实验八核酸的定量测定——定磷法(精)
测定核酸含量实验报告
一、实验目的1. 掌握定磷法测定核酸含量的原理与方法。
2. 学习核酸提取、纯化及定量测定的基本操作。
3. 了解实验数据的处理与分析方法。
二、实验原理核酸是生物体内重要的生物大分子，由核苷酸单元组成。
本实验采用定磷法测定核酸含量，其原理如下：1. 核酸分子中含有一定比例的磷，RNA中含磷量为10%，DNA中含磷量为8%。
2. 用强酸将核酸分子中的有机磷消化成为无机磷，使之与钼酸铵结合成磷钼酸铵。
3. 在还原剂存在的情况下，Mo6+被还原成Mo4+，与试剂中的其他MoO42-结合成Mo(MoO4)2或Mo3O8，形成蓝色化合物，称为钼蓝。
4. 在一定浓度范围内，蓝色的深浅与磷含量成正比，可通过比色法测定核酸含量。
三、实验器材与试剂1. 实验器材：- 粗核酸- 克氏烧瓶（50ml）- 小漏斗（4cm）- 容量瓶（100ml、50ml）- 吸管- 试管（X18cm）- 722型或XX型分光光度计- 电炉- 水浴锅2. 实验试剂：- 标准磷溶液：将磷酸二氢钾于100℃烘至恒重，准确称取溶于少量蒸馏水中，转移至500ml容量瓶中，加入5ml 5mol/L硫酸溶液及氯仿数滴，用蒸馏水稀释至刻度，此溶液每毫升含磷400μg。
临用时准确稀释20倍。
- 定磷试剂：17%硫酸：17ml浓硫酸缓缓加入83ml水中。
2%钼酸铵溶液。
四、实验步骤1. 核酸提取：取一定量的粗核酸，加入适量的水，用玻璃棒搅拌，使核酸充分溶解。
然后加入一定量的强酸，使核酸分子中的有机磷消化成为无机磷。
2. 核酸纯化：将消化后的核酸溶液通过离心、沉淀等方法进行纯化。
3. 核酸定量测定：a. 准备标准曲线：取一定量的标准磷溶液，分别加入定磷试剂，制备标准曲线。
b. 样品测定：取一定量的纯化后的核酸溶液，加入定磷试剂，制备样品溶液。
在分光光度计上测定样品溶液的吸光度，通过标准曲线计算出样品中核酸含量。
五、实验结果与分析1. 标准曲线的绘制：根据标准磷溶液的浓度和吸光度，绘制标准曲线。
实验四、定磷法测定核酸含量(精)
1
核酸定量测定常见的方法
1. 定磷法：将核酸消化，测定其无机磷量，由此计算出核酸 含量，反应灵敏。
2. 紫外吸收法：利用核酸在260nm处有吸收高峰，操作简 便，受蛋白质和核苷酸的干扰影响。
3. 地衣酚法：用于测定RNA的含量，RNA与浓盐酸共热， 降解形成的核糖转变为糠醛，利用地衣酚反应来测定，特异 性差，戊糖均有此反应。
17
实验结束
将试管洗净，斜插在试管架上，放在台 面上。
将消化管和橡皮塞洗净，放回原处。 将比色杯洗净，放在实验台上的小平皿
中。 将实验台面擦干净。
18
1
2
34
5
6
标准磷溶液/mL
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
dH2O/mL 定磷试剂/mL
1.5 1.4 1.3 1.2 1.1 1.0 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
用漩涡混合器混匀，45℃恒温水浴保温25分钟 用去离子水作为空白，660nm测定吸光值
A660(1)
A660(2)
回收率 0.15 100%
1000
(2) 计算样品总磷量：
x 50
RNA总磷量(g
/ mL)
1.5 回收率
(3) 计算RNA量：
RNA质量浓度（g / mL) （总磷量 无机磷量 DNA含量 9.9%） 10.5
总磷量 10.5
(4) 样品RNA含量：
样品RNA质量分数(%) RNA质量浓度(g / mL) 100% 2000(g / mL)
15
操作注意事项
1. 每人独立操作，不允许两人穿插取样； 2. 要求试剂及所有器皿清洁，不含磷； 3. 每管加样和测定均要求平行操作； 4. 消化溶液定容后务必上下颠倒混匀后再取样； 5. 各种试剂必须用移液管按顺序准确量取，移液管口用吸水
核酸的定量测定—定磷法
溶液呈无色可淡蓝色为止，稍冷却，加1ml水，于100 ℃加热10分钟使焦磷酸转变为磷酸。冷至室温，用蒸 馏水定容到50ml。与样品消化的同时做空白对照，空 白瓶中不加样品，用水替代，其它完全相同。 取稀释后的消化液1ml，加水2ml，定磷试剂3ml， 摇匀，45 ℃放置20分钟，于660nm处读取OD值。空白 对照同样操作。 3. 样品中无机磷含量测定： 取未消化的核酸样品液1ml用水定容到50ml。从中取 1ml，加2ml水，3ml定磷试剂，摇匀后保温，然后读
核苷酸的消化和核酸一样。此外嘌呤类核苷 酸可用1.5mol/L的HCL，100℃ 水解1小时脱磷； 嘧啶类核苷酸可用10mol/L H2 SO4 消化1—2个小 时脱磷。
二，试剂
1.标准磷试剂（含磷5µg/ml）:准确称取恒重 （105℃ ）的 KH2 PO4 0.4389g,用水定容到100ml，此液 的浓度为1mg/ml，用前再稀释200倍，即为5µg/ml。 2.定磷试剂： (1)6mol/L硫酸：取17ml浓硫酸（比重1.84）缓缓加 入83ml水中。 (2)2.5%钼酸铵：2.5g钼酸铵溶于100ml水中 (3)10%抗坏血酸溶液：取10g抗坏血酸溶于100ml水 中。棕色瓶4 ℃ 贮藏。溶液应为淡黄色，深黄色或棕 SO •5H O）：硫酸钾
4 2
（ K2 SO4）=1：4（W/W）,研成细末。 4. 30%过氧化氢，浓硫酸
三，操作方法
1.制作磷标准曲线： 取标准磷酸溶液（ 5µg/ml ）0，0.5，1.0，1.5，2.0， 2.5，3.0ml，用水补足到3ml，含磷量分别为0，2.5，5， 7.5，10，12.5，15 µg，加定磷试剂3ml后摇匀，45 ℃ 放置20分钟，测 。以含磷量为横坐标， 为 OD660 纵坐标制作标准曲线。 OD660 2. 核酸中总磷量的测定： 取1ml被测样品液（约含2.5—5mg核酸，也可取固 体样品），置于消化瓶中，加入1ml浓硫酸及50mg催 化剂，在消化炉上加热至发白烟，样品由黑变成淡黄 色，取下稍冷，加数滴30%过氧化氢液，继续加热至
实验四、定磷法测定核酸含量(精)
实验步骤
1. 核酸样品用硫酸消化，将有机磷转 化成无机磷； 2. 制定定磷标准曲线；
3. 测定回收率和样品总磷量。
9
1. 样品消化（每两组或三组做一份）
吸取核酸样品液1ml于凯氏烧瓶中，另吸取蒸馏水 1ml做空白试验。各加入2 ml 5M硫酸。置于140160℃烘箱内消化2-4h，待溶液呈黄褐色后，取出 冷却，加入1-2滴30%过氧化氢，继续消化，到溶液 透明为止。取出冷却后加入1ml 蒸馏水，于沸水浴 中加热10min，以分解消化过程中形成的焦磷酸。 然后将消化液用蒸馏水转移至100ml容量瓶中定容 到刻度。
10
消化管 RNA/mL 标准磷原液/mL dH2O/mL
1 0 0 1
2 1 0 0
3 0 1 0
5mol/L H2SO4/mL
dH2O/mL 用dH2O定容/mL
2
1 50 混匀
2
1 50
2
1 50
消煮炉中消化2—6h至溶液无色透明，冷却
沸水浴中加热10min（分解焦磷酸），冷却
11
2. 定磷标准曲线的制定（每人做一份）
(4) 样品RNA含量：
样品RNA质量分数(%) RNA质量浓度( g / mL ) 100% 2000( g / mL )
15
操作注意事项
1. 每人独立操作，不允许两人穿插取样； 2. 要求试剂及所有器皿清洁，不含磷； 3. 每管加样和测定均要求平行操作； 4. 消化溶液定容后务必上下颠倒混匀后再取样； 5. 各种试剂必须用移液管按顺序准确量取，移液管口用吸水 纸擦净，溶液尽量加到试管下部，标准溶液要求用差量法。 6. 漩涡混合器的使用：用点动档，试管竖直或稍倾斜垂直向 下用力。 7. 测定吸光值时，用一个比色杯装去离子水调节分光光度计 零点，另一个比色杯按照从低浓度到高浓度的顺序测定， 不用润洗，切忌甩比色杯，将蓝色溶液撒在仪器和地面上。
核酸含量测定——定磷法
用漩涡混合器混匀，45℃恒温水浴保温25分钟
A660(2) A660平均值 A660平均值—空白 0
9
数据处理
关于空白： 1—6号管用于绘制定磷标准曲线，1号管作 为空白。 7—9号管用于样品及回收率的测定，7号管 作为空白。
以每管含磷量(μg)为横坐标，吸光值为纵坐标画 标准曲线，直线应过原点。 在标准曲线上查出样品(x)和标准磷(y)的含磷量 (μg)。
(4) 样品RNA含量：
样品RNA质量分数(%) RNA质量浓度( g / mL ) 100% 2000( g / mL )
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操作注意事项
1. 每人独立操作，不允许两人穿插取样； 2. 要求试剂及所有器皿清洁，不含磷； 3. 每管加样和测定均要求平行操作； 4. 消化溶液定容后务必上下颠倒混匀后再取样； 5. 各种试剂必须用移液管按顺序准确量取，移液管口用吸水 纸擦净，溶液尽量加到试管下部，标准溶液要求用差量法。 6. 漩涡混合器的使用：用点动档，试管竖直或稍倾斜垂直向 下用力。 7. 测定吸光值时，用一个比色杯装去离子水调节分光光度计 零点，另一个比色杯按照从低浓度到高浓度的顺序测定， 不用润洗，切忌甩比色杯，将蓝色溶液撒在仪器和地面上。
核酸含量测定
定磷法
1
核酸定量测定常见的方法
1. 定磷法：将核酸消化，测定其无机磷量，由此计算出核酸 含量，反应灵敏。 2. 紫外吸收法：利用核酸在260nm处有吸收高峰，操作简 便，受蛋白质和核苷酸的干扰影响。 3. 地衣酚法：用于测定RNA的含量，RNA与浓盐酸共热， 降解形成的核糖转变为糠醛，利用地衣酚反应来测定，特异 性差，戊糖均有此反应。 4. 二苯胺法：DNA中的脱氧核糖在酸性溶液中转化为ω -羟 -γ -酮基戊醛，利用二苯胺试剂反应，除脱氧木糖和阿拉伯 糖外其他糖类无此反应。
核酸的定量测定.
0
3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
2. 将试管内溶液立即摇匀，置沸水浴内25-30分钟。取 出冷却至室温，于670nm处测定OD值。
3. 以0-5号管RNA浓度为横坐标，对应光密度为纵坐标 ，绘出标准曲线。
4. 根据6号管测得的OD值，从标准曲线求出RNA待测 液浓度。
2. 在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏 度。除DNA外，脱氧木糖，阿拉伯糖（五碳糖 ）也有同样反应。其它多数糖类，包括核糖在 内，一般无此反应。
• 三、 实验步骤
• 1. 取同样规格的试管7支，按下表顺序分别精 确地加入各试剂。
编号
1
2
3
4
5
6
7
ห้องสมุดไป่ตู้
DNA标准液(200ug/mL) 蒸馏水(mL)
（一）琼脂糖凝胶电泳
用于大片段DNA或RNA的分离，精度低，但分 离范围广。
电泳迁移率决定于： （1）核酸分子的大小 （迁移率与相对分子质量对数成反比） （2）胶浓度 （迁移率与胶浓度成反比，常用0.7～1%） （3）DNA的构象：超螺旋＞线状分子＞开环状分子
（4）电压 （一般5V/cm,电压与迁移率成正比) （5）碱基组成（影响不大） （6）温度（4～30℃都可以，常室温进行）
0.00 0.00 4.00 2.00
Y X
2. 将试管内溶液立即摇匀，于70℃恒温水浴内保温5060分钟。取出冷却至室温，于595nm处测定OD值 。
3. 以1-6号管DNA含量（微克）为横坐标，光密度为纵 坐标，绘出标准曲线。
4. 根据7号管测得的OD值，从标准曲线求出DNA待测 液中的DNA含量。
B
2. 将试管内溶液立即摇匀，于45℃恒温水浴内保温3045分钟。取出冷却至室温，于660nm处测定OD(光密 度)值。
定磷法
核酸的定量测定——定磷法[原理]磷的测定方法很多，Fiske-Subbarow定磷法是一经典的但至今仍被经常采用的方法，它具有灵敏、简便的特点。
各种含磷有机物经硫酸或过氯酸水解，使有机磷消化成为无机磷。
无机磷在酸性条件下，与钼酸盐（常用钼酸铵或钼酸钠）反应生成磷钼酸盐络合物。
用还原剂处理，磷钼酸盐络合物被还原生成钼蓝，在660nm处有最大光吸收峰。
在一定浓度范围内，颜色的深浅与磷含量成正比关系。
因此可应用分光光度法进行磷的定量测定。
化学反应式：(NH4)2MoO4+ H2SO4→ H2MoO4+ (NH4)2SO4H 3PO4+ 12H2MoO4→ H3P (Mo3O10)4+ 12H2O还原剂H 3P (Mo3O10)4→ Mo2O3MoO3核酸是一类含磷化合物，其分子含有一定比例的磷，一般纯的RNA及其核苷酸含磷质量分数为9.0%；DNA及其核苷酸含磷质量分数为9.2%，即每 100g核酸含有9.0～9.2g磷，也就是核酸量是含磷量的11倍左右，故测得磷的量，即可求得核酸量。
这就是定磷法的理论依据，磷的定量测定是测定核酸含量常用手段之一。
生物有机磷材料中有时含有无机磷杂质，故用定磷法来测定该有机磷物质的量时，必须分别测定该样品的总磷量，即样品经过消化以后所测得的含磷量，以及该样品的无机磷含量，即样品未经消化直接测得的含磷量。
将总磷量减去无机磷才是该有机磷物质的含磷量。
[方法和步骤]1、磷标准曲线的绘制取试管7支，0～6依次编号。
按下表加入各试剂。
注意每加好一种试剂后应立即摇匀。
各反应液加毕后，于30℃保温20min，置分光光度计中在波长660nm比色，测光吸收值。
以磷含量为横坐标，光吸收值为纵坐标作图，即得定磷标准曲线。
2、总磷量的测定取30毫升凯氏烧瓶2只，Ⅰ、Ⅱ依次编号，Ⅰ号瓶为空白对照，用刻度吸管准确吸取核糖核酸样液1.0mL，置于Ⅱ号凯氏烧瓶内，Ⅰ号瓶加入蒸馏水 1.0mL，不加样液，两瓶分别加入6mol/L硫酸1.0mL置消化架用小火加热消化，待溶液呈褐色，稍加冷却，加入2 mol/L硝酸2滴，再继续加热，直至逸出白色烟雾，溶液无色透明，表示消化完成时为止。
生化实验课件-核酸的定量测定—定磷法
7.5，10，12.5，15 μg，加定磷試劑3ml後搖勻，45 ℃
放置20分鐘，測
。以O含D磷660量為橫坐標，
為
縱坐O標D製660作標準曲線。
2. 核酸中總磷量的測定：
取1ml被測樣品液（約含2.5—5mg核酸，也可取固 體樣品），置於消化瓶中，加入1ml濃硫酸及50mg催
化劑，在消化爐上加熱至發白煙，樣品由黑變成淡黃 色，取下稍冷，加數滴30%過氧化氫液，繼續加熱至
實驗七 核酸的定量測定—定磷法
一,原理 生物體內有許多含磷化合物，如核酸
（RNA,DNA）磷脂，ATP等。磷的測定方法很多，但在 生化研究中以比色法的應用最為廣泛，該法量微，快 速，準確。
核酸和核苷酸均為含鱗化合物，純的核酸喊磷量為 9%（RNA含磷量為8.5%--9.0%,DNA則含9.2%的磷）。從 核酸中測得了總磷量，就可知樣品中核酸的量，即每 測得1mg有機磷，就表示有11mg的核酸，這就是定磷法 的理論依據
在測定過程中，濃硫酸與核酸共熱使其轉變為無 機磷（此為消化過程），而無機磷與定磷試劑中的鉬 酸銨在酸性條件下反應生成磷鉬酸銨，它在還原劑作 用下被還原成深藍色的鉬藍（高價鉬被還原成低價 鉬），鉬藍在660nm初有最大光吸收峰。在一定的磷 濃度範圍內，藍色的深淺與磷含量成正比
生物有機磷材料中有時含有無機磷雜質，為了消 除無機磷的影響，應同時測定樣品中的總磷量和樣品 中的無機磷含量（樣品未經消化而直接測定的含磷 量）。從總磷量中減去無機磷量，才是樣品中的真正 磷含量。
有机磷量(g) D 11
樣品中核酸含量%=
测定时取样量(ml)
样品重量(g)
100
其中：有機磷量(μg)=總磷量—無機磷量
消化后定容体积(ml) D為稀釋倍數,即= 消化时取样体积(ml)
核酸含量测定——定磷法
12
思考题
1. 回收率的意义； 回收率的意义； 2. 实验所用的水质、试剂质量、定磷试剂的 实验所用的水质、试剂质量、 酸度对测定结果的影响。 酸度对测定结果的影响。
13
实验结束
将试管洗净，斜插在试管架上， 将试管洗净，斜插在试管架上，放在台 面上。 面上。 将消化管和橡皮塞洗净，放回原处。 将消化管和橡皮塞洗净，放回原处。 将比色杯洗净， 将比色杯洗净，放在实验台上的小平皿 中。 将实验台面擦干净。 将实验台面擦干净。
10
(1) 计算回收率： 计算回收率：
y × 50 回收率 = 0.15 ×100% 1000
x × 50 RNA总磷量 g / mL) = 1.5 ( 回收率
(2) 计算样品总磷量： 计算样品总磷量：
(3) 计算 计算RNA量： 量
RNA质量浓度（ g / mL) = 总磷量 无机磷量 DNA含量× 9.9% ×10.5 质量浓度（ （ ） ≈ 总磷量×10.5
核酸含量测定
定磷法
1
核酸定量测定常见的方法
1. 定磷法：将核酸消化，测定其无机磷量，由此计算出核酸 定磷法：将核酸消化，测定其无机磷量， 含量，反应灵敏。 含量，反应灵敏。 2. 紫外吸收法：利用核酸在260nm处有吸收高峰，操作简 紫外吸收法：利用核酸在260nm处有吸收高峰 处有吸收高峰， 受蛋白质和核苷酸的干扰影响。 便，受蛋白质和核苷酸的干扰影响。 3. 地衣酚法：用于测定RNA的含量，RNA与浓盐酸共热， 地衣酚法：用于测定RNA的含量 RNA与浓盐酸共热 的含量， 与浓盐酸共热， 降解形成的核糖转变为糠醛，利用地衣酚反应来测定， 降解形成的核糖转变为糠醛，利用地衣酚反应来测定，特异 性差，戊糖均有此反应。 性差，戊糖均有此反应。 4. 二苯胺法：DNA中的脱氧核糖在酸性溶液中转化为ω-羟 二苯胺法：DNA中的脱氧核糖在酸性溶液中转化为 中的脱氧核糖在酸性溶液中转化为ω 酮基戊醛，利用二苯胺试剂反应， -γ-酮基戊醛，利用二苯胺试剂反应，除脱氧木糖和阿拉伯 糖外其他糖类无此反应。 糖外其他糖类无此反应。
核酸含量测定 - 定磷法
核酸含量测定 - 定磷法
核酸含量测定是指通过一种叫做定磷法的方法来确定样品中
核酸的含量。
定磷法是一种常用的生化分析方法，通过测定
样品中含有的无机磷的量，来间接推测核酸的含量。
具体操作步骤如下：
1. 取少量待测样品。
2. 将样品加入到酸性溶液中，使细胞壁和膜完全破裂。
3. 加入含有机溶液的磷试剂，使形成可溶性的金黄色磷酸铵
铬(VI)盐。
4. 根据反应生成的黄色物质的吸收特性，在特定波长下用分
光光度计测量吸光度。
5. 根据构建的标准曲线，确定吸光度与磷含量之间的关系，
从而推测样品中核酸的含量。
需要注意的是，定磷法只能测定样品中的总核酸含量，无法
区分DNA和RNA的含量。
如果需要分别测定DNA和RNA，需要采用其他特异性方法，比如荧光比色法或者核磁共振法等。
核酸的定量测定——定磷法
二、实验用品
1、材料
新鲜动物肝脏
2、试剂
（1）Locke氏溶液：将NaCl 0.9g，KCl 0.042g，CaCl2 0.024g， NaHCO3 0.015g和葡萄糖0.1g溶于水中，稀释至100ml。 （2）0.5N丁酸溶液：取45ml正丁酸，用1N NaOH液中和至 pH=7.6，并用水稀释至1000ml。 （3）1/15M磷酸缓冲液（pH7.6）： ①1/15M KH2PO4：称9.78g KH2PO4溶于重蒸馏水，稀释到 1000ml； ②1/15 M Na2PO4：称11.876g Na2PO4· 2H2O溶于重蒸馏水。 稀释到1000ml。
四、实验结果
计算样品中丙酮的含量（X） X=（B－A）×0.9667×13÷5 式中： X=样品中丙酮含量； B=滴定对照液所消耗Na2S2O3液ml数； A=滴定样品液所消耗Na2S2O3液ml数； 1ml 0.1N Na2S2O3液相当于0.9667mg丙酮。
注意事项
肝糜必须新鲜，放置过久则失去氧化脂肪酸的能力。
3、保温毕，取出锥形瓶，各加入2 ml三氯醋酸， 在对照瓶中加入3 ml 0.5N丁酸，在样品瓶加入3 ml H2O混匀，静置15分钟，过滤。 4、另取两锥形瓶，分别量入5 ml滤液，5 ml 0.1N 碘液和5 ml 10%NaOH液，摇匀后，静置10分钟。加入 5 ml 10%盐酸液中和，用0.1N Na2S2O3液滴定剩余碘， 滴至浅黄色时，加入3滴淀粉液作指示剂，摇匀后并继 续滴到兰色消失。 5、记录滴定样品与对照所用Na2S2O3的毫升数。
2NaOH +I2─→NaOI +NaI +H2O CH3COCH3 +3NaOI ─→CHI3（碘仿）+CH3COONa +2NaOH 剩余的碘，可以用标准硫代硫酸钠滴定。 NaOI +NaI +2HCl ─→I2 +2NaCl +2H2O I2 +2Na2S2O3─→Na2S4O6 +2NaI
定磷法实验报告
一、实验目的1. 掌握定磷法测定核酸含量的原理与方法。
2. 通过实验操作，了解并掌握实验步骤，提高实验技能。
二、实验原理核酸分子中含有一定比例的磷，RNA中含磷量为9%，DNA中含磷量为9.2%。
因此，通过测定核酸中磷的量，即可求得核酸的量。
实验中，利用强酸使核酸分子中的有机磷消化成为无机磷，使之与钼酸铵结合成磷钼酸铵。
在还原剂存在的情况下，Mo6被还原成Mo4，再与试剂中的其他MoO42-结合成Mo(MoO4)2或Mo3O8，呈蓝色，称为钼蓝。
在一定浓度范围内，蓝色的深浅与磷含量成正比，可用比色法测定。
样品中如有无机磷，应将无机磷扣除，否则结果偏高。
三、实验器材1. 粗核酸2. 克氏烧瓶50ml3. 小漏斗4cm4. 容量瓶100ml、50ml5. 吸管6. 试管X18cm7. 722型或XX型分光光度计8. 电炉9. 水浴锅四、实验试剂1. 标准磷溶液：将磷酸二氢钾于100烘至恒重，准确称取溶于少量蒸馏水中，转移至500ml容量瓶中，加入5ml5mol/L硫酸溶液及氯仿数滴，用蒸馏水稀释至刻度，此溶液每毫升含磷400g。
临用时准确稀释20倍。
2. 定磷试剂：17％硫酸、％钼酸铵五、实验步骤1. 称取一定量的粗核酸，溶解于少量蒸馏水中。
2. 将溶液转移至克氏烧瓶中，加入适量浓硫酸，进行消解。
3. 将消解后的溶液转移至容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。
4. 吸取一定量的溶液，加入定磷试剂，进行比色测定。
5. 重复步骤4，绘制标准曲线。
6. 根据标准曲线，计算样品中核酸的含量。
六、实验结果与分析1. 标准曲线绘制：根据标准磷溶液的浓度，绘制标准曲线。
2. 样品中核酸含量的测定：根据样品溶液的吸光度，从标准曲线上查得相应的磷含量。
3. 核酸含量的计算：根据核酸与磷的摩尔比，计算样品中核酸的含量。
七、实验总结通过本次实验，我们掌握了定磷法测定核酸含量的原理与方法，提高了实验技能。
在实验过程中，需要注意以下几点：1. 实验操作要规范，确保实验结果的准确性。
实验八核酸的定量测定——定磷法(精)
钼兰（Mo4+）兰色
钼兰在一定浓度范围内(无机磷含量在1—25μg范围内)。兰色的深浅和磷酸的含 量成正比（660nm），可用比色法测定其光吸收值。 1、标准曲线的制作 2、总磷的测定 3、无机磷的测定
▪用强酸使核酸分子中的有机磷消化成无机磷
▪无机磷再与钼酸铵结合成磷钼酸铵。
PO43- + 3NH4 + + 12MoO4 2- + 24H+ (NH4)3PO4·12MoO3·6H2O↓(黄色)+6H2O
实验八 核酸的定量测定 ——定磷法
Exp.8 Determination of Nucleic Acid by Inorganic Phosphate Assay
核酸定量测定常见的方法
1. 定磷法：将核酸消化，测定其无机磷量，由此计算出核酸 含量，反应灵敏。
2. 紫外吸收法：核酸及其衍生物，核苷酸、核苷、嘌呤和嘧 啶由于其共轭双键系统，都具有吸收紫外线的性质，最大吸 收峰在260nm波长处。
一、实验原理 核酸分子中含有一定比例的有机磷，一般为9.5%左右(RNA含 磷量约9.0%，DNA含磷量约为9.2%)，若测得某一核酸样品中有 机磷的含量，即可推算其核酸的含量。
核酸的消化：用强酸使核酸分子中的有机磷消化成无机磷
强酸消化
钼酸铵
核酸中的有机无机磷酸
无机磷酸
磷钼酸铵（Mo6+）
还原剂（抗坏血酸等）
3. 苔黑酚（地衣酚）法：用于测定RNA的含量 RNA与浓盐酸共热， 降解形成的核糖转变为
糠醛，后者与地衣酚（3,5-二羟甲苯）作用生成 绿色化合物，在670nm处有最大吸收，RNA浓 度在10~100微克/毫升范围内，光密度与RNA的 浓度成正比关系。
定磷法测定核酸的含量
定磷法测定核酸的含量核酸, 含量, 测定【实验目的】掌握定磷法测定核酸含量的原理和方法【实验原理】核酸分子结构中含有一定比例的磷(RNA含磷量约为8.5%~9.0%，DNA含磷量约为9.2%)，测定其含磷量即可求出核酸的量。
核酸分子中的有机磷经强酸消化后形成无机磷，在酸性条件下,无机磷与钼酸铵结合形成黄色磷钼酸铵沉淀，其反应为：在还原剂存在的情况下,黄色物质变成蓝黑色,称为钼蓝。
在一定浓度范围内，蓝色的深浅与磷含量成正比，可用比色法测定。
若样品中尚含有无机磷，需作对照测定，消除无机磷的影响，以提高准确性。
【实验材料】1.实验器材恒温水浴,721分光光度计2.实验试剂（1）标准磷溶液：将磷酸二氢钾于110℃烘至恒重，准确称取0.8775g溶于少量蒸馏水中，转移至500ml 容量瓶中，加入5ml5mol／L硫酸溶液及氯仿数滴，用蒸馏水稀释至刻度。
此溶液每1m1含磷400μg，临用时准确稀释20倍(20μg／m1)。
（2）定磷试剂①17％硫酸：17m1浓硫酸(相对密度l.84)缓缓加入到83m1水中。
②2.5％钼酸铵溶液：2.5g钼酸铵溶于100ml水。
③10％抗坏血酸溶液：10g抗坏血酸溶于100ml水，并贮存于棕色瓶中，溶液呈淡黄色尚可使用，呈深黄甚至棕色即失效。
临用时将上述三种溶液与水按如下比例混合：溶液(1):溶液(2):溶液(3):水=1:1:1:2(V:V)（3）5%氨水,27%硫酸【实验操作】1．磷标准曲线的绘制取干燥试管7支编号，按表所示加入试剂。
试剂管号0123456磷标准溶液，ml0.00.050.10.20.30.40.5蒸馏水，定磷试剂加毕摇匀，在45℃水浴中保温10min，冷却，以零号管调零点，于660nm处测吸光度。
以磷含量为横坐标，吸光度为纵坐标作图。
2．总磷的测定称粗核酸0.1g，用少量水溶解(若不溶，可滴加5%氨水至pH7.0)，待全部溶解后，移至50ml容量瓶中，加水至刻度(此溶液含样品2mg/m1)，即配成核酸溶液。
核酸含量测定 - 定磷法共19页文档
12、法律是无私的，对谁都一视同仁。在每件事上，她都不徇私情。—— 托马斯
13、公正的法律限制不了好的自由，因为好人不会去做法律不允许的事 情。——弗劳德
14、法律是为了保护无辜而制定的。——爱略特 15、像房子一样，法律和法律都是相互依存的。——伯克
41、学问是异常珍贵的东西，从任何源泉吸 收都不可耻。——阿卜·日·法拉兹
42、只有在人群中间，才能认识自 己。——德国
43、重复别人所说的话，只需要教育； 而要挑战别人所说的话，则需要头脑。—— 玛丽·佩蒂博恩·普尔
44、卓越的人一大优点是：在不利与艰 难的遭遇里百折不饶。——贝多芬
45、自己的饭量自己知道。——苏联
核酸的定量测定.
二、计算公式
ΔA260
RNA浓度 =
xN
0.024 x L
式中， ΔA260为甲管稀释液在260nm波长处A值减去乙管稀释 液在260nm波长处A值；
L ──比色杯的厚度，1cm；
N ——为稀释倍数；
0.024──每毫升溶液内含1μgRNA的A值；
1mL待测样品液中核酸（微克）
核酸％ ＝
1mL待测样品液中制品的毫克数
（一）琼脂糖凝胶电泳
用于大片段DNA或RNA的分离，精度低，但分 离范围广。
电泳迁移率决定于： （1）核酸分子的大小 （迁移率与相对分子质量对数成反比） （2）胶浓度 （迁移率与胶浓度成反比，常用0.7～1%） （3）DNA的构象：超螺旋＞线状分子＞开环状分子
（4）电压 （一般5V/cm,电压与迁移率成正比) （5）碱基组成（影响不大） （6）温度（4～30℃都可以，常室温进行）
2. 钼蓝最大的光吸收在650—660nm波长处。 当使用维生素C为还原剂时，测定的最适范围 为1-10微克无机磷。
3. 测定样品核酸总磷量，需先将它用硫酸或过 氯酸消化成无机磷再行测定。总磷量减去未 消化样品中测得的无机磷量，即得核酸含磷 量。
4. RNA的理论含磷量为9.5%，故由所测的核 酸含磷量可计算出核酸含量。
地衣酚法
二、实验原理
1. 当RNA与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的 核糖转变成醛类，后者与3，5-二羟基甲苯（ 地衣酚）反应，在Fe3+或Cu2+催化下，生成鲜 绿色复合物。反应产物在670nm处有最大光 吸收。
2. RNA浓度在20—250μg/ml范围内，光吸收与 RNA浓度成正比。
地衣酚法特异性差，凡戊糖均有此反应，DNA 和其他杂质也能与地衣酚反应产生类似颜色。
定磷法的实验报告
定磷法的实验报告
《定磷法的实验报告》
在本次实验中，我们将探讨定磷法在土壤养分检测中的应用。
定磷法是一种常用的土壤养分检测方法，通过测定土壤中的有效磷含量，可以帮助农民合理施肥，提高农作物产量。
首先，我们收集了不同地点的土壤样品，并进行了样品的预处理工作。
然后，我们按照定磷法的操作规程，利用硫酸铵钴铵法测定了土壤中的有效磷含量。
实验结果显示，不同地点的土壤中有效磷含量存在较大差异，这为我们提供了重要的数据支持，可以为农民提供科学的施肥建议。
定磷法的实验结果为我们提供了有效的土壤养分信息，这对于农作物的生长发育至关重要。
通过定磷法的应用，农民可以根据土壤中的有效磷含量，科学施用磷肥，提高土壤肥力，增加农作物产量，实现可持续农业发展。
总的来说，定磷法在土壤养分检测中具有重要的应用价值。
通过本次实验，我们深刻认识到了定磷法在农业生产中的重要性，相信定磷法将为我国农业生产带来更大的发展空间。
希望通过我们的努力，定磷法能够更广泛地应用于农业生产中，为我国农业的可持续发展做出更大的贡献。
核酸的定量测定-定磷法
核酸的定量测定-定磷法1st Edition, revised in March, 2020(本试剂盒仅供体外研究使用,不用于临床诊断!生物素(Biotin定量测定试剂盒使用说明书Biotin quantitative detection kit 产品货号:EBD0325 有效期:12个月使用前请仔细阅读说明书。
如果有任何问题,请通过以下方式联系我们: 全国免费400-660-4808 销售部027-******** 技术部027-******** 电子邮箱(销售QQ 客服联系时请提供产品货号(见试剂盒标签,以便我们更高效地为您服务。
生物素(Biotin定量测定试剂盒使用说明书产品货号:EBD0325(本试剂盒仅供体外研究使用、不用于临床诊断!声明:尊敬的客户,感谢您选用本公司的产品。
本产品适用于体外定量检测血清、血浆、乳制品或其它相关生物液体中生物素浓度。
使用前请仔细阅读说明书并检查试剂组分!如有疑问,请及时联系伊莱瑞特生物科技。
试剂盒组成:特别说明:*: [96T/48T](打开包装后请及时检查所有物品是否齐全完整#:一周内使用可存于4℃,需长时间存放或多次使用建议存于-20℃.相关试剂在分装时会比标签上标明的体积稍多一些,请在使用时量取而非直接倒出!检测原理:本试剂盒采用竞争法。
用生物素包被于酶标板上,实验时样品或标准品中的生物素与包被的生物素竞争辣根过氧化物酶标记的亲和素(Avidin-HRP上的结合位点,生物素与亲和素特异性结合而形成复合物,游离的成分被洗去。
加入显色底物(TMB,TMB在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色,加终止液后变成黄色。
用酶标仪在450nm波长处测OD值,生物素浓度与OD450值之间呈反比,通过绘制标准曲线计算出样品中生物素的浓度。
试验所需自备物品:1.酶标仪(450nm波长滤光片2.高精度移液器,EP管及一次性吸头:0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL3.37℃恒温箱,双蒸水或去离子水4.吸水纸检测前准备工作:1.请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒,平衡至室温。
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4. 二苯胺法：DNA中的脱氧核糖在酸性溶液中转化为ω羟-γ-酮基戊醛，利用二苯胺试剂反应生成蓝色化合物，在 595nm处有最大吸收，DNA浓度在20~200微克/毫升范围 内，光密度与DNA的浓度成正比关系。
Hale Waihona Puke 注意事项： 除脱氧木糖和阿拉伯糖外其他糖类无此反应。其他多数糖类， 包括核糖在内，一般无此反应。
表1.无机磷标准曲线的绘制
2、总磷的测定
准确称取样品（如粗核酸）0.1克，用少量水溶解，（如不溶， 可滴加5%氨水调至pH7.0），转移至50ml凯氏烧瓶中,加水至刻度。
吸取上面的样品液 1.0mL，置于 50ml 凯氏烧瓶中，加入 2.5 毫升 10mol/L H2SO4，将凯氏烧瓶接在凯氏消化架上（或在通风橱内）， 在电炉上加热，至溶液透明，表示消化完成。冷却，将消化液移 入100ml容量瓶中，用少量蒸馏水洗涤凯氏烧瓶两次，洗涤液一并
（6）标准无机磷储备液（含磷量1mg/1ml）
将磷酸二氢钾（A· R）于110℃烘至恒重（一般需4 小时以上），然后置于干燥器内冷却。用分析天平精 确称取1.0967克，定溶至250ml。此液为储备液，放 入冰箱内保存，用时再稀释。
3、仪器设备
恒温水箱 分光光度计
三、方法和步骤
1、标准曲线的制作 吸取0.5 ml标准无机磷储备液于 50 ml容量瓶中，用蒸馏水稀释 至刻度，配制成含磷量10 ug/1ml的标准无机磷溶液。 取6支试管，编号，按表内要求，加入标准磷溶液蒸馏水及定 磷试剂。加毕摇匀，于45℃水浴保温15分钟，冷却，用721型分 光光度计分别测定其光吸收值（A660nm）。
优点：简单、快速、灵敏度高（可达3μg/ml的检测水平）。 缺点： 受蛋白质和核苷酸的干扰影响。
蛋白质由于含有芳香氨基酸，也能吸收紫外光。蛋白质的吸收峰在 280nm与260nm处的光密度仅为核酸的1/10或更低，因此核酸样品只能 够蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。核苷酸同理。 该法在测定样品内混杂有大量的上述吸收紫外光物质时，则会产生较 大测定误差，需要设法事先除去 。
(NH4)3PO4· 12MoO3· 6H2O↓ 还原剂（抗坏血酸） 钼兰Mo(MoO4)2或Mo2O8
二、实验用品 1、材料 粗核酸（酵母核糖核酸，含磷量大于7%） 2、试剂 (1) 6 mol/L H2SO4溶液 （2）10 mol/L H2SO4溶液 （3）2.5%钼酸铵溶液 （4）10%抗坏血酸溶液 (5) 定磷试剂 在使用前将上述试剂按以下比例混合 , 蒸馏水： 6N H2SO4： 2.5%钼酸铵：10%抗坏血酸=2：1：1：1（V/V）。
表2 总磷和无机磷的测定
四、实验结果
总磷A660nm－无机磷A660nm= 有机磷A660nm
由标准曲线查得有机磷微克数（X）。按下试计算样品中核酸百分含 量。
( X / 测定时取样的ml数 ) ×稀释倍数 × 11 核酸% = —————————————————×100% 样品重量(ug)
注意事项 试剂及所有器皿清洁，不含磷； 消化溶液定容后务必上下颠倒混匀后再取样。
3. 苔黑酚（地衣酚）法：用于测定RNA的含量 RNA与浓盐酸共热， 降解形成的核糖转变为 糠醛，后者与地衣酚（3,5-二羟甲苯）作用生成 绿色化合物，在670nm处有最大吸收，RNA浓 度在10~100微克/毫升范围内，光密度与RNA的 浓度成正比关系。
注意事项： 1．地衣酚反应特异性较差，凡戊糖均有此反应，DNA及 其他杂质也有影响。故一般测定RNA时，可先测定样品 中DNA含量，再算出RNA含量。 2．本法较灵敏。样品中蛋白质含量高时，应先用5%三氯 醋酸溶液将蛋白质沉淀后再测定，否则将发生干扰。
倒入容量瓶，再加水至刻度。
混匀后，吸取 3.0ml 置于试管中，加定磷试剂 3.0ml，摇匀， 45℃保温15分钟，冷却。测其A660nm。
3、无机磷的测定 吸取样品液（2mg/1ml）1.0 ml，置于100 ml容 量瓶中，加水至刻度，摇匀后，吸取3.0 ml置于试 管中，加定试剂3.0 ml，45℃水浴保温15分钟，冷 却，测其光吸收值。
五、思考题
1．指出测定核酸含量的几种方法，并进行比较 各自的优缺点？ 2．除了样品溶液消化至透明，表示消化完成外， 还可以用何种方法来分析判断？
六、参考文献
1.现代生物学基础实验指导,林宏辉等,四川大学出版社,2003
2.生物化学实验原理和方法,李建武等编,北京大学出版社1994年 3.The tools of Biochemistry,Terrance G,Cooper,1977
一、实验原理 核酸分子中含有一定比例的有机磷，一般为9.5%左右(RNA含 磷量约9.0%，DNA含磷量约为9.2%)，若测得某一核酸样品中有 机磷的含量，即可推算其核酸的含量。
核酸的消化：用强酸使核酸分子中的有机磷消化成无机磷
强酸消化 钼酸铵
核酸中的有机无机磷酸
还原剂（抗坏血酸等）
无机磷酸
磷钼酸铵（Mo6+）
钼兰（Mo4+）兰色
钼兰在一定浓度范围内(无机磷含量在1—25μg范围内)。兰色的深浅和磷酸的含 量成正比（660nm），可用比色法测定其光吸收值。 1、标准曲线的制作 2、总磷的测定 3、无机磷的测定
▪用强酸使核酸分子中的有机磷消化成无机磷
▪无机磷再与钼酸铵结合成磷钼酸铵。 PO43- + 3NH4 + + 12MoO4 2- + 24H+ (NH4)3PO4· 12MoO3· 6H2O↓(黄色)+6H2O ▪ 当有还原剂存在时，Mo6+被还原成Mo4+，此4价钼再 与试剂中的其它MoO42－结合成Mo(MoO4)2或Mo3O8呈兰 色，称为钼兰。
实验八 核酸的定量测定 ——定磷法 Exp.8 Determination of Nucleic Acid by Inorganic Phosphate Assay
核酸定量测定常见的方法
1. 定磷法：将核酸消化，测定其无机磷量，由此计算出核酸 含量，反应灵敏。 2. 紫外吸收法：核酸及其衍生物，核苷酸、核苷、嘌呤和嘧 啶由于其共轭双键系统，都具有吸收紫外线的性质，最大吸 收峰在260nm波长处。