(完整版)稀释平板计数法
(完整版)稀释平板计数法
实验十一稀释平板计数法实验目的学习稀释平板菌落计数的基本原理和方法。
实验内容用稀释平板菌落计数法对菌悬液进行计数。
实验原理平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。
统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。
但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可能来自样品中的2—3或更多个细胞。
因此平板菌落计数的结果往往偏低。
为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位(cfu)而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。
平板菌落计数法虽然操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是，由于该计数方法的最大优点是可以获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验（如活菌制剂），以及食品、饮料和水〔包括水源水〕等的含菌指数或污染程度的检测。
实验器材酿酒酵母菌悬液马铃薯培养基1m1吸管，平皿，试管，试管架，恒温培养箱等。
实验步骤1．无菌器材的准备(1) 无菌培养皿：取培养皿9套，包扎、灭菌。
(2) 无菌移液管的准备：取1m1移液管，在后部管口处用铁丝塞入棉花少许（长约1~1.5cm ），以防将菌液吸出，同时也可避免将外面的微生物吹入。
棉花要塞得松紧适宜吹时能通气但不使棉花滑下为准。
然后将移液管尖端放在4~5cm宽的长纸条一端呈45º角折叠纸条包住尖端，用左手捏住管身，右手将吸管压紧，在桌面上向前滚动，以螺旋式包扎起来，上端剩余纸条折叠打结后干热灭菌。
(3) 无菌水：取6支试管，分别装入4.5m1蒸馏水，加棉塞，灭菌。
2．样品稀释液的制备(1) 编号取无菌平皿9套，分别用记号笔标明10-4、10-5、10-6(稀释度)各3套。
另取6支盛有4.5m1无菌水的试管，依次标是10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。
平板计数法
稀释平板计数法实验目的学习稀释平板菌落计数的基本原理和方法。
实验内容用稀释平板菌落计数法对菌悬液进行计数。
实验原理平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。
统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。
但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可能来自样品中的2—3或更多个细胞。
因此平板菌落计数的结果往往偏低。
为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位(cfu)而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。
平板菌落计数法虽然操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是，由于该计数方法的最大优点是可以获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验（如活菌制剂），以及食品、饮料和水〔包括水源水〕等的含菌指数或污染程度的检测。
实验器材酿酒酵母菌悬液马铃薯培养基1m1吸管，平皿，试管，试管架，恒温培养箱等。
实验步骤1．无菌器材的准备(1) 无菌培养皿：取培养皿9套，包扎、灭菌。
(2) 无菌移液管的准备：取1m1移液管，在后部管口处用铁丝塞入棉花少许（长约1~1.5cm ），以防将菌液吸出，同时也可避免将外面的微生物吹入。
棉花要塞得松紧适宜吹时能通气但不使棉花滑下为准。
然后将移液管尖端放在4~5cm宽的长纸条一端呈45o角折叠纸条包住尖端，用左手捏住管身，右手将吸管压紧，在桌面上向前滚动，以螺旋式包扎起来，上端剩余纸条折叠打结后干热灭菌。
(3) 无菌水：取6支试管，分别装入4.5m1蒸馏水，加棉塞，灭菌。
2．样品稀释液的制备(1) 编号取无菌平皿9套，分别用记号笔标明10-4、10-5、10-6(稀释度)各3套。
另取6支盛有4.5m1无菌水的试管，依次标是10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。
稀释涂布平板法实验报告
稀释涂布平板法实验报告引言稀释涂布平板法是一种常用于测定微生物数量的实验方法。
本实验旨在通过稀释涂布平板法来确定某种微生物在给定条件下的数量。
实验过程包括：制备不同浓度的稀释液、使用稀释液对微生物进行稀释、涂布于平板培养基上、培养并计算菌落数量和总菌落单位。
本报告将对实验步骤、结果和结论进行详细阐述。
实验步骤制备稀释液1.准备一定量的生理盐水。
2.准备10个离心管，分别标注为10-1至10-10。
3.取10 mL生理盐水，加入第一个离心管，记为10^-1浓度。
4.从10^-1浓度管中取1 mL，加入10^-2浓度管中，如此类推，依次进行10次，直到10^-10浓度。
稀释样品1.取一定量的待测样品，用移液管取约0.1 mL加入10 mL生理盐水中的10^-1浓度管，混匀。
2.取10^-1浓度液体混合液0.1 mL，加入10 mL生理盐水中的10^-2浓度管中，混匀。
重复此步骤直到10^-10浓度。
涂布平板1.准备含有平板培养基的琼脂糖平板。
2.取一份10-4和10-5倍稀释液，用移液管吸取0.1 mL后滴入平板表面，并快速均匀涂布于平板表面。
3.重复上述步骤，使用10-6至10-10倍稀释液。
培养和计数1.室温下，将平板培养基放置静置30分钟，让液滴被吸收并凝固。
2.37℃恒温箱中培养约24-48小时，待菌落生长。
3.使用菌落计数器进行计数。
实验结果结果以表格形式列出，如下所示：稀释倍数稀释液体积 (mL) 实验重复次数菌落数量10^-4 0.1 3 1510^-5 0.1 3 3210^-6 0.1 3 9810^-7 0.1 3 24310^-8 0.1 3 56710^-9 0.1 3 122110^-10 0.1 3 2810结果分析根据实验结果，我们可以看到随着稀释倍数的增加，菌落的数量呈现递减趋势。
这是因为较高倍数的稀释液中含有更少的待测微生物，导致出现的菌落数量较少。
此外，我们还可以观察到不同稀释倍数下同一实验重复次数的结果存在一定差异，这可能是由于实验操作过程中的人为误差造成的。
稀释涂布平板法计数公式
“微生物数量测量”是2017年高考大纲中的新内容，也是教学中的重要难点。
稀释涂板法是计数微生物的常用方法，用于计数样品中活菌的数量。
当样品的稀释度足够高时，在培养基表面上生长的菌落来自样品稀释液中的活细菌。
通过计算平板上的菌落数，我们可以猜测样品中有多少种活细菌。
但是，菌落计数结果的处理常常成为学生容易出错的地方。
典型示例：在从土壤中分离产生脲酶的细菌的实验中，将10g土壤样品溶液进行梯度稀释，并将0.1mL稀释倍数为105的土壤样品溶液接种在三个中板上。
培养一段时间后，平板上的细菌菌落数分别为42、200和256。
1g土壤样品中的细菌数为。
在PEP高中生物学选修课“生物技术实践”中，有这样一条陈述：用稀释包被板法计数菌落：为了确保结果的准确性，菌落数在30到30之间通常选择300和300进行计数。
但是，如果我们理所当然地认为42、200和256个数据都在30〜300范围内，那么直接对它们求平均并乘以稀释倍数就可以得出错误的结果1.66×108。
这也是许多学生犯错误的原因。
实际上，教材中的相关表述仅说明了可计数菌落数的适当范围。
在一定稀释度下，三个平板中的菌落数不能简单地直接平均，应注意稀释度的设定和计数结果的允许差异。
为了确保准确确定有效活菌计数，必须设置三个稀释度并进行分级，并且每个梯度应设置三个重复。
为了确定土壤中细菌的数量，通常使用104、105和106倍的稀释剂进行平板培养。
为了确定放线菌的数量，通常使用103、104和105倍的稀释度。
为了确定真菌的数量，通常使用102、103和104倍的稀释度。
如果平板中的菌落数太少，必然会导致计数误差太大；相反，如果培养皿中的菌落太多，将导致计数困难。
因此，世界上菌落计数的基本原理是对稀释的平板进行计数，其中平板上有30〜300个菌落。
同时，相同稀释度重复3次的平板上菌落数的标准差应小于允许的差。
也就是说，在平板计数试验中，如果在相同稀释度下三个重复菌落的数量在30〜300之间，但是数据相差很大，则需要将其丢弃。
第二周稀释平板计数法
3
平均
1克样品总菌落数
• 样品稀释液的制备用手或置摇床上充分振 荡，使微生物细胞分散
二、操作步骤
（1）土壤稀释液的制备：按“稀释平板测数 法” 进行，按无菌操作法将土壤稀释至107即可。
（2）平板接种培养（混菌法）： 吸10-４，10-５，10-６，10-７土壤悬液1ML 到灭菌平板内，再倒入冷却至50 ℃培养基。
平板接种培养
• （1）混合平板培养法 • （2）涂抹平板计数法
下一周做
（3）倒放置培养箱中培养，28oC培养 3~4天后，在有混浊半透明的胶状菌落 出现，有的在后期会产生褐色的色素。
（４）观察菌落形态及计数
稀释平板计数法
• 将实验结果填入下表
稀释度 菌落数
10-3
10-5
1
2
3
平均 1
2
3
平均 1
2
细菌数量大于放线菌，真菌量最少
稀释平板计数法 对样品稀释培养，据形成的菌落数计数。 优点：传统计数方法。对设备要求不高。活菌计数
10-3
10-4
10-5
10-6
• 微生物得稀释平板记数使根据在固体培养 基上所形成得一个菌落，即是由一个单细 胞繁殖而成，且肉眼可见得子细胞群体这 一生理及培养特征进行得。
无菌操作三要点
静 使无菌操作室空气流动尽可降低
关好门窗, 避免空气流动过快; 不宜四处走动; 操作者不讲话,他人也不要在操作处讲话.
快 操作熟炼, 动作快速, 使接种器具暴露在
空气中的时间缩短.
轻 打开或盖上瓶口的动作要轻;
接种操作动作要轻.
从土壤中分离自生固氮菌
• 一、实验原理 微生物常以群落状态存在，这种群落往往 是不同种类微生物的混合体。研究某种微 生物的特性或者要大量培养和使用某种微 生物，必须从这些混杂的微生物群落中获 得纯培养，这种获得纯培养的方法称为微 生物的分离与纯化。
平板计数法
平板菌落计数法样品的稀释固体和半固体食品：以无菌操作取25g样品,放入装有225 mL生理盐水的无菌均质杯内,于8000 ～10000r/min均质1min～2min,制成1:10样品匀液，或放入225 mL生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min，制成1:10的样品匀液。
液体食品：以无菌吸管吸取样品25mL放入装有225mL生理盐水的无菌玻璃瓶(瓶内预置适当数量的玻璃珠)中,充分混匀，制成1:10的样品匀液。
用1 mL无菌吸管或微量移液器吸取1：10的样品匀液1 mL加到装有9 mL PBS的稀释管中，充分混匀制成1：100的样品匀液。
制备十倍递增系列稀释样品匀液。
每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。
根据对样品污染状况的估计，选择2～3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度分别吸取1mL样品均匀加入两个无菌平皿内。
同时分别取1mL稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。
及时将15~20ml冷却至46℃平板计数琼脂培养基（可放置于46℃±1℃恒温水浴箱内保温）倾注平板，并转动平皿使其混合均匀。
琼脂凝固后，将平板翻转，置36±1℃培养48±2h。
水产品30±1℃培养72±3h。
如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生成的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（4mL），凝固后翻转平板，进行培养。
菌落计数可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，记录稀释倍数和相应的菌落数量。
菌落计数以菌落形成单位（（CFU）表示。
选取菌落数在30~300之间、无蔓延菌落生成的平板计数菌落总数。
低于30 CFU的平板记录具体菌落数，大于300的可记录为多不可计。
每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。
其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘2代表一个平板的菌落数。
稀释培养和稀释平板测数法
稀释培养和稀释平板测数法稀释培养测数法一、实验目的通过对好气性自生固氮菌的计数，了解稀释培养计数（MPN）的原理和方法。
二、实验原理最大或然数(most probable number，MPN)计数又称稀释培养计数，适用于测定在一个混杂的微生物群落中虽不占优势，但却具有特殊生理功能的类群。
其特点是利用待测微生物的特殊生理功能的选择性来摆脱其他微生物类群的干扰，并通过该生理功能的表现来判断该类群微生物的存在和丰度。
本法特别适合于测定土壤微生物中的特定生理群（如氨化、硝化、纤维素分解、固氮、硫化和反硫化细菌等。
见附表23-1）的数量和检测污水、牛奶及其他食品中特殊微生物类群（如大肠菌群）的数量，缺点是只适于进行特殊生理类群的测定，结果也较粗放，只有在因某种原因不能使用平板计数时才采用。
MPN计数是将待测样品作一系列稀释，一直稀释到将少量（如lm1）的稀释液接种到新鲜培养基中没有或极少出现生长繁殖。
根据没有生长的最低稀释度与出现生长的最高稀释度，采用“最大或然数”理论，可以计算出样品单位体积中细菌数的近似值。
具体地说，菌液经多次10倍稀释后，一定量菌液中细菌可以极少或无菌，然后每个稀释度取3—5次重复接种于适宜的液体培养基中。
培养后，将有菌液生长的最后3个稀释度（即临界级数）中出现细菌生长的管数作为数量指标，由最大或然数表（见附录九）上查出近似值，再乘以数量指标第一位数的稀释倍数，即为原菌液中的含菌数。
如某一细菌在稀释法中的生长情况如下；稀释度 lO-3 10-4 10-5 lO-6 10-7 10-8重复数 5 5 5 5 5 5出现生长的管数 5 5 5 4 1 0根据以上结果，在接种lO-3—10-5稀释液的试管中5个重复都有生长，在接种lO-6稀释液的试管中有4个重复生长，在接种10-7稀释液的试管中只有1个生长，而接种10-8稀释液的试管全无生长。
由此可得出其数量指标为“541”，查最大或然数表得近似值17，然后乘以第一位数的稀释倍数（10-5的稀释倍数为100 000）。
大肠菌群检测(平板计数法)
平板菌落数的选择
选择菌落数在15-150之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。 典型菌落为紫红色，菌落周围有胆盐与酸形成的沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大。
什么样的菌落必须要做证实试验
一是非典型菌落，如在颜色、直径与典型菌落不符合的菌落。 另一种情况是被检样品中含有乳糖以外的其他糖类，如牛奶、饮料等样品。本
36℃±1 ℃ 18h ~24h
挑选10个菌落分别 接种到BGLB
VRBA琼脂
配方(g/L): 蛋白胨:7.0; 酵母粉:3.0;乳糖:10.0;3号胆盐:1.5;中性红:0.03;结晶紫:0.002;氯化 钠:5.0; 琼脂:15.0;pH 7.4±0.1,25℃ 其中蛋白胨提供氮源；酵母粉提供生长促进因子和Ｂ族维生素；乳糖提供碳源， 大肠菌群发酵乳糖，产生酸性物质；３号胆盐是一种抑菌剂，主要是抑制革兰氏 阳性菌；结晶紫也是一种抑菌剂，主要是抑制革兰氏阳性菌和一部分革兰氏阴性 菌；中性红是一种指示剂，在酸性条件显红色，碱性条件下显无色。氯化钠维持 细菌生长时的渗透压。琼脂是一种凝固剂。
10倍系列稀释
选择2~3个适宜稀释度的样液，接种VRBA平板
36℃±1℃
18~24h
计数典型和可疑菌落
注：VRBA(结晶紫中性红胆盐 琼脂)又称为：VRB或VRBL
BGh
报告结果
平板计数法操作
菌落数在15-150之 间的平板,计数典型
和可疑菌落
典型菌落为紫红色周围有 红色胆盐沉淀环，0.5mm
来大肠菌群的定义是发酵乳糖，但由于样品含有的其他糖类混入了培养基，使 得不能分解乳糖但能分解其他糖类的细菌也能够长出红色菌落，所以需要进行 证实实验。
结果报告
经最后证实为大肠菌群阳性的BGLB管的百分比乘以计数的平板菌落数，再乘 以稀释倍数，即为每g (mL)样品中大肠菌群数 。
稀释涂布平板法计数公式
显微镜计数法即血球计数法，事先把菌液稀释到一定的倍数，然后通过血球计数板在显微镜下计数。
此法计数比较精准。
活菌计数法是将待测样品经一系列10倍稀释，然后选择三个稀释度的菌液，分别取0.2ml放入无菌平皿，再倒入适量的已熔化并冷至45℃左右的培养基，与菌液混匀，冷却、待凝固后，放入适宜温度的培养箱或温室培养，长出菌落后，计数，按下面公式计算出原菌液的含菌数：每毫升原菌液活菌数=同一稀释度三个以上重复平皿菌落平均数×稀释倍数×5稀释涂布平板法是一种粗略的活菌计数法，即通过一定的稀释倍数，涂布到平板上，在适宜的条件下培养后，观察活菌数。
平板划线法是用来分离单菌落的一种方法，不是计数的方法。
如果只有一个稀释度的平均菌落数符合30~300这个范围
则以该稀释度平均菌落数除以涂布平板所用稀释液体积(0.1mL)，乘以稀释倍数作为该样品的细菌总数
如果有两个稀释度的平均菌落数符合要求
则按照两者菌落总数之比来决定
如果小于2，取两者的平均值
如果大于2，取较小的菌落总数
本题的46*10^3与295*10^2的比之为1.6
应取两者的平均值
（46*10^3+295*10^2)/0.1/2=3.775*10^5
相当于统计学里面的比较差异，
如果多比少大于2倍，则梯度浓度差异是10倍的情况下，其菌落是有很多重叠或者链接在一起的，这样就无法计算清楚是否为单菌落了，所以只有选择较小的菌落数。
来保证以上要求。
稀释平板计数法
实验原理平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。
统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。
但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可能来自样品中的2—3或更多个细胞。
因此平板菌落计数的结果往往偏低。
为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位(cfu)而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。
平板菌落计数法虽然操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是，由于该计数方法的最大优点是可以获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验（如活菌制剂），以及食品、饮料和水〔包括水源水〕等的含菌指数或污染程度的检测。
实验器材LB液体、固体培养基1m1移液器，平皿，试管，试管架，恒温培养箱等。
实验步骤1．无菌器材的准备(1) 无菌培养皿：取培养皿9套，包扎、灭菌。
(2) 无菌水：取6支试管，分别装入4.5m1蒸馏水，加棉塞，灭菌。
2．样品稀释液的制备(1) 编号取无菌平皿9套，分别用记号笔标明10-4、10-5、10-6(稀释度)各3套。
另取6支盛有4.5m1无菌水的试管，依次标是10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。
(2) 稀释用1m1移液器吸取0.5m1己充分混匀的菌悬液(待测样品)，至10-1的试管中，此即为10倍稀释。
将10-1试管置试管振荡器上振荡，使菌液充分混匀。
用1m1移液器在10-1试管中来回吹吸菌悬液三次，进一步将菌体分散、混匀。
吹吸菌液时不要太猛太快，吸时吸管伸入管底，吹时离开液面。
混匀后吸取至10-2试管中，此即为100倍稀释。
……其余依次类推，整个过程如图所示。
3．平板接种培养平板接种培养有浇注平板培养法和涂布平板培养法两种方法。
平板计数法
平板菌落计数法平板菌落计数法，是种统计物品含菌数的有效方法。
方法如下：将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液涂布到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞；统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。
目录一、菌落总数介绍：二、检验方法三、说明一、菌落总数介绍：二、检验方法三、说明展开但是，由于待测样品往往不宜完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可能来自样品中的2～3或更多个细胞。
因此平板菌落计数的结果往往偏低。
为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位（cfu ：colony-forming units），而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。
[1]编辑本段一、菌落总数介绍：菌落是指细菌在固体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼识别的生长物，它是由数以万计相同的细菌集合而成。
当样品被稀释到一定程度，与培养基混合，在一定培养条件下，每个能够生长繁殖的细菌细胞都可以在平板上形成一个可见的菌落。
菌落总数就是指在一定条件下（如需氧情况、营养条件、pH、培养温度和时间等）每克（每毫升）检样所生长出来的细菌菌落总数。
按国家标准方法规定，即在需氧情况下，37℃培养48h，能在普通营养琼脂平板上生长的细菌菌落总数，所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，由于现有条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。
因此菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。
菌落总数测定是用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，它反映食品在生产过程中是否符合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫生学评价。
菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。
编辑本段二、检验方法菌落总数的测定，一般将被检样品制成几个不同的10倍递增稀释液，然后从每个稀释液中分别取出1mL置于灭菌平皿中与营养琼脂培养基混合，在一定温度下，培养一定时间后（一般为48小时），记录每个平皿中形成的菌落数量，依据稀释倍数，计算出每克（或每ml）原始样品中所含细菌菌落总数。
稀释涂布平板法计数公式
稀释涂布平板法计数公式
稀释涂布平板法计算公式是每克样品中的菌株数=(C÷V)×M，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数。
稀释涂布平板法是微生物学实验中的一种操作方法。
由于将含菌材料现加到还较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，而且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中更常用的纯种分离方法是稀释涂布平板法。
稀释平板计数法
稀释平板计数法实验目得学习稀释平板菌落计数得基本原理与方法。
实验内容用稀释平板菌落计数法对菌悬液进行计数。
实验原理平板菌落计数法就是将待测样品经适当稀释之后，其中得微生物充分分散成单个细胞，取一定量得稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见得菌落，即一个单菌落应代表原样品中得一个单细胞。
统计菌落数，根据其稀释倍数与取样接种量即可换算出样品中得含菌数。
但就是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成得一个单菌落也可能来自样品中得2—3或更多个细胞。
因此平板菌落计数得结果往往偏低。
为了清楚地阐述平板菌落计数得结果，现在已倾向使用菌落形成单位(cfu)而不以绝对菌落数来表示样品得活菌含量。
平板菌落计数法虽然操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因素得影响，但就是，由于该计数方法得最大优点就是可以获得活菌得信息，所以被广泛用于生物制品检验（如活菌制剂），以及食品、饮料与水〔包括水源水〕等得含菌指数或污染程度得检测。
实验器材酿酒酵母菌悬液马铃薯培养基1m1吸管，平皿，试管，试管架，恒温培养箱等。
实验步骤1．无菌器材得准备(1) 无菌培养皿：取培养皿9套，包扎、灭菌。
(2) 无菌移液管得准备：取1m1移液管，在后部管口处用铁丝塞入棉花少许（长约1~1、5cm ），以防将菌液吸出，同时也可避免将外面得微生物吹入。
棉花要塞得松紧适宜吹时能通气但不使棉花滑下为准。
然后将移液管尖端放在4~5cm宽得长纸条一端呈45º角折叠纸条包住尖端，用左手捏住管身，右手将吸管压紧，在桌面上向前滚动，以螺旋式包扎起来，上端剩余纸条折叠打结后干热灭菌。
(3) 无菌水：取6支试管，分别装入4、5m1蒸馏水，加棉塞，灭菌。
2．样品稀释液得制备(1) 编号取无菌平皿9套，分别用记号笔标明10-4、10-5、10-6(稀释度)各3套。
另取6支盛有4、5m1无菌水得试管，依次标就是10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。
稀释涂布平板法计数公式
每克样品中的细菌数=（C△V）×M
C代表在一定稀释度下在平板上生长的菌落的平均数，V代表用于涂布平板的稀释剂的体积（ML），M代表稀释倍数。
很容易理解。
稀释包衣是为了使菌株生长到群落中。
培养的群落数量代表用于平板的稀释液中细菌的数量。
将稀释倍数乘以得到样品中细菌的数量涂布平板法
微生物实验中的一种操作方法。
因为将含有细菌的材料添加到仍然很热的培养基中，然后倒入培养皿中，很容易导致某些热敏感细菌死亡，并且稀释方法也会影响某些严格需氧细菌的生长，因为它们固定在琼脂中间并且缺氧，因此稀释涂板法在微生物学研究中更常用。
稀释板计数是根据微生物在固体培养基上形成的单个菌落的培养特性设计的计数方法，即一个菌落代表单个细胞。
计数时，首先将要测试的样品制成一系列均匀的稀释剂，并尝试使样品中的微生物细胞尽可能分散，以使单个细胞的存在（否则，菌落不仅代表将一定稀释度和一定量的稀释剂接种到板中，以使其均匀地分布在板中的培养基中。
培养后，通过单个细胞的生长和繁殖形成菌落。
样品中细菌的数量可以通过计算菌落的数量来计算。
通过这种方法计算出的细菌数就是在培养基上生长的菌落数，因此也称为存活数。
它通常用于检查某些成品（例如杀虫剂），生物产品，土壤细菌含量以及食品和水污染。
稀释涂布平板法计数公式
稀释涂布平板法计数公式
稀释涂布平板法
操作过程：
稀释操作：
1、将分别盛有9ml水的6支试管灭菌,并按10^1到10^6的顺序进行编号
2、用移液试管吸取1ml培养的菌夜,注入10^1倍稀释的试管中.用手指轻压移夜管上的橡皮,
吹吸三次,使菌液与水充分混匀.
3、从10^1倍稀释的试管中吸取1ml稀释液,注入10^2倍稀释的试管中,重复第二步的混匀
操作.以此类推,直到完成最后一支试管的稀释.
涂布操作：
1、将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中.
2、取少量菌夜（不超过0.1ml）滴加到培养基表面.
3、将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃,待酒精燃尽后,冷却8~10s.
4、用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面,涂布时可转动培养皿,使菌液分布均匀.
计算公式：
菌体数量cfu/g（mL）土样=同一稀释度重复的菌落平均数×稀释倍数。
稀释涂布平板法计数公式
稀释涂布平板法计数公式“微生物数量的测定”是2017年高考考纲中新增加的内容，同时也是教学的重难点。
稀释涂布平板法是对微生物计数的常用方法，用来统计样品中活菌的数目。
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落来源于样品稀释液中的一个活菌。
通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约有多少活菌。
但对菌落计数的结果处理往往成为学生的易错点。
经典例题：在从土壤中分离产脲酶细菌的实验中，将10g土壤样液梯度稀释，在3个培养基平板上均接种稀释倍数为105的土壤样液0.1mL，培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为42、200、256。
则1g土壤样品中的细菌数量为个。
很多学生得出的答案为：1.66×108。
同时，学生对于42这个数据如何处理存在疑问：是否需要舍弃？如果需要舍弃，标准是什么？2菌落计数的基本原则2.1教材中的相关表述在人教版高中生物学选修1《生物技术实践》中，对于稀释涂布平板法计数菌落有如此的表述：为了保证结果准确，一般选择菌落数在30~300的平板进行计数。
但是，若想当然地认为42、200、256三个数据均处于30~300范围之内，然后直接求平均值，再乘以稀释倍数，就会得出1.66×108的错误结果。
这也是很多学生产生错误的原因。
事实上，教材中的相关表述只是在说明可计数的菌落数量的适宜范围。
某一稀释度下的3个平板中菌落数并不能简单地直接求平均值，还应该关注稀释度的设置以及计数结果的允许差。
2.2稀释度的设置及计数原则为了确保有效活菌数的准确测定，在采用平板计数检测中，必须设3个稀释度且成梯度，每个梯度设3个重复。
测定土壤中细菌的数量，一般选用104、105和106倍的稀释液进行平板培养；测定放线菌的数量，一般选用103、104和105倍稀释；测定真菌的数量，一般选用102、103和104倍稀释。
如果平板中菌落的数量太少，必然会导致计数误差太大；反之，如果平板中菌落数量过多，会造成计数上的困难。
稀释平板测数法
稀释平板测数法稀释平板测数法一、实验目的了解稀释平板计数的原理，掌握涂抹平板培养法和混合平板培养法，认识细菌、放线菌、霉菌的菌落特征。
二、实验原理稀释平板计数是根据微生物在固体培养基上所形成的单个菌落，即是由一个单细胞繁殖而成这一培养特征设计的计数方法，即一个菌落代表一个单细胞。
计数时，首先将待测样品制成均匀的系列稀释液，尽量使样品中的微生物细胞分散开，使成单个细胞存在（否则一个菌落就不只是代表一个细胞），再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中，使其均匀分布于平板中的培养基内。
经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。
此法所计算的菌数是培养基上长出来的菌落数，故又称活菌计数。
一般用于某些成品检定（如杀虫菌剂等）、生物制品检验、土壤含菌量测定及食品、水源的污染程度的检验。
三、实验器材1．活材料：苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）菌剂。
2．培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（附录三、1）3．器材：90ml无菌水、9ml无菌水、无菌平皿、lml无菌吸管、天平、称样瓶、记号笔、玻璃刮铲等。
四、实验方法1．样品稀释液的制备准确称取待测样品l0g，放入装有90ml无菌水并放有小玻璃珠的250ml三角瓶中，用手或置摇床上振荡20 min，使微生物细胞分散，静置20-30s，即成10-1稀释液；再用1ml无菌吸管，吸取10-1稀释液lml，移入装有9ml无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10-2稀释液；再换一支无菌吸管吸取10-2稀释液1 ml，移入装有9ml无菌水的试管中，也吹吸三次，即成l0-3稀释液；以此类推，连续稀释，制成10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9等一系列稀释菌液（图22-1）。
图22-1 平板计数法中样品的稀释和稀释液的取样培养用稀释平板计数时，待测菌稀释度的选择应根据样品确定。
样品中所含待测菌的数量多时，稀释度应高，反之则低。
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实验十一稀释平板计数法
实验目的
学习稀释平板菌落计数的基本原理和方法。
实验内容
用稀释平板菌落计数法对菌悬液进行计数。
实验原理
平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。
统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。
但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可能来自样品中的2—3或更多个细胞。
因此平板菌落计数的结果往往偏低。
为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位(cfu)而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。
平板菌落计数法虽然操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是，由于该计数方法的最大优点是可以获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验（如活菌制剂），以及食品、饮料和水〔包括水源水〕等的含菌指数或污染程度的检测。
实验器材
酿酒酵母菌悬液
马铃薯培养基
1m1吸管，平皿，试管，试管架，恒温培养箱等。
实验步骤
1．无菌器材的准备
(1) 无菌培养皿：取培养皿9套，包扎、灭菌。
(2) 无菌移液管的准备：取1m1移液管，在后部管口处用铁丝塞入棉花少许（长约1~1.5cm ），以防将菌液吸出，同时也可避免将外面的微生物吹入。
棉花要塞得松紧适宜吹时能通气但不使棉花滑下为准。
然后将移液管尖端放在4~5cm宽的长纸条一端呈45º角折叠纸条包住尖端，用左手捏住管身，右手将吸管压紧，在桌面上向前滚动，以螺旋式包扎起来，上端剩余纸条折叠打结后干热灭菌。
(3) 无菌水：取6支试管，分别装入4.5m1蒸馏水，加棉塞，灭菌。
2．样品稀释液的制备
(1) 编号
取无菌平皿9套，分别用记号笔标明10-4、10-5、10-6(稀释度)各3套。
另取6支盛有4.5m1无菌水的试管，依次标是10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。
(2) 稀释
用1m1无菌吸管吸取1m1己充分混匀的菌悬液(待测样品)，精确地放0.5ml至10-1的试管中，此即为10倍稀释。
将多余的菌液放回原菌液中。
将10-1试管置试管振荡器上振荡，使菌液充分混匀。
另取一支1m1吸管插入10-1试管中来回吹吸菌悬液三次，进一步将菌体分散、混匀。
吹吸菌液时不要太猛太快，吸时吸管伸入管底，吹时离开液面，以免将吸管中的过滤棉花浸湿或使试管内液体外溢。
用此吸管吸取10-1菌液1ml，精确地放0.5ml至10-2试管中，此即为100倍稀释。
……其余依次类推，整个过程如图所示。
放菌液时吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只能接触一个稀释度的菌悬液，否则稀释不准确，结果误差较大。
3．平板接种培养
平板接种培养有浇注平板培养法和涂布平板培养法两种方法。
(1) 浇注平板培养法
1) 取样
用三支1ml无菌吸管分别吸取10-4、10-5、和10-6的稀释菌悬液各1ml，对号放入编好号的无菌平皿中，每个平皿放0.2ml。
不要用1ml吸管每次只靠吸管尖部吸0.2ml稀释菌液放入平皿中，这样容易加大同一稀释度几个重复平板间的操作误差。
2) 倒平板
尽快向上述盛有不同稀释度菌液的平皿中倒人融化后冷却至45℃左右的培养基约15毫升／平皿，置水平位置迅速旋动平皿，使培养基与菌液混合均匀，而又不使培养基荡出平皿或溅到平皿盖上。
待培养基凝固后，将平板倒置于37℃恒温培养箱中培养。
由于细菌易吸附到玻璃器皿表面，所以菌液加入到培养皿后，应尽快倒入融化并己冷却至45℃左右的培养基，立即摇匀，否则细菌将不易分散或长成的菌落连在一起，影响计数。
(2) 涂布平板计数法：
平板菌落计数法的操作除上述倾注倒平板的方式以外，还可以用涂布平板的方式进行。
二者操作基本相同，所不同的是后者先将培养基融化后倒平板，待凝固后编号，并于37℃左右的温箱中烘烤30min，或在超静工作台上适当吹干，然后用无菌吸管吸取稀释好的菌液对号接种于不同稀释度编号的平板上，并尽快用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上涂布均匀，平放于实验台上20—30 min，使菌液渗入培养基表层内，然后倒置于的恒温箱中培养24—48h。
涂布平板用的菌悬液量一般以0.1ml较为适宜，如果过少，菌液不易涂布开；过多则在涂布完后或在培养时菌液仍会在平板表面流动，不易形成单菌落。
4．计数
培养48h后，取出培养平板，算出同一稀释度三个平板上的菌落平均数，并按下列公式进行计算：
每毫升中菌落形成单位(cfu)＝同一稀释度三次重复的平均菌落数×稀释倍数×5 一般选择每个平板上长有30—300个菌落的稀释度计算每毫升的含菌量较为合适。
同一稀释度的三个重复对照的菌落数不应相差很大，否则表示试验不精确。
实际工作中同一稀释度重复对照平板不能少于三个，这样便于数据统计，减少误差。
由10-4、10-5、10-6三个稀释度计算出的每毫升菌液中菌落形成单位数也不应相差太大。
平板菌落计数法，所选择倒平板的稀释度是很重要的。
一般以三个连续稀释度中的第二个稀释度倒平板培养后所出现的平均菌落数在50个左右为好，否则要适当增加或减少稀释度加以调整。
实验结果及讨论
1．实验结果
将培养后菌落计数结果填入下表：
稀释度
10-410-510-6
1 2 3 平均 1 2 3 平均 1 2 3 平均
cfu数/平板每ml中的
cfu数2．讨论
针对实验原理、步骤、现象进行讨论。
实验作业
1．为什么融化后的培养基要冷却至45℃左右才能倒平板？
2．要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关键？为什么？
3．试比较平板菌落计数法和显微镜下直接计数法的优缺点及应用。
4．当你的平板上长出的菌落不是均匀分散的而是集中在一起时，你认为问题出在哪里？5．用浇注平板法和涂布法计数，其平板上长出的菌落有何不同？为什么要培养较长时间(48h)后观察结果？。