酶谱法检测金属蛋白酶活性
明胶酶谱实验方法
明胶酶谱实验72kD（MMP-2）和92kD（MMP-9）抽提缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl pH 7.5,150 mmol/L NaCl,20 mmol/L CaCl2,1μmol/L ZnSO4,0.01% (v/v) Triton X-100,（0.5% PMSF）。
10mmol/LPMSF 溶液：取PMSF 粉末17.4mg, 加异丙醇溶解, 定容至100ml，置-20℃备用。
注意：PMSF在临提取组织时再加入，使终浓度为0.5%，配制时不加，不然易失效。
先用新鲜肾组织，蛋白量尽量加至最大。
如果按这个还做不出来，那就是你的实验技术问题了明胶酶是锌依赖的蛋白酶. EDTA是金属离子络合剂.加了就把明胶酶的锌离子络合了，完全抑制MMP的活性。
你加了这个我保证你一辈子也做不出来。
蛋白浓度一般是先摸索一个量。
就是分别上10,20,30,40,50,60,70,80,90,100ug跑一下电泳，先看结果。
条带看不见的，或者太透明的，都不能选。
就是要半明半暗的那种。
看是哪个道分解的，我们就选其中几个量上样。
(1)、5%浓缩胶(现配现用)：d3H2O 2.1ml30%丙烯酰胺溶液0.5ml1mol/L Tris-HCL( PH=6.8) 0.38ml10% SDS 30μl10%过硫酸铵(AP) 30μlTEMED 3μl3ml (2)、10%分离胶(现配现用)：d3H2O 2.1ml30%丙烯酰胺溶液 2.31ml1.5mol/l Tris-HCL(PH=8.8) 1.75ml10% SDS 70μl10%过硫酸铵(AP) 70μlTEMED 5.6μl1%明胶0.7ml7ml (3)、4×上样缓冲液（4o C保存）：0.32% Tris-HCL 6.4ml4%SDS 8ml50%甘油 3.2 ml溴酚蓝0.024gd3H2O 2.4ml20ml①wash buffer Ⅰ500ml50mM Tris-HCl pH 7.6 3.0286g→400ml (调pH )5 mM CaCl2 （110.99）0.2776g1μM ZnCl2 （136.30）0.068mg2.5% Triton X-100 12.5ml②wash buffer Ⅱ500ml50mM Tris-HCl pH 7.6 3.0286g→400ml (调pH )5 mM CaCl2 （110.99）0.2776g1μM ZnCl2 （136.30）0.068mg③incubate buffer 500ml50mM Tris-HCl pH 7.6 3.0286g→400ml (调pH ) 50mM CaCl2 （110.99）0.2776g1μM ZnCl2 （136.30）0.068mg1% Triton X-100 5.0ml（五）注意事项1）孵育时间可以根据情况而定，可以延长。
酶谱法检测血清中基质金属蛋白酶活性
➢ MMP-2又叫明胶酶A， 其蛋白主要由纤维结缔组织细胞和肿瘤细胞产生，分子量 为72kDa。
➢ MMP-9又称为明胶酶B，主要由单核细胞、巨噬细胞多形核白细胞和肿瘤细胞产 生。分子量为92kDa，是MMPs中分子量最大旳酶。
➢ NGAL能与MMP-9以二硫键旳方式结合，能起到保护和调整MMP-9功能旳作用，所以NGAL 与肿瘤旳侵袭移动有亲密旳联络。
➢ 汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室李恩民教讲课题组以转染有pcDNA3 空白质粒 载体旳SHEEC 细胞为对照，酶谱法检测成果表白，转染有pcDNA-NGAL (-) 旳SHEEC 细胞 分泌旳MMP-9 和MMP-2旳活性均明显降低；而与此同步，转染有pcDNA-NGAL (＋) 旳 SHEEC 细胞分泌旳MMP-9 和MMP-2旳活性均明显升高。表白经过有义、反义技术使NGAL 基因体现发生变化能够对SHEEC 细胞分泌旳MMP-9 和MMP-2 旳活性产生明显影响。
➢ 胶原是ECM旳主要成份，目前已发觉，至少有12种不同胶原类型，其中以I、Ⅱ、Ⅲ 型胶原是间质结缔组织中旳主要成份。Ⅳ型胶原则主要存在于基底膜内。
➢ 肿瘤细胞旳侵袭是需要与细胞增殖、分化、移动旳有关基因及其体现调控模式旳变化 和增进细胞移动旳外界原因两者旳共同作用。
➢ 虽然肿瘤细胞侵袭旳分子机制还不是十分清楚，但已发觉许多调控细胞侵袭转移旳关 键分子及其信号通路。
脱色至蓝色背景和白色条带均十分明显时，用5％乙酸中断脱色； （4）待凝胶在5％乙酸中恢复到合适大小后，用凝胶图象处理系统分析成果，以白色条 带旳净光密度值相对定量样品中酶活性。
(多西环素)强力霉素影响基质金属蛋白酶活性和血管重构的实验研究
·１７０８·［文章编号］１０００—４７１８（２００６）０９—１７０８—０４强力霉素影响基质金属蛋白酶活性和血管重构的实验研究景颖，郑兴△，陈少萍，吴弘，张静（第二军医大学附属长海医院心内科，上海２００４３３）［摘要］目的：观察强力霉素对损伤动脉组织中基质金属蛋白酶（ＭＭＰ）活性的抑制作用，并探讨强力霉素对血管平滑肌细胞增殖、动脉内膜增生、管腔重构的影响。
方法：球囊导管扩张动脉的方法建立大鼠颈总动脉损伤模型。
治疗组用强力霉素３０ｍｇ·ｋｇ～·ｄ‘１干预。
明胶酶谱法测定损伤动脉组织中ＭＭＰｓ的活性。
用ＨＥ染色、ＶＶＧ染色、免疫组化标记仅一ａｃｔｉｎ和增殖细胞核抗原的方法观察损伤动脉内膜厚度、管腔重构及平滑肌细胞增殖的情况。
结果：①强力霉素治疗组ＭＭＰ一９活性在术后２４ｈ，３ｄ分别比对照组低２６．３％、３４．５％（Ｐ＜０．０１）；ＭＭＰ一２活性在术后７ｄ比对照组低４０．ｏ％（Ｐ＜０．０１）。
②强力霉素治疗使术后７ｄ内膜平滑肌细胞增殖率（４３．２３％±１．０６％）显著低于对照组（６２．７６％±１。
０２％）（Ｐ＜０．０１）；使术后１４ｄ、２８ｄ新生内膜厚度比对照组分别少３２．Ｏ％、３８．８％（Ｐ＜０．０１），而管腔面积比对照组多５８．０％、９０．４％（Ｐ＜０．０１）。
结论：强力霉素可以显著降低血管损伤后ＭＭＰｓ活性，抑制内膜平滑肌细胞的增殖、新生内膜增生以及管腔重构，提示它可能具有防治ＰＴＣＡ术后再狭窄的作用。
【关键词］血管成形术，气囊；多西环素；基质金属蛋白酶；肌，平滑，血管；血管重建［中图分类号］Ｒ３６３［文献标识码］ＡＥｆｆｅｃｔｏｆｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅｏｎｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｖａｓｃｕｌａｒｒｅ－ｍｏｄｅｌｉｎｇｉｎｂａｌｌｏｏｎ－－ｉｎｊｕｒｅｄｒａｔｃａｒｏｔｉｄａｒｔｅｒｉｅｓＪＩＮＧＹｉｎｇ，ＺＨＥＮＧＸｉｎｇ，ＣＨＥＮＳｈａｏ—ｐｉｎｇ，ＷＵＨｏｎｇ，ＺＨＡＮＧＪｉｎｇ（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＣａｒｄｉｏｌｏｇｙ，ＣｈａｎｇｈａｉＨｏｓｐｉｔａｌ，ＴｈｅＳｅｃｏｎｄＭｉｌｉｔａｒｙＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２００４３３，Ｃｈｉｎａ）［ＡＢＳＴＲＡＣＴ］ＡＩＭ：Ｔｏｅｘａｍｉｎｅｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ（ＭＭＰ）ａｃｔｉｖｉｔｙｂｙｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ（Ｄｏｘｙ）ａｎｄｉｔｓｅｆｆｅｃｔｏｎｖａｓｃｕｌａｒｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌｓ（ＳＭＣｓ）ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｎｅｏｉｎｔｉｍａｌｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａａｎｄｖａｓｃｕｌａｒｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ．ＭＥＴＨＯＤＳ：Ｔｈｅｍｏｄｅｌｏｆｒａｔｃｏｍｍｏｎｃａｒｏｔｉｄａｒｔｅｒｙｉｎｊｕｒｙｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｂｙｂａｌｌｏｏｎ—ｄｉｌａｔａｔｉｏｎ．Ｄｏｘｙｗａｓａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄｔｏｔｈｅａｎｉｍａｌｓｏｆｔｒｅａｔｍｅｎｔｇｒｏｕｐａｔｄｏｓｅｏｆ３０ｍｇ·ｋｇ～·ｄ～．ＴｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＭＭＰｓｉｎｔｈｅｔｉｓｓｕｅｏｆｉｎｊｕｒｅｄｃａｒｏｔｉｄａｒｔｅｒｉｅｓｗａｓｍｅａｓｕｒｅｄｂｙｇｅｌａｔｉｎｚｙｍｏｇｒａｐｈｙ．Ｔｈｅｔｈｉｃｋｎｅｓｓａｎｄａｒｅａｏｆｎｅｏｉｎｔｉｍａｌ，ｌｕｍｅｎａｒｅａａｎｄｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆＳＭＣｓｗｅｒｅｍｅａｓｕｒｅｄｂｙｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｉｃａｎａｌｙｓｉｓ．ＲＥＳＵＬＴＳ：１．ＭｔｅｒＤｏｘｙｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＭＭＰ一９ｉｎｔｈｅｃａｒｏｔｉｄａｒｔｅｒｉｅｓＷａｓｒｅｄｕｃｅｄｂｙ２６．３％ａｎｄ３４．５％ｃｏｍｐａｒｅｄｔｏｔｈａｔｉｎｒａｔｓｗｉｔｈｏｕｔＤｏｘｙｔｒｅａｔｍｅｎｔａｔ２４ｈｏｕｒｓａｎｄ３ｄａｙｓａｆｔｅｒｂａｌｌｏｏｎｉｎｊｕｒｙ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ（Ｐ＜０．０１）．ＴｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＭＭＰ一２Ｗａｓａｌｓｏｒｅｄｕｃｅｄｂｙ４０．Ｏ％ａｔ７ｄａｙｓａｆｔｅｒｉｎｊｕｒｙ（Ｐ＜０．０１）．２．Ｔｈｅｔｈｉｃｋｎｅｓｓｏｆｎｅｏｉｎｔｉｍａｌｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄｂｙ３２．０％ａｎｄ３８．８％（Ｐ＜０．０１）ａｎｄｔｈｅｌｕｍｅｎ小ｅａｗａｓｉｎｃｒｅａｓｅｄｂｙ５８．０％ａｎｄ９０．４％ａｔ１４ａｎｄ２８ｄａｙｓａｆｔｅｒｉｎｊｕｒｙｉｎｔｈｅＤｏｘｙ—ｔｒｅａｔｅｄｒａｔｓｃｏｍｐａｒｅｄｔｏｔｈｏｓｅｉｎｃｏｎｔｒｏｌｒａｔｓ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ（Ｐ＜０．０１）．ＤｏｘｙｔｒｅａｔｍｅｎｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｒｅｄｕｃｅｄｉｎｔｉｍａｌＳＭＣｓｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｆｒｏｍ６２．７６％±１．０２％ｉｎｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｓｔｏ４３．２３％±１．０６％ａｔ７ｄａｙｓａｆｔｅｒｉｎｊｕｒｙ（Ｐ＜０．０１）．ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ：Ｄｏｘｙｔｒｅａｔｍｅｎｔ咖ｈｉｂｉｔｓｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＭＭＰｓ，ｔｈｅＳＭＣｓｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆｉｎｔｉｍａｌ，ｎｅｏｉｎｔｉｍａｌｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａａｎｄｖａｓｃｕｌａｒｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ，ｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇｔｈａｔＤｏｘｙｔｒｅａｔｍｅｎｔｉｓｕｓｅｆｕｌｉｎｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇｒｅｓｔｅｎｏｓｉｓａｆｔｅｒＰＴＣＡ．［ＫＥＹＷＯＲＤＳ］Ａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙ，ｂａｌｌｏｏｎ；Ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ；ＭａｔｒｉｘｍｅｔａＵｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ；Ｍｕｓｃｌｅ，ｓｍｏｏｔｈ，ｖａｓｃｕｌａｒ；Ｖａｓｃｕ－ｌａｒｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ经皮腔内冠状动脉成形术（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓｔｒａｎｓｌｕ－ｍｉｎａｌｃｏｒｏｎａｒｙａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙ，ＰＴＣＡ）后再狭窄（ｒｅｓｔｅｎｏ—ｓｉｓ，ＲＳ）的防治是血管介入学领域内的热点课题。
蛋白酶活性的测定方法
精品文档蛋白酶活性的测定方法（GB/T23527-2009）1 原理蛋白酶对酪蛋白、乳清蛋白、谷物蛋白等都有很好的水解作用。
磷钨酸和磷钼酸混合试剂，即福林 - 酚试剂，碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原而呈蓝色反应（钨兰和钨兰混合物）。
由于蛋白质中含有具有酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），因此，蛋白质及其水解产物也呈此反应。
利用蛋白酶分解酪素（底物）生成含酚基氨基酸的呈色反应，来间接测定蛋白酶的活力。
2 仪器和设备2.1 分析天平：精度 0.0001g2.2 恒温水浴：精度土 0.2 C2.3 计时表2.4 分光光度计2.5 沸水浴器2.6 振荡混合器2.7 pH计：精度0.01pH单位3 试剂和溶液3.1 乳酸缓冲液（pH=3.0）适用于酸性蛋白酶甲液：称取乳酸（ 80%-90%）1 0 .6g, 加水溶解并定容至 1000ml。
乙液：称取乳酸钠（70% 16g,加水溶解并定容至1000ml.使用溶液：取甲液 8ml, 加乙液 1ml, 摇匀，稀释一倍，即成 0.05mol/L 乳酸缓冲溶液。
3.2 磷酸缓冲液的制备（pH=7.5）适用于中性蛋白酶准确称取磷酸氢二钠（ Na2HPO3.12H2O）6.02 和磷酸二氢钠（ NaH2PO3.2H2O） 0.5g, 加水定容至1000ml3.3 硼酸缓冲液（pH=10.5）适用于碱性蛋白酶甲液：称取硼酸钠19.08g, 加水溶解并定容至 1000ml。
乙液：称取氢氧化钠 4.0g, 加水溶解并定容至 1000ml. 使用溶液：取甲液500ml, 加乙液 400ml, 摇匀，用水稀释至 1L。
3.4 0.4mol/L 碳酸钠溶液：准确称取无水碳酸钠 42.4g, 以蒸馏水溶解定溶至 1000ml.3.5 0.4mol/L 的三氯醋酸液：准确称取 65.4 三氯醋酸, 以蒸馏水溶解定溶至 1000ml3.6 0.5mol/L 的 NaOH：准确称取2g NaOH溶解并定至100ml3.7 10.00mg/ml 酪素溶液称取酪素 1.000g, 准确至 0.001g, 用少量的 0.5mol/L 的氢氧化钠溶液（若为酸性蛋白酶则用浓乳酸 2-3 滴）润湿,, 加入适量的各适宜的缓冲液约80ml,在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转入100ml容量瓶中 , 用适宜的缓冲液稀释至刻度 , 此溶液在冰箱内贮存 , 有效期为三天 .3.8 100卩g/ml酪氨酸标准溶液3.8.1准确称取预先于105C干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g ,用1mol/L 的盐酸 60ml 溶解后定容至 100ml, 即为 1.00mg/ml 的酪氨酸溶液 .精品文档3.8.2 吸取 1.00mg/ml 酪氨酸标准溶液 10.00ml, 用 0.1mol/L 盐酸定容至100ml,即得100.0卩g/ml L-酪氨酸标准溶液.3.9 酶样的制备准确称取 1.000g 固体酶或移取 1ml 液体酶样，用少量的适宜缓冲液溶解并用玻璃棒捣研 , 然后将上清液倒入 100ml 容量瓶, 沉渣中再添入少量缓冲液捣研多次 , 最后全部移入容量瓶 , 稀释到刻度 , 用四层纱布过滤。
基础学习实验4-酶谱法检测血清基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9的活性
NGAL的三级结构
由N 端的310螺旋、C 端的α螺旋和中间的和中间的八段反平行的β折叠所构成，这
八段反平行式β折叠构成了一个β折叠桶结构。
此β折叠桶结构一端是开放的，为与配体结合提供了进口；而另一端则被短的N 端 310螺旋所封闭。在β折叠桶底部内侧排列着疏水的芳香族和脂肪族氨基酸残基， 形成了一个疏水核或疏水内部，为结合亲脂性配体提供了位点。
实验设计
1. 查阅相关资料，讨论MMP-2与MMP-9在食管癌各发展阶段的活性检 测能否作为监控癌症发展的一个指标，应该注意什么问题，其临床意 义如何？ 2. 若发现MMP-2与MMP-9在癌症病人中出现异常，谈谈你可能采取的
含有2个锌离子和5个钙离子
右图可见一个小分子化合物位于酶活性中心，并与一个锌离子结合
NGAL能与MMP-9以二硫键的方式结合，能起到保护和调节MMP-9功能的作用，所以NGAL
与肿瘤的侵袭移动有密切的联系。
汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室李恩民教授课题组以转染有pcDNA3 空白质粒 载体的SHEEC 细胞为对照，酶谱法检测结果表明，转染有pcDNA-NGAL (-) 的SHEEC 细胞 分泌的MMP-9 和MMP-2的活性均明显降低；而与此同时，转染有pcDNA-NGAL (＋) 的 SHEEC 细胞分泌的MMP-9 和MMP-2的活性均明显升高。表明通过有义、反义技术使NGAL 基因表达发生改变可以对SHEEC 细胞分泌的MMP-9 和MMP-2 的活性产生明显影响。
（2）明胶酶，包括MMP-2和MMP-9,其作用底物主要是Ⅳ型胶原和明胶，还可降解Ⅶ、
Ⅸ、Ⅹ型胶原,但不能降解间质胶原； （3）间充质溶解素，包括MMP-3、MMP-7、MMP-10和MMP-11，其作用底物主要是
基质金属蛋白酶活性测定进展
酶 联 免疫 法 （ Ｌ Ｓ 可 以 定 量 测 定 血 清 、 浆 、 液 、 胞 Ｅ ＩＡ） 血 唾 细 培 养 物 上 清 或其 他 相 关 液 体 中 Ｍ ＭＰ ２和 ＭＭＰ ９含 量 ， － 目前 已开发 出 了基 于 此 原 理 的 试 剂 盒 ， 类 试 剂 盒应 用 双 抗 体 夹 心 此
ห้องสมุดไป่ตู้
解， 它们 分 别 是 ： 氨 酸 蛋 白酶 、 胱 氨 酸 蛋 白 酶 、 冬 氨 酸 蛋 丝 半 天 白酶 和 ＭＭＰ 。ＭＭＰ 是 其 中 最 重 要 和最 复 杂 的 一 类 ， 被 ｓ ｓ 并 认 为 在 肿 瘤 的 发展 过 程 中具 有 核 心 作 用 。 ＭＭＰ 在 肿 瘤 发 展 ｓ 中起 关 键 性 作 用 ， 涉 及 血 液疾 病 、 瘤 的进 展 、 它 肿 自身 免 疫 疾 病 ｌ 、 管 生 成 、 瘤 侵 袭 和 转 移 、 局 部 缺 血 。尤 其 是 ３血 ］ 肿 脑 ］
被 微 孔 板 ， 成 固 相 抗 体 ， 包 被 单 抗 的 微 孔 中 依 次 加 入 制 往
ＭＭＰ９抗 原 、 物 素 化 的 抗 兔 ＭＭＰ ９抗 体 、 Ｐ标 记 的 亲 － ・ 生 一 ＨＲ
和 素 ， 过 彻底 洗涤 后 用 底 物 ３ ３， ， 四 甲基联 苯 胺 （ 经 ， ５５ ＴＭＢ ）
在 肿 瘤转 移 过 程 中发 挥 了 重要 作 用 。 在生 物 体 内 ＭＭＰ 的 检 ｓ
测 以 及 ＭＭＰ 抑 制 剂 的 活性 评 价 ， 需 要 可 靠 的 ＭＭＰ 酶 活 ｓ 都 ｓ
算样品浓度 。
高效 液 相 色 谱 法 ［ ］ １ ４
基质金属蛋白酶(MMP)明胶酶谱法电泳分析试剂盒产品说明书
基质金属蛋白酶（MMP）明胶酶谱法电泳分析试剂盒产品说明书（中文版）主要用途基质金属蛋白酶（MMP）明胶酶谱法（gelatin-zymography）电泳分析试剂是一种旨在通过明胶聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法，在分离、蛋白复性、底物水解、染色等一系列步骤下，观察并半定量深蓝色背景中的无色清晰的基质金属蛋白酶条带，根据分子量确定特异基质金属蛋白酶及其活性的权威而经典的技术方法。
该技术经过精心研制、成功实验证明的。
其适用于各种细胞萃取样品（动物、人体、植物、昆虫等）、培养上清悬液、血清和关节滑液或脑脊液等基质金属蛋白酶-2，9，以及13等活性及其抑制剂的检测。
产品即到即用，性能稳定，操作便捷，敏感度高，条带清晰，重复性好。
技术背景基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases；MMPs）是一类结构高度同源的分泌型或膜相关性锌内肽酶的总称，因含有金属（锌、钙）离子而得名。
其功能在于分解细胞外基质成分。
迄今为止发现的MMPs至少有28种，几乎能降解除多糖以外的全部细胞外基质（extracellular matrix）成分，同时参与胚胎发育、形态形成、胚泡植入（blastocyst）、血管形成、组织再吸收（tissue resorption）、疾病发生，例如关节炎、癌细胞浸入转移等。
根据降解的底物不同可将MMPs分为4大类：（1）胶原酶：MMP1、MMP8、MMP13主要消化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅶ、Ⅹ型胶原和蛋白多糖；（2）明胶酶（Ⅳ型胶原酶）：MMP2、MMP9，又称明胶酶A、B，主要消化Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型胶原和弹性纤维；（3）基质溶解素：MMP3、MMP7、MMP16、MMP11，主要作用于纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、弹力纤维、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ胶原及MMP1、MMP8、MMP9；（4）膜型金属蛋白酶：MT1-MMP、MT2-MMP、MT3-MMP，主要作用于明胶、Ⅳ型胶原、MMP2。
体内绝大多数细胞并不储备MMPs，当需要MMPs的信号传递到细胞后才临时合成，合成的MMPs以无活性的酶原（proenzyme）形式分泌到细胞外，随后被多种蛋白酶和非蛋白酶水解以及热处理激活，一种激活的MMPs可激活另一种MMPs，形成瀑布效应。
晚期转移性乳腺癌血浆MMP-2、MMP-9检测与化疗疗效相关性研究
【 ｓ ｒ ｃ 】Ｏｂ ｅ ｔｖ ｏｅａｕ ｔ ｔｅｂｏｃｉｉ ｆ ｌｓ ｔ Ａｂ ｔａ ｔ ｊ ｃ ｉｅ Ｔ ｖｌａｅ ｈ ｉａｔ ｔ ｏ ａｍａｉ ＭＭＰ ａ ｄｔｅｒ ｅｅ ａ ｃ ｉ ｈ ｍｏｈ ｒｐ ｕｉ ｅ ｉ ｃ ｖｙ ｐ ｃ ｓｎ ｉ ｒｌ ｎ ｅｗ ｔ ｃ ｅ ｔｅａ ｅ ｔ ｆｃ ｙ ｈ ｖ ｈ ｃ ａ
【 关键词 ］ 晚期乳腺癌 ； ７ ７９ 【 文献标识码 】 Ａ 【 文章编号 】０ ５ ０ １ ２ １ Ｏ — ５ ０ ２ ９ — ６ ６（ ０ ２） １ １ — ３
Ｃ０ｒ ｅｌ ｉ ｒ ａｔ ｏｎａｌ ｓ ｕｄｙ ｔ ｏｎ ａｄｖａｎｃ ｅｄ ｅｔ ｔ ｉ ｅａｓ ａｎｃ ａｓ ａ ｍ ａｓ ａｔ ｃ ｂｒ ｔｃ ｅｒ ｐｌ ｍ
２１ １第卷 １ ０ 年月 ２第期 ２
・ 论
著 ・
晚期转移性乳腺癌血浆ＭＭＰ ２ － 、ＭＭＰ ９ 一
检 测 与化疗疗 效相关性研究
陈 蕾 许 丽艳
１汕头大学医学 院附属肿瘤医院， ． 广东汕头 ５ ５ ３ ； ． １０ １ ２ 汕头大学 医学院肿瘤病理研究室 ， 广东汕头 ５５ ３ １０ １ 【 摘要 】目的 探讨 血浆基质金 属蛋 白酶 活性与晚期转移性 乳腺癌化 疗疗效 的相关 性 。方 法 选 择经病理或 细胞学确诊 的 晚期转移 性乳腺癌 患者 ， 分别 于化疗前 后收集患者血浆 （ ． ｍＬ空腹 全血加 ０２ ｍＬ枸 橼酸钠 ）离心后放置 于 一 ０ １８ ．％ ， ７ ℃冰 箱冻存 备查 。用酶谱 法测定肿 瘤患 者血浆 ＭＭＰ ２及 ＭＭＰ ９的活性 ， 一 一 用凝 胶 图象处理 系统分析 ； 白色条带 的净 光密 以 度值 相 对 定量 样 品 中酶 的活性 。 结 果 ＭＭＰ ２ ＭＭＰ ９在 晚 期乳 腺 癌治 疗 前 后 的活 性水 平 测定 具 有统 计 学 意义 。 一、 一 （ ＜ ００ 结 论 晚期 乳腺癌患者 血浆 ＭＭＰ ２ ＭＭＰ ９活性与病情进展 和疗效有一定相关性 ， Ｐ ．５ ｏ 一、 一 而检测方法简单经 济 ， 具有一定 的临床指导价值 。
酶活测定方法
酶活测定方法还原法酶与底物在特定的条件下反应,酶可以促使底物释放出还原性的基团。
在此反应体系中添加化学试剂,酶促反应的产物可与该化学试剂发生反应,生成有色物质。
通过在特定的波长下比色,即可求出还原产物的含量,从而计算出酶活力的大小。
色原底物法通过底物与特定的可溶性生色基团物质结合,合成人工底物。
该底物与酶发生反应后,生色基团可被释放出来,用分光光度法即可测定颜色的深浅,在与已知标准酶所做的曲线比较后,即可求出待测酶的活力。
粘度法该法常用于测定纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶的活力。
木聚糖和β-葡聚糖溶液通常情况下可形成极高的粘度,当酶作用于粘性底物时木聚糖和β-葡聚糖会被切割成较小的分子使其粘度大为降低。
基于Poiseuille定律我们知道,只要测定一定条件下溶剂和样品溶液的运动粘度,便可计算特性粘数,并以此来判断酶的活力。
高压液相色谱法酶与其底物在特定的条件下充分反应后,在一定的色谱条件下从反应体系中提取溶液进行色谱分析,认真记录保留时间和色谱图,测量各个样的峰高和半峰高,计算出酶促反应生成物的含量,从而换算出酶活力的数值。
免疫学方法常用于酶活性分析的免疫学方法包括:免疫电泳法、免疫凝胶扩散法。
这两种方法都是根据酶与其抗体之间可发生特定的沉淀反应,通过待测酶和标准酶的比较,最终确定酶活力。
免疫学方法检侧度非常灵敏,可检侧出经过极度稀释后样品中的酶蛋白,但其缺点是不同厂家生产的酶产品需要有不同特定的抗体发生反应。
琼脂凝胶扩散法将酶作用的底物与琼脂混合熔融后,倒入培养皿中或载波片上制成琼脂平板。
用打孔器在琼脂平面上打出一个约4-5mm半径的小孔。
在点加酶样并培养24h以后,用染色剂显色或用展开剂展开显出水解区,利用水解直径和酶活力关系测定酶活力。
蛋白酶活力的测定随着生物技术的发展及环保要求的提高，越来越多的酶制剂应用于制革生产中。
比如浸水，脱毛，软化，脱脂等工序都用到大量的酶制剂，从酶的作用性质来看制革生产中用到的主要是蛋白酶和脂肪酶。
酶谱法检测血清基质金属蛋白酶MMP生物化学与分子生物学
酶谱法检测血清基质金属蛋白酶MMP生物化学与分子生物学引言酶谱法是一种常用的方法，用于测定血清基质金属蛋白酶（Matrix Metalloproteinase，简称MMP）的活性。
MMP是一类重要的蛋白酶，参与多种生理和病理过程，包括组织再生、肿瘤转移等。
本文将介绍血清基质金属蛋白酶MMP的生物化学特性以及酶谱法的原理和操作步骤。
血清基质金属蛋白酶MMP的生物化学特性血清基质金属蛋白酶（MMP）是一类富含锌离子的蛋白酶，在生物体内起到调节基质降解的重要作用。
MMP主要由细胞外基质成分和细胞表面的蛋白酶组成，包括胶原酶、明胶酶等。
这些酶在正常生理过程中，如组织再生和修复中，起到调节细胞迁移、基质降解的作用。
然而，在许多疾病的进展中，MMP的活性过高或过低都可能导致病理性结果，如肿瘤的转移和心肌梗塞。
MMP的活性可以通过多种方法进行检测，其中酶谱法是一种常用且灵敏的方法之一。
酶谱法检测血清基质金属蛋白酶MMP的原理酶谱法是一种使用荧光信号来测定酶活性的方法。
在血清基质金属蛋白酶MMP的检测中，常使用一种荧光基质作为底物，这种底物在未被酶降解时会发出弱的荧光信号，但在被酶降解时会发出明显的荧光信号。
利用这种差别，可以通过测量荧光信号的强度来反映MMP的活性。
酶谱法的操作步骤包括以下几个方面：1.实验前准备：清洗试管和工具，准备所需试剂和样品。
2.底物制备：制备稀释的荧光底物，使其浓度适用于实验。
3.样品处理：将待测的血清样品加入试管中，同时添加荧光底物。
4.反应混合：轻轻摇动试管，使样品和底物充分混合，然后放置在恒温器中反应一段时间。
5.测量荧光信号：使用荧光检测仪器来测量样品中荧光信号的强度。
6.数据分析：根据荧光信号的变化来计算MMP的活性，并进行数据统计和分析。
酶谱法是一种常用的方法，用于检测血清基质金属蛋白酶MMP的活性。
通过测量荧光信号的强度，可以间接反映MMP的活性水平。
酶谱法具有操作简单、结果可靠、灵敏度高等优点，在生物化学和分子生物学研究中得到了广泛应用。
普利莱基因 MMP-2,9检测试剂盒说明书
胶原蛋白酶2,9检测试剂盒(MMP Zymography assay kit) P1700描述：基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)以无活性的酶原形式分泌，活化后能降解细胞外基质的胶原蛋白，又称胶原酶。
胶原酶通过影响细胞外基质参与胚胎发育、形态发生、组织重塑等过程，并参与炎症、肿瘤、心血管、神经等许多疾病过程。
血浆和组织中的MMP-2、MMP-9参与各种生理与病理过程，其在临床诊断和治疗中的意义日益受到重视1。
本试剂盒采用酶谱法(zymography)检测MMP-2、MMP-9活性。
Zymography是一种广为使用的、基于SDS-PAGE电泳和反相凝胶染色的蛋白酶检测方法，其灵敏度可达1 nM，高于ELISA方法2，其基本原理和程序是：制备加有胶原酶底物的SDS-PAGE凝胶，含蛋白酶的样品在此凝胶中进行电泳，电泳结束后取出凝胶与酶反应Buffer孵育，凝胶染色与脱色。
凝胶中由于含底物蛋白而被深染，形成深色背景，但在有蛋白酶条带的位置，蛋白酶降解凝胶中的底物蛋白，因而不被染色而形成透亮区域，从而能同时指示MMP-2、MMP-9的大小位置(酶谱)及活性。
本试剂盒提供MMP-2、MMP-9特异蛋白底物及酶学反应缓冲液，可检测少至0.1~0.5 µl血液中的MMP-2、MMP-9酶谱及活性，检测灵敏度约为1 nM。
试剂盒可进行50次标准小胶检测，如果小胶加样孔为10~15个，则总计可检测500~750个样品。
参考文献：1.Nagase H and Woessner JF. Matrix Metalloproteinases. J Biol Chem, 1999, 274, 21491-214942.Heussen C, and Dowdle EB. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodiumdodecyl sulfate and copolymerized substrates. Anal. Biochem，1980, 102, 196–202适用: 检测MMP-2、MMP-9酶谱及活性组成与储存(50 assays)：12个月有效1. 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer 1.5 ml , −20 ºC 储存2. 10 × Substrate G 50 ml −20 ºC 储存3. 10 × Buffer A 50 ml 4 ºC 储存使用时用蒸馏水稀释4. 10 × Buffer B 50 ml 4 ºC 储存使用时用蒸馏水稀释5. SDS-PAGE凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液(货号P1501) 4 ºC储存操作步骤：1.制备含MMP底物蛋白的SDS-PAGE凝胶：推荐分离胶浓度为8%。
基质金属蛋白酶9实验室检查
基质金属蛋白酶9实验室检查1.引言1.1 概述概述部分的内容可以介绍基质金属蛋白酶9（Matrix Metalloproteinase 9，简称MMP-9）的背景和重要性。
以下是概述部分的一种可能的写法：基质金属蛋白酶9，作为一种重要的分泌性酶，在生物体的生理和病理进程中扮演着重要角色。
它属于金属蛋白酶家族(MMPs)，在细胞外基质降解、细胞迁移和组织修复过程中发挥着关键功能。
MMP-9在多种生物学过程中发挥着积极的调节作用，包括胚胎发育、组织修复、免疫应答和癌症转移等。
MMP-9的异常活性与多种疾病的发病机制相关，如慢性炎症、创伤、致病菌感染以及肿瘤和心血管疾病等。
其过量活化与细胞外基质降解失衡、炎症反应增强、肿瘤细胞侵袭和转移等密切相关。
因此，对MMP-9的精确、敏感的检测方法的开发对于研究其生物学作用以及相关疾病的诊断和治疗具有重要意义。
本文旨在探讨基质金属蛋白酶9的检测方法，并就其在实验室检查中的应用前景进行讨论。
通过这一文献综述，我们希望能够全面了解基质金属蛋白酶9的生物学功能、检测方法以及其在临床实践中的潜在价值，为今后的研究和临床应用提供有益的参考。
1.2 文章结构本文将以以下几个部分展开对基质金属蛋白酶9实验室检查的介绍和探讨。
首先，在引言部分将对整篇文章的背景和目的进行概述，为读者提供一个整体的认识。
接下来，在正文部分，我们将着重探讨基质金属蛋白酶9的作用和它的检测方法。
具体来说，2.1节将深入讨论基质金属蛋白酶9的作用机制以及在生物体内的重要功能。
2.2节将详细介绍目前常用的基质金属蛋白酶9检测方法，包括实验室常用的技术和仪器设备等。
最后，在结论部分，我们将强调实验室检查的重要性，并展望基质金属蛋白酶9实验室检查的未来应用前景。
通过以上章节的安排，本文将全面介绍基质金属蛋白酶9实验室检查的相关知识，使读者对其有一个全面深入的了解。
同时，通过细致的文字叙述和详细的信息呈现，有助于读者更好地理解和运用基质金属蛋白酶9实验室检查的相关内容。
酪蛋白酶谱MMP检测实验
酪蛋白酶谱MMP（3/10）检测实验实验技术服务方法：基质金属蛋白酶（MMP）酪蛋白酶谱法（casein-zymography）电泳分析试剂是一种旨在通过酪蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法，在分离、蛋白复性、底物水解、染色等一系列步骤下，观察并半定量深蓝色背景中的白色清晰的基质金属蛋白酶条带，根据分子量确定特异基质金属蛋白酶及其活性的权威而经典的技术方法。
该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。
其适用于各种细胞裂解萃取样品（动物、人体、植物、昆虫等）、培养上清悬液、血清和关节滑液或脑脊液等基质金属蛋白酶－1，3，7 以及12等活性及其抑制剂的检测。
【晶莱生物】实验技术背景：基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases；MMPs）是一类结构高度同源的分泌型或膜相关性锌内肽酶的总称，因含有金属（锌、钙）离子而得名。
迄今为止发现的MMPs 至少有28 种，几乎能降解除多糖以外的全部细胞外基质（extracellular matrix）成分，同时参与胚胎发育、形态形成、胚泡植入（blastocyst）、血管形成、组织再吸收（tissue resorption）、疾病发生，例如关节炎、癌细胞浸入转移等。
根据降解的底物不同可将MMPs 分为4 大类：（1）胶原酶：MMP1、MMP8、MMP13 主要消化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅶ、Ⅹ型胶原和蛋白多糖；（2）明胶酶（Ⅳ型胶原酶）：MMP2、MMP9，又称明胶酶A、B，主要消化Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型胶原和弹性纤维；（3）基质溶解素：MMP3、MMP7、MMP16、MMP11，主要作用于纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、弹力纤维、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ胶原及MMP1、MMP8、MMP9；（4）膜型金属蛋白酶：MT1-MMP、MT2-MMP、MT3-MMP，主要作用于明胶、Ⅳ型胶原、MMP2。
体内绝大多数细胞并不储备MMPs，当需要MMPs 的信号传递到细胞后才临时合成，合成的MMPs 以无活性的酶原（proenzyme）形式分泌到细胞外，随后被多种蛋白酶和非蛋白酶水解以及热处理激活，一种激活的MMPs 可激活另一种MMPs，形成瀑布效应。
酶活力测定方法
NH
NH-CO-
H2N-C-NHCH2CH2CH2-CH-COOC2H5
253nm处的A随酶促反应递增， 根据酶活力单位定义计算酶活力。
酶活性单位：在最适的条件下，每分钟能 转化一个微摩尔底物的酶量定为一个活性 单位。 测定： 空白：底物溶液 + 0.001mol/L HCl
2。ＨＰＬＣ系统测试
ＨＰＬＣ系统测试标准物质进样后呈3个峰,12 次 重 复 进 样 3 个 峰 保 留 时 间 的 Ｒ Ｓ Ｄ 分 别 为 0. 4%,0 .6% 和 0. 8%, 峰 面 积 的 Ｒ Ｓ Ｄ 分 别 为 0 .7%,0 .8%和0 .8%。ｒｈＩＬ 11对照品 37℃酶切20ｈ后于4℃温控自动进样器连续进 样5次,结果见图1。5个色谱图完全重叠在一起, 所产生21个峰的保留时间、峰高和峰面积的Ｒ ＳＤ均分别小于1 .0%,5 .4%和9. 8%,表明本系 统误差小,重复性好,可用于ｒｈＩＬ11的肽图分 析。
3批ｒｈＩＬ 11制品的ＲＰ ＨＰＬＣ图谱 完全一致,说明该厂ｒｈＩＬ 11的生产工艺是稳 定的;与ＧＩ公司生产的ｒｈＩＬ 11对照品比较 有20个峰与对照品一致,但第6 峰的峰高和峰面 积均明显较小,且在第9和第10 峰之间多一个峰, 说明该厂ｒｈＩＬ 11蛋白质结构与ＧＩ公司生 产的ｒｈＩＬ 11比较存在细小差别。
A1 - A2
0.003 : 1 =
:X
T
A1 - A2 0.003T
每mg供试品中含胰蛋白酶单位数为
A1 - A2
0.003TW
A1—A 2 P=
0.003 T W
重组人白细胞介素 11的胰蛋白酶切肽 图分析
基质金属蛋白酶9(MMP—9)的研究及临床应用进展
基质金属蛋白酶9（MMP—9）的研究及临床应用进展基质金属蛋白酶9（MMP-9）属于基质金属蛋白酶超家族成员中明胶酶的一种，又称明胶酶B，因其作用底物广泛，表达细胞众多参与多种疾病及恶性肿瘤的侵袭和转移而备受重视，成为最近国际国内研究的焦点之一。
因此，深入了解MMP-9及其与疾病的关系有助于疾病的及时发现、诊断和治疗。
本文就其生物学特点、检测技术及临床应用进行了综述。
标签：基质金属蛋白酶9；检测技术；临床应用基质金属蛋白酶（MMPs）是一类活性依赖于锌离子和钙离子的蛋白水解酶，其主要的生理作用是降解细胞外基质。
现已发现26种MMPs（MMP-1～26），称为MMP家族，MMPs几乎能降解细胞外基质的所有成分，如胶原、明胶、黏性蛋白、纤维黏连蛋白、蛋白多糖等，参与人体许多生理和病理过程[1]。
在MMPs 中MMP-9，属于基质金属蛋白酶超家族成员中明胶酶的一种，是人体内最重要的蛋白酶之一。
1 MMP-9的生物学特点[2-3]1.1概述MMP-9是MMPs家族成员之一，是Reponen和Sahlbergl994年在小鼠胚胎发育中的破骨细胞内发现的。
分子量Mr92×103，根据作用底物又名明胶酶B，依据发现的先后顺序MMP-9又名基质金属蛋白酶9，主要作用是保持酶的稳定性。
MMP-9前体可由单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、血管平滑肌细胞、内皮细胞、泡沫细胞、成纤维细胞、小胶质细胞及肿瘤细胞等分泌，在87位氨基酸残基或附近被酶解激活，参与炎性反应、组织构形、创伤修复、基质结合的生长因子的动员及细胞因子的表达。
1.2 MMP-9的基因结构和功能人MMP-9基因全长26000bp，位于20q11.2～q13.1，含有13个外显子和12个内含子，编码相对分子质量为92×103的蛋白。
MMP-9的启动子区位点，人的MMP-9启动子区还有核因子κB、表达序列标签结合位点和转化生长因子β控制元件。
晚期转移性乳腺癌血浆MMP-2、MMP-9检测与化疗疗效相关性研究
晚期转移性乳腺癌血浆MMP-2、MMP-9检测与化疗疗效相关性研究目的探讨血浆基质金属蛋白酶活性与晚期转移性乳腺癌化疗疗效的相关性。
方法选择经病理或细胞学确诊的晚期转移性乳腺癌患者，分别于化疗前后收集患者血浆（1.8 mL空腹全血加0.2% mL枸橼酸钠），离心后放置于-70℃冰箱冻存备查。
用酶谱法测定肿瘤患者血浆MMP-2及MMP-9的活性，用凝胶图象处理系统分析；以白色条带的净光密度值相对定量样品中酶的活性。
结果MMP-2、MMP-9在晚期乳腺癌治疗前后的活性水平测定具有统计学意义。
（P ＜0.05）。
结论晚期乳腺癌患者血浆MMP-2、MMP-9活性与病情进展和疗效有一定相关性，而检测方法简单经济，具有一定的临床指导价值。
[Abstract] Objective To evaluate the bioactivity of plasmatic MMPsand their relevance with chemotherapeutic efficacy in patients with advanced metastatic breast cancer. Methods Plasma samples of patients with pathological or cytological confirmed advanced metastatic breast cancer were collected before and after chemotherapy.The Zymography method was used to determine the bioactivity of MMP-2 and MMP-9,followed by systemic analysis with gel imaging procedure.The optic density of white band was taken as the corresponding bioactivity of quantitative samples. Results The level of MMP-2,MMP-9 in the activity of advanced breast cancer before and after treatment were statistically significant(P＜0.05). Conclusion The bioactivity of MMP-2 and MMP-9 in plasma in patients with MBC before and after chemotherapy has a certain relationship with disease progression and chemotherapeutic efficacy.The detective method is economic and have clinical guidance value.[Key words] Advanced breast cancer;Matrix metalloproteinases;Chemotherapy多项临床及基础研究表明肿瘤细胞侵袭转移的能力与其诱导产生的基质金属蛋白酶（（matrix metaiioproteinases，MMPs）的能力有关。
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原理
酶谱法的基本过程是先将样品进行SDS-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE，含0.1%明胶）电泳分离，然后在有二价金属离子存在的缓冲系统中使样品中的MMP-2和MMP-9恢复活性，在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶，最后用考马斯亮蓝将凝胶染色，再脱色，在蓝色背景下可出现白色条带，条带的强弱与MMP-2和MMP-9活性成正比。
复性原理：在电泳过程中，SDS与样品中的MMPs结合（当然是可逆性结合），破坏其氢键、疏水键而使MMPs不能发挥其分解明胶的作用，而只有当将胶置Trition中洗脱（最好是放在摇床上摇，30min/次，做2次或15min/次，4次。
静置于Trition中是不妥的。
）时，由于SDS被Trition结合而去除，从而使MMPs恢复了活性。
2试剂的配制
（1）配制10%SDS聚丙烯酰胺凝胶（含1.0mg/ml 明胶，配好后1周内使用，明胶含量低灵敏度高）
A．分离胶的配制（注：根据你所用的电泳仪胶的大小确定配制胶的量）
10% SDS聚丙烯酰胺凝胶10ml（包括）
ddH2O 4.5ml
30%储备胶（0.8%BIS+29.2%丙烯酰胺）2ml
1.5mol/l Tris（PH 8.8）
2.5ml
10% SDS 100ul
10%过硫酸铵（APS）100ul
TEMED 8ul
1%明胶（1g明胶-->100ml，37°C水浴溶解）0.5ml
B.浓缩胶的配制
浓缩胶6ml
ddH2O 4.5ml
30%储备胶0.75ml
1mol/l Tris-HCL( PH 6.8) 0.76ml
10% SDS 60ul
10%过硫酸铵60ul
TEMED 6ul
（3）5×Tris –甘氨酸电极缓冲液
0.125mol/l Tris-HCL，1.25mol/l 甘氨酸，0.5%SDS（PH 8.3）
（4）4 ×上样缓冲液
0.32% Tris-HCL 6.4ml
4%SDS（PH7.2）8ml
16%甘油3.2 ml
溴酚蓝0.024g
ddH2O 2.4ml
(5) 洗脱液:2.5% Triton X-100，50mmol/L Tris-HCl<6.057g/L> ，5mmol/L
CaCl2<0.5549g/L>，pH7. 6 （40分钟两次，中间换液）
（6）漂洗液：50mmol/L Tris-HCl，5mmol/L CaCl2，pH7. 6 （20分钟2次）
（7）孵育液：50mmol/LTris,pH7.5,150mmol/LNaCl,10mmol/LCaCl2,0.02%NaN3（孵育42小时）
（8）染色液：0.05% Coomassic 亮蓝R-250，30%甲醇，10%乙酸（染色3小时）（9）脱色液A、B、C：甲醇浓度分别为30%、20%、10 % ,乙酸浓度分别为10 %、10 %、5% （分别30min、1h、2h脱色）
3实验步骤
1.取对数期的癌细胞在的无血清培养基DMEM中培养24h。
2.次日收集上清液，将上清液移入离心管中2000rpm 离心10min，-70℃储存备用。
3.根据细胞计数调整各组细胞培养上清液中的蛋白浓度（或者测定蛋白浓度调整使所上蛋白总量一致）。
与5×上样缓冲液混合，13ul样本+4ul上样缓冲液。
（不要用枪用力吹打，防止出现过多气泡）
4.配制分离胶和浓缩胶，16ul/孔上样（根据表达强度和蛋白浓度确定上样量），4℃进行SDS-PAGE 电泳100v约1.5小时（电泳时在周围敷上冰，有利于使条带跑直）。
5.电泳结束后,将凝胶置于洗脱液(2.5% Triton X-100，50mmol/L Tris -HCl ，5mmol/L CaCl2，pH7. 6) 中振荡洗脱2次,每次40分钟,然后用漂洗液(除不含Triton X - 100 外其余同洗脱液) 漂洗2次,每次20分钟,接着,将凝胶置于孵育液( 50mmol/L Tris - HCl , 5mmol/ CaCl2 , 0. 02% Brij-35 ,pH7.6) 中37℃孵育42h。
6.孵育结束后经染色液(0.05% Coomassic 亮蓝、30%甲醇、10%乙酸) 染色3h,及脱色液A、B、C(甲醇浓度分别为30%、20%、10 % ,乙酸浓度分别为10 %、10 %、5%) 分别脱色0.5、1、2h后，显示出MMP-2（72KD）和MMP -9（92 KD）为位于蓝色背景上的透亮带，用凝胶图像分析系统分析读取条带面积，宽度和灰度值，做统计分析。
注意事项
1.制备聚丙烯酰胺时应注意排除气泡。
2.明胶酶谱的活性受钙离子，锌离子，和PH值等因素的影响，因此缓冲液配制应严格准确，尽量用超纯水，孵育温度也掌握好。
3.用大梳子
4.孵育液的PH最好在7.5-7.6，复性的TRITON时间长了会有絮状物，所以实验时尽量使用新鲜配置的。
5.孵育的37度不要在CO2培养箱中，因为会改变孵育液的PH值，在普通孵箱即可。
6.明胶要4度保存，配好后1周内使用
凝胶制备
1.玻璃板对齐后放入夹中，垂直卡紧，加满水检漏。
2.配10%分离胶，APS和TEMED作用为促凝，最后灌胶前加。
若板不漏水，则将水倒出，并用吸水纸洗净后灌胶，灌至大约3/4处，上面加满水压平。
3.配浓缩胶，同样地，APS和TEMED最后加，分离胶灌入约30min后观察小烧杯中剩余分离胶是否已凝，同时仔细观察可见玻板水和胶间有一条折线，说明胶已凝固。
4.将上面的水倒去，吸水纸洗净，灌入浓缩胶，灌满，注意一定不要有气泡，然后将梳子插入，注意保持水平，约30min后凝固可用。
5.拔梳子在电泳缓冲液中拔，加样孔用小针筒冲洗干净再上样，注意上样时勿使样品逸至邻孔，样品混匀时要轻，不要产生气泡，否则加样时易导致逸出而使结果不准确。