;吹气时棉花会下滑;然后 分别将每支吸管尖端斜放在旧报纸条的的近左端;与报纸约呈60º角; 并将右端多余的报纸打一小结; 3 三角玻扒：跟包扎吸管相似;将三角部分斜放在报纸条的近左端;与 报纸约呈45º角;并将右端多余的报纸打一小结; 4 玻璃器皿 金属器械包扎完毕后置干燥箱160170℃灭菌2 h
水的大肠菌群检测方法
水的大肠菌群检测方法水是生命的重要组成部分，也是人类日常生活中不可或缺的资源。
然而，水源的安全性和水质的卫生问题一直备受关注。
其中，水中的大肠菌群含量是衡量水质卫生程度的重要指标之一、大肠菌群是指肠道中的一类细菌，其中的分支肠杆菌是最常见的一种。
高含量的大肠菌群在水中存在，可能表明水源受到了粪便或下水道污染。
因此，检测水的大肠菌群含量对评估水源卫生问题至关重要。
以下是一些常见的水的大肠菌群检测方法：1. 集菌法（Most Probable Number Method，MPN）：这是一种传统的大肠菌群检测方法，常用于饮用水和游泳池水的监测。
该方法通过在不同稀释度的水样中进行培养，并观察菌落形成的情况来估算大肠菌群的含量。
这种方法的优点是简单易行，可以适用于一定量的水样，但需要较长的培养时间和专业实验室。
2. 膜过滤法（Membrane Filtration Method）：这是一种常用的水质检测方法，也常用于大肠菌群的检测。
该方法通过过滤水样，将其中的微生物捕捉在膜上，然后将膜转移到含有营养物质的培养基上进行培养。
通过计数培养基上的菌落数量，可估算出水样中的大肠菌群含量。
这种方法的优点是可以对大体积的水样进行检测，并且具有较高的准确性和灵敏度。
3. PCR法（Polymerase Chain Reaction）：PCR法是一种基于DNA分子的检测方法，可以快速检测和测定大肠菌群的含量。
该方法通过提取水样中的DNA，然后使用特定的引物和DNA聚合酶，在反应管中进行一系列温度变化的循环，扩增目标DNA片段。
最后通过凝胶电泳等技术，可以直接观察到扩增产物，从而判断水样中的大肠菌群含量。
PCR法具有高效快速、高灵敏度和高特异性等优点。
同时，PCR法还可以结合实时荧光定量PCR技术，通过测量荧光强度来定量水样中的大肠菌群含量。
4. 流式细胞仪法（Flow Cytometry Method）：流式细胞仪是一种高效、灵敏的细胞计数和分类技术。
水中总大肠菌群的测定法(多管发酵法)
6.1生活饮用水
6.1.1初发酵试验
在2个各装有已灭菌50ml三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液（3.2）的大试管或烧瓶中（内有倒管），以无菌操作各加入水样100ml；在10支装有已灭菌5ml三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液（3.2）的试管中（内有倒管），以无菌操作各加入水样10ml，混匀后置于37℃恒温箱内培养24小时。
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生活饮用水 总大肠菌群 滤膜法方法证实
生活饮用水微生物指标总大肠菌群1.项目概述本实验依据GB-T 5750.12-2006 生活饮用水标准检验方法总大肠菌群滤膜法。
总大肠菌群指一群在37℃培养24 h能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。
本方法适用于生活饮用水和低浊度的水源水中总大肠菌群数的测定。
2.实验原理用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤水样，细菌被截留在滤膜上，将滤膜贴在选择性培养基上，经培养后，计数生长在滤膜上的典型大肠菌群菌落数。
3.培养基与试剂3.1 品红亚硫酸钠培养基3.1.1 成份A 蛋白胨10gB 酵母浸膏5gC 牛肉膏5gD 乳糖10gE 琼脂15~20gF 硫酸氢二钾 3.5gG 无水亚硫酸钠5g左右H 碱性品红乙醇溶液(50g/L) 20mLI 蒸馏水1000mL3.1.2 储存培养基的制备先将琼脂加到500mL蒸馏水中，煮沸溶解，于另500mL蒸馏水中加入硫酸氢二钾、蛋白胨、酵母浸膏和牛肉膏，加热溶解，倒入已溶解的琼脂，补充蒸馏水至1000mL，混匀后调pH为7.2~7.4，再加入乳糖，分装，115℃高压灭菌20min，储存于冷暗处备用。
3.1.3 平皿培养基的配制将上法制备的储存培养基加热融化，用灭菌吸管按比例吸取一定量的5％碱性品红乙醇溶液置于灭菌空试管中，再按比例称取所需的无水硫酸钠置于另一灭菌试管中，加灭菌水少许，使其溶解后，置沸水浴中煮沸10min以灭菌。
用灭菌吸管吸取已灭菌的亚硫酸钠溶液，滴加于碱性品红乙醇溶液至深红色退成淡粉色为止，将此亚硫酸钠与碱性品红的混合液全部加到已融化的储存培养基内，并充分混匀(防止产生气泡)，立即将此种培养基15mL倾入已灭菌的空平皿中。
待冷却凝固后置冰箱内备用。
此种以制成的培养基于冰箱内保存不宜超过二周。
如培养基已由淡粉色变为深红色，则不能再用。
3.2 乳糖蛋白胨培养基3.2.1 成份A 蛋白胨10gB 牛肉膏3gC 乳糖5gD 氯化钠5gE 溴甲酚紫乙醇溶液(16g/L) 1mLF 蒸馏水1000mL3.2.2 制法将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠溶于蒸馏水中，调整pH为7.2~7.4，再加入1mL1.6％溴甲酚紫乙醇溶液，充分混匀，分装于装有倒管的试管中，115℃高压灭菌20min，贮存于冷暗处备用。
水中总大肠菌群的测定
微生物综合实验：水中细菌总数和大肠菌群的测定一实验目的1、学习水样的采取方法和水样细菌总数测定的方法。
2、了解水源水的平板菌落计数的原则。
3、学习检测水中大肠菌群的方法，了解大肠菌群数量与水质状况的关系。
二、实验原理水中细菌总数可作为判定被检水样被有机物污染程度的标志。
本实验应用平板计数技术测定水中细菌总数。
由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌总数仅是一种近似值。
目前一般是采用普通肉膏蛋白胨琼脂培养基。
我国规定1ml自来水中细菌总数不得超过100个。
大肠菌群是一群需氧或兼性厌氧的、在37℃培养24~28h能发酵乳糖产酸与产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌，它们普遍存在于肠道中，且具有数量多，与多数肠道病原菌存活期相近，易于培养和观察等特点。
大肠菌群数是指每升水中含有的大肠菌群的近似值。
大肠菌群的检测方法有多管发酵法和滤膜法两种。
本实验采用多管发酵法，它被称为水的标准分析法，即将一定量的样品接种乳糖发酵管，根据发酵反应的结果，确证大肠菌群的阳性管数后在检索表中查出大肠菌群的近似值。
我国规定：每升自来水中大肠菌群数不得超过3个。
三、实验材料和用具：1、培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，乳糖蛋白胨培养基，三倍浓度浓缩乳糖蛋白胨培养基，伊红美兰培养基（EMB培养基）。
2、试剂：无菌水、结晶紫染液、卢氏碘液、95%乙醇、番红染色液。
3、器皿：灭菌三角烧瓶，灭菌的带玻璃塞瓶，灭菌培养皿，灭菌吸管，灭菌试管，德汉氏小管，载玻片，无菌空瓶，移液管，接种环，酒精灯，注射器，显微镜等。
四、实验步骤第一周（2008-11-11）1、制备无菌水：取4支试管，向每支试管中加入9ml自来水。
2、配制：牛肉膏蛋白胨培养基（牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂15~20g，蒸馏水1000ml，pH 7.2~7.4）乳糖蛋白胨培养基（蛋白胨10g，牛肉膏3g，乳糖5g，NaCl 5g，1．6%溴甲酚紫乙醇溶液1ml，蒸馏水1000ml，pH 7.2~7.4）三倍浓度浓缩乳糖蛋白胨培养基（将上述乳糖蛋白胨培养基浓缩3倍配制）3、将以上配制的无菌水和培养基全部进行灭菌处理。
实验九 水中总大肠菌群的测定
（2）检测池水、河水或湖水
应取距水面10－15cm的深层水样，先将灭菌带玻璃塞的空瓶瓶口向下 浸入水中，然后翻转过来，拨开玻璃塞，水即流入瓶中，满后将玻璃塞塞
好，再从水中取出。有时需用特制的采样器取水样。采取的水样最好立即
维持30min。对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨基酸等物时，应适当降
低压力，延长时间。 5.灭菌时间一到，切断电源，待压力降至零时，才能打开排气阀，然后打 开灭菌器盖，取出物品。
手提式高压蒸 汽灭菌锅
高压蒸汽自动 灭菌锅
斜面摆放与冷凝
倒平板操作法示意图
五 操作步骤 1 水样的采取
（1）检测自来水
4 分离培养
将初发酵的阳性管(产酸产气)的菌液分别划线接种于伊红美蓝琼脂培 养基平板。置36±1℃温箱内，培养18～24h，然后取出，观察菌落形态。 选择符合大肠菌群菌落特征的菌落:① 深紫黑色，有金属光泽；② 紫黑色， 不带或略带金属光泽；③ 淡紫红色，中心颜色较深, 挑取一部分，进行革 兰氏染色。
思考题
1. 何谓大肠菌群？它主要包括哪些细菌属 ？ 2. 假如水中有大量致病菌，如：痢疾、伤 寒、霍乱等病原菌，用多管发酵法检测总 大肠菌群，能否得到阳性结果？为什么？ 3. 为什么接种100、10 mL水样，用的是3 倍 浓缩的乳糖蛋白胨培养基，而接种1.、 0.1、0.01、0.001 mL水样，则用乳糖蛋白 胨培养基？
（2）水源水
在装有5ml 3倍浓度浓缩乳糖蛋白胨培养基的试管中加入10ml水样品；于各装有 10mL乳糖蛋白胨培养液的5个试管中（内有倒管），分别加入1mL水样；再于各 装有10mL乳糖蛋白胨培养液的5个试管中（内有倒管），分别加入1mL 1：10 稀释的水样。共计15管，三个稀释度。将各管充分混匀，置于37℃恒温箱内培养 48h。 （可以根据水的污染程度选择3个稀释度）
多管发酵法测定水中大肠菌群
多管发酵法测定水中大肠菌群
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多管发酵法测定水中大肠菌群
一、试验目标 二、试验原理 三、试验材料 四、试验步骤 五、试验汇报
多管发酵法测定水中大肠菌群
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一、试验目标
1、学习测定水中大肠菌群数量多管发酵法。 2、了解大肠菌群数量在饮水中主要性。
多管发酵法测定水中大肠菌群
划线接种于伊红美蓝琼脂平板上，再于37 ℃培养 18～24 h，将符合以下特征菌落进行染色镜检。
深紫黑色，有金属光泽；
紫黑色，不带或略带金属光泽；
淡紫红色，中心颜色较深。
多管发酵法测定水中大肠菌群
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（3）复发酵试验 将镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌菌株重复初
步发酵试验。并依据初发酵管试验阳性管查表， 即得大肠菌群数。
多管发酵法测定水中大肠菌群
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2）平皿分离（证实试验）
水中除大肠菌群外，还有其它细菌可能引 发糖类发酵，所以需要深入证实。
将初发酵管中已发酵菌液接种于伊红美兰 培养基，37 ºC培养24 h，依据菌落特征（带关 键、有金属光泽深紫色菌落），挑取可能为大 肠菌群菌落制片，经革兰氏染色，深入证实是 否为大肠菌群。
水样稀释： 10-1与10-2
接种：分别吸收1ml 10-2 、 10-1和原水样接入装 有10ml普通浓度乳糖蛋白胨发酵管 ；另取10ml原 水样接入装有5ml三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管 ， 混匀后，37 ℃培养24 h，24 h未产气继续培养48 h。
多管发酵法测定水中大肠菌群
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（2）平板分离 将经24 h和48 h培养后产酸产气发酵管，分别
2.思索题
（1） 何谓大肠菌群，它主要包含哪些细菌属？
水中总大肠菌群检测方法
水中总大肠菌群检测方法【摘要】俗话说：人可以七天不吃饭，但绝不可以三天不喝水。
这虽然是个俗语，但其意在说明水的珍贵。
水是人类赖以生存和发展的重要自然资源，它与人们的生活息息相关。
然而，在人们的日常用水中，饮用水的卫生质量是否达标，以及如何消除人们生活用水中存在的安全隐患等一系列问题已经成为我国社会民众广泛关注的话题。
【关键词】总大肠菌群；检测；检测方法随着社会经济的高速发展以及工业化、城市化进程的推进，水资源污染问题越来越严重，与此同时，人们对于生活饮用水的水质要求也越来越高。
目前，我国的饮用水中存在大量的微生物，其中，部分微生物对人们的身体健康有一定的威胁，因此，饮用水必须严格地进行消毒杀菌处理，并应经过严格的微生物检测，检测达标后方可输配给终端用户。
目前常采用的微生物检测方法主要有多管发酵法、滤膜法等。
笔者结合实际工作经验分析了相关的检验方法及步骤。
一、总大肠菌群饮用水中的总大肠菌群主要是指大肠杆菌、大肠菌群和粪大肠菌群三大类型细菌共同组成的大肠菌群。
总大肠菌群是指在37℃条件下培养时，能够使乳糖进行发酵，并且在全天24小时之内都产酸、产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌。
主要包括埃希氏菌属、柠檬酸细菌属肠杆菌属及克雷伯氏菌属四种细菌。
由于其数量大，在体外存活时间与肠道致病菌相近，且检验方法比较简便，故被作为检验肠道致病菌的指示菌。
水中大肠菌群数的多少，表明水体被粪便污染的程度，并间接地表明有肠道致病菌存在的可能性。
因此，总大肠菌群是评价饮用水水质的重要指标，具有广泛的卫生学意义。
目前，检测总大肠菌群的方法主要有两种，分别是多管发酵法和滤膜法。
二、多管发酵法多管发酵法是做早被用作水质检测的技术，至今应用已超过80年，在水样大肠菌群的检测中一直在应用。
其核心是将水样进行10倍系列稀释，分别接种到乳糖蛋白胨培养液中，在35℃培养48小时，观察细菌生长情况。
将产酸产气的发酵管分别转种在伊红美篮琼脂平板上进行分离培养，并通过革兰染色、镜检和进行证实试验。
水中总大肠菌、大肠埃希氏菌和耐热大肠菌群的测定 光度法 -回复
水中总大肠菌、大肠埃希氏菌和耐热大肠菌群的测定光度法-回复水中总大肠菌、大肠埃希氏菌和耐热大肠菌群的测定- 光度法1. 引言水是生命中不可或缺的重要资源，然而水中存在着许多潜在的细菌污染。
其中，大肠菌群中的大肠埃希氏菌在水体中的检测尤为重要，因为它们可以作为病原体或指示性微生物，反映水体是否受到了粪便污染。
耐热大肠菌群的测定则是为了评估水体中存在的耐热菌的数量，以考察水体的卫生质量。
2. 实验步骤2.1 样品收集与处理从水源中收集所需样品，并确保样品容器是消毒干净的。
将水样转移到试管中，透过120目的筛布过滤以去除杂质。
将筛布冲洗，大肠埃希氏菌和耐热大肠菌群的检测要求分别使用两个筛布。
2.2 媒介培养基的制备大肠埃希氏菌的培养基制备：使用大肠埃希氏菌选择液增殖大肠埃希氏菌菌种，然后按照制造商的说明添加适量的大肠埃希氏菌生长培养基。
将培养基搅拌均匀后，分装到培养皿中，并进行灭菌处理。
耐热大肠菌群的培养基制备：使用耐热大肠菌选择液增殖耐热大肠菌菌种，然后按照制造商的说明添加耐热大肠菌生长培养基。
将培养基搅拌均匀后，分装到培养皿中，并进行灭菌处理。
2.3 样品处理与菌落计数取一定体积的水样（一般为10ml），均匀地加入到含有大肠埃希氏菌和耐热大肠菌群培养基的两个培养皿中。
在分发前使用三倍无微生物水进行稀释，确保每个培养皿中的细菌数量适合计数。
将含样品的培养皿进行培养，在适当的温度条件下孵育一定的时间（一般为37摄氏度，大肠埃希氏菌为48小时，耐热大肠菌群为24小时）。
之后，观察并数计培养皿中的菌落形成单位（CFU）。
3. 结果与数据分析根据菌落计数的结果，可以得到大肠埃希氏菌和耐热大肠菌群在水样中的数量。
将每个培养皿中的菌落计数相加，并乘以稀释倍数，即可计算出水中大肠菌的浓度。
4. 结论光度法是一种常用的快速测定水中总大肠菌、大肠埃希氏菌和耐热大肠菌群的方法。
通过观察和计数菌落形成单位，我们可以得到这些细菌在水中的相对数量。
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水中总大肠菌群检测方法
水中总大肠菌群检测一般采用以下方法：
1. 高级培养基方法：将取样的水样加入适当的营养培养基中，培养出细菌，并计数大肠菌群的数量。
常用的培养基有大肠杆菌培养基、MacConkey培养基等。
2. 荧光定量PCR方法：通过PCR技术检测水中大肠菌群的DNA，使用荧光探针结构标记大肠杆菌特异性基因，通过测定荧光信号进行定量分析。
3. 流式细胞仪方法：将水样进行染色，然后通过流式细胞仪分析计数大肠菌群的数量。
常用的染色方法有DAPI染色法、荧光活菌染色法等。
4. 基于微生物生物传感器的方法：利用微生物细胞对特定细菌的识别和响应能力，设计合成生物传感器来监测水中大肠菌群的存在和数量。
以上方法可根据实际需要选择使用，各自具有不同的优缺点。
在进行水环境监测时，可以结合多种方法进行检测，以获得准确和可靠的结果。