不同限制性核酸内切酶对质粒DNA的切割

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不同限制性核酸内切酶对质粒DNA的切割

——限制性核酸内切酶EcoRI对pUC19-P35S:ARF8切割

摘要:【目的】为加深对限制性核酸内切酶和质粒DNA的酶切关系的认识,采用限制性核酸内切酶EcoRI对质粒DNA进行切割,从而验证不同限制性核酸内切酶对质粒DNA具有不同的切割结果。【方法】采用限制性内切酶EcoRI对pUC19-P35S:ARF8进行切割,再用0.8%琼脂糖凝胶电泳加以分离,得到电泳图谱,对照分子量标样加以鉴定。【结果】经琼脂糖凝胶电泳后,结果获得两条分子量不同的DNA带。【结论】结果表明,用不同限制性核酸内切酶对质粒DNA 进行切割,可将质粒DNA切割成不同长度的DNA片段。

关键词:限制性内切酶EcoRI 质粒DNA 凝胶电泳酶切图谱

引言:没有限制性核酸内切酶的发现和应用,就没有分子生物学的兴旺发展,在基因工程和分子生物学中,限制性核酸内切酶起着其足轻重的作用。限制性核酸内切酶均来源于原核生物,用于抗击外来DNA的入侵。限制性核酸内切酶,能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA的酶,既是一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶。因此研究限制性核酸内切酶对质粒DNA的切割具有重要的意义。

材料和方法:

1.材料

1.1 重组质粒pUC19-P35S:ARF8由广州大学生命科学学院生化楼分子生物学实

验室构建

1.2 限制性内切酶:EcoRI购自TaKaRa等生物工程公司

1.3 琼脂糖:进口分装

2.设备

2.1 DYY-6C型电泳仪购自北京市六一仪器厂

2.2 0.1-2.5ul、0.5-10ul、5-50ul移液枪购自北京市六一仪器厂

2.3 ECFOII手掌型离心机购自碧云天生物技术研究所

2.4 EDC-810基因扩增仪、微波炉、凝胶成像系统等。

3.试剂

3.1 5 x TBE电泳缓冲液

3.2 6 x 电泳载样缓冲液:0.25%溴酚蓝,40%蔗糖水溶液,贮存于4℃;

3.3 溴化乙锭溶液母液:将EB配臵成10mg/ml,用铝箔或黑纸包裹容器,储

于室温;

3.4 DNA分子量标准:从小到大为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp。4.操作步骤

4.1 DNA酶切反应

4.11 将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管编号,用微量移液枪分别加入DNA 1ug和相应的限制核酸内切酶反应10 x 缓冲液2ul,再加入重蒸水使总体积为19ul,将管内溶液混匀后加入1ul酶液,用手指轻弹管壁使溶液混匀,使溶液

集中在管底。此步操作是整个实验成败的关键,要防止错加,漏加。使

用限制性核酸内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间,以免活性降低。

4.12 混匀反应体系后,将eppendorf管臵于适当的支持物上,37℃水浴保温

2-3小时,使酶切反应完全。

4.13 每管加入2ul 0.1mol/L EDTA(pH8.0),混匀,以停止反应,臵于冰箱中保

存备用。

4.2 琼脂糖凝胶的制备

4.21 取5xTBE缓冲液20ml加水至200ml,配臵成0.5xTBE稀释缓冲液,待用。

4.22 胶液的制备:称取0.6-0.7g琼脂糖,臵于200ml锥形瓶中,加入80ml

0.5xTBE稀释缓冲液,放入微波炉里加热至琼脂糖全部融化,取出摇匀,

此为-0.8%琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜,以减少水分蒸发。

4.23 胶板的制备:将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏紧密封住。将封好的胶

槽臵于水平支持物上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙,将冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入EB溶液时期终浓度为0.5ug/ml。用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡皮膏内侧,待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内,使胶液形成均匀的胶层。倒胶时的温度不可太低,否则凝固不均匀,速度也不可太快,否则容易出现气泡。待胶完全凝固后拔出梳子,注意不要损伤梳底部的凝胶,然后向槽内加入0.5xTBE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。因边缘效应样品槽附近会有一些隆起,阻碍缓冲液进入样品槽中,所以要注意保证样品槽中应注满缓冲液。

4.24 加样:取10ul酶解液与2ul 6x载样液混匀,用微量移液枪小心加入样品

槽中。上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。

4.25 电泳:加完样后,合上电泳槽盖,立即接通电源。控制电压保持在60-80V,

电流在40mA以上,电泳30分钟。

4.26 观察和拍照:在波长为254nm的长波长紫外灯下观察已加有EB的电泳

胶板,DNA存在处显示出肉眼可变的荧光条带。

结果和分析:

如图1所示,用限制性核酸内切酶EcoRI对重组质粒pUC19-P35S:ARF8进行切割,经琼脂糖凝胶电泳后,获得了两条不同的条带图谱,对照DNA Maker 的分子量,可知这两个条带图谱的分子量均大于2000bp,其中有一个条带图谱的分子量约为2703bp。

图1 限制性核酸内切酶EcoRI与重组质粒pUC19-P35S:ARF8的酶切电泳图谱(栏0:DNA Maker ; 栏2:本实验的酶切图谱)

根据限制性核酸内切酶EcoRI的特性可知,限制性核酸内切酶EcoRI属于第II类限制性内切酶,可以切割某一特异的核苷酸序列,是重组DNA的基础。本实验中限制性核酸内切酶EcoRI在重组质粒pUC19-P35S:ARF8上有6个识别位点,即可以识别六个核苷酸序列:5’-G?AATTC-3’,完全酶切时可把重组

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