细菌计数

细菌计数试验方案

1 菌种

葡萄球菌菌株（分离奶牛乳房炎奶样），由本实验室筛选保藏．

2 培养基

平板培养基：普通营养琼脂．

液体培养基：普通肉汤．

3 仪器和器具

分光光度计；摇床；试管；移液器；青霉素瓶．

4 方法

4.1 接种：

将菌接种于平板培养基上,37℃培养24 h后，在试管中加入10ml液体培养基选取平板培养单个菌落2－3个进行接种，接种后37℃、震摇培养．

4.2 离心：

将液体培养的细菌部分无菌分装离心管，3000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀用生理盐水/PBS重悬，适当调整浓度，进行OD值测定；另外一部分液体培养细菌进行活菌计数用。4.3 菌体最适吸收波长测定：

以生理盐水/PBS做对照调零，取适当稀释浓度菌液，对其进行Uv波长（300-900nm）扫描测定OD值(表1)，据此确定其最大光吸收波长并用于以后各步OD值的测定．

表1 细菌不同波长扫描的光吸收值

波长/nm 300 350 400 450 460 470 480 490 500 550 600 OD值

4.4 菌体生长曲线测定：

取盛有10mL普通肉汤的试管13个，分别编号为0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、20、22、24h。用移液器分别准确吸取20µL菌液加入已编号的13个试管中，于37℃下振荡培养。然后分别按对应时间将试管取出，立即按上述步骤离心，进行OD值测定，同时进行作平板计数。(表2)

4.4.1 平板计数：

将每一时间菌液再梯度稀释(根据菌种而定，一般至lO-4、lO-5、lO-6、lO-7)，分别吸取0．5

mL涂平板(三个平行)，取平均数进行活菌的准确计数。

4.4.2 OD值测定：

将生理盐水/PBS倾倒入比色杯中，选用最适吸收波长分光光度计上调节零点，作为空白对照，并对不同时间培养液从0h起依次进行测定，对浓度大的菌悬液用生理盐水/PBS适当稀释后测定，使其OD值在0.10.～0.65以内，经稀释后测得的OD值要乘以稀释倍数，才是培养液实际的OD值。

表2 生长曲线光吸收测定值

时间(h) 0 1.5 3 4 6 8 10 12 14 16 20 22 24 OD值

活菌数

4.4.3 绘制曲线找出细菌的生长繁殖的4个时期：迟缓期，对数期，稳定期，衰亡期。

4.5 利用OD值估测细菌活菌数：

根据菌体生长曲线，找出菌体对数生长期，测定在对数生长期细菌活菌数。选对数期OD值在0.9-1之间的菌液作为原菌液样品，将此液分别作1：1.0、1：1.2、1：1.4、1：1.6、1：1.8、1：2.0六个稀释度稀释，分别测定其OD值，与此同时分别将此六个稀释度的菌液进行准确的细菌平板计数．记录OD值和相应的计数结果。（表3）

表3 细菌或菌数与OD值关系

稀释度生理盐水1：1.0 1:1.2 1:1.4 1:1.6 1:1.8 1:2.0 OD值

活菌数

根据比耳定律，溶液的浓度过高或过低，均能影响测量结果的准确性，固此选择OD值在0.2—1之间的范围确保结果回归方程r均大于0.95．从而证明了在此光度的范围内，细菌菌液的吸光度与细菌活菌数之间呈强相关性。