实验八核酸的定量测定——定磷法(精)

表2 总磷和无机磷的测定
源自文库
四、实验结果
总磷A660nm－无机磷A660nm= 有机磷A660nm
由标准曲线查得有机磷微克数（X）。按下试计算样品中核酸百分含 量。
( X / 测定时取样的ml数 ) ×稀释倍数 × 11 核酸% = —————————————————×100% 样品重量(ug)
注意事项 试剂及所有器皿清洁，不含磷； 消化溶液定容后务必上下颠倒混匀后再取样。
钼兰（Mo4+）兰色
钼兰在一定浓度范围内(无机磷含量在1—25μg范围内)。兰色的深浅和磷酸的含 量成正比（660nm），可用比色法测定其光吸收值。 1、标准曲线的制作 2、总磷的测定 3、无机磷的测定
▪用强酸使核酸分子中的有机磷消化成无机磷
▪无机磷再与钼酸铵结合成磷钼酸铵。 PO43- + 3NH4 + + 12MoO4 2- + 24H+ (NH4)3PO4· 12MoO3· 6H2O↓(黄色)+6H2O ▪ 当有还原剂存在时，Mo6+被还原成Mo4+，此4价钼再 与试剂中的其它MoO42－结合成Mo(MoO4)2或Mo3O8呈兰 色，称为钼兰。
一、实验原理 核酸分子中含有一定比例的有机磷，一般为9.5%左右(RNA含 磷量约9.0%，DNA含磷量约为9.2%)，若测得某一核酸样品中有 机磷的含量，即可推算其核酸的含量。
核酸的消化：用强酸使核酸分子中的有机磷消化成无机磷
强酸消化 钼酸铵
核酸中的有机无机磷酸
还原剂（抗坏血酸等）
无机磷酸
磷钼酸铵（Mo6+）

4. 二苯胺法：DNA中的脱氧核糖在酸性溶液中转化为ω羟-γ-酮基戊醛，利用二苯胺试剂反应生成蓝色化合物，在 595nm处有最大吸收，DNA浓度在20~200微克/毫升范围 内，光密度与DNA的浓度成正比关系。
注意事项： 除脱氧木糖和阿拉伯糖外其他糖类无此反应。其他多数糖类， 包括核糖在内，一般无此反应。

(NH4)3PO4· 12MoO3· 6H2O↓ 还原剂（抗坏血酸） 钼兰Mo(MoO4)2或Mo2O8
二、实验用品 1、材料 粗核酸（酵母核糖核酸，含磷量大于7%） 2、试剂 (1) 6 mol/L H2SO4溶液 （2）10 mol/L H2SO4溶液 （3）2.5%钼酸铵溶液 （4）10%抗坏血酸溶液 (5) 定磷试剂 在使用前将上述试剂按以下比例混合 , 蒸馏水： 6N H2SO4： 2.5%钼酸铵：10%抗坏血酸=2：1：1：1（V/V）。
倒入容量瓶，再加水至刻度。
混匀后，吸取 3.0ml 置于试管中，加定磷试剂 3.0ml，摇匀， 45℃保温15分钟，冷却。测其A660nm。
3、无机磷的测定 吸取样品液（2mg/1ml）1.0 ml，置于100 ml容 量瓶中，加水至刻度，摇匀后，吸取3.0 ml置于试 管中，加定试剂3.0 ml，45℃水浴保温15分钟，冷 却，测其光吸收值。
实验八 核酸的定量测定 ——定磷法 Exp.8 Determination of Nucleic Acid by Inorganic Phosphate Assay
核酸定量测定常见的方法


1. 定磷法：将核酸消化，测定其无机磷量，由此计算出核酸 含量，反应灵敏。 2. 紫外吸收法：核酸及其衍生物，核苷酸、核苷、嘌呤和嘧 啶由于其共轭双键系统，都具有吸收紫外线的性质，最大吸 收峰在260nm波长处。

3. 苔黑酚（地衣酚）法：用于测定RNA的含量 RNA与浓盐酸共热， 降解形成的核糖转变为 糠醛，后者与地衣酚（3,5-二羟甲苯）作用生成 绿色化合物，在670nm处有最大吸收，RNA浓 度在10~100微克/毫升范围内，光密度与RNA的 浓度成正比关系。
注意事项： 1．地衣酚反应特异性较差，凡戊糖均有此反应，DNA及 其他杂质也有影响。故一般测定RNA时，可先测定样品 中DNA含量，再算出RNA含量。 2．本法较灵敏。样品中蛋白质含量高时，应先用5%三氯 醋酸溶液将蛋白质沉淀后再测定，否则将发生干扰。
优点：简单、快速、灵敏度高（可达3μg/ml的检测水平）。 缺点： 受蛋白质和核苷酸的干扰影响。
蛋白质由于含有芳香氨基酸，也能吸收紫外光。蛋白质的吸收峰在 280nm与260nm处的光密度仅为核酸的1/10或更低，因此核酸样品只能 够蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。核苷酸同理。 该法在测定样品内混杂有大量的上述吸收紫外光物质时，则会产生较 大测定误差，需要设法事先除去 。
五、思考题
1．指出测定核酸含量的几种方法，并进行比较 各自的优缺点？ 2．除了样品溶液消化至透明，表示消化完成外， 还可以用何种方法来分析判断？
六、参考文献
1.现代生物学基础实验指导,林宏辉等,四川大学出版社,2003
2.生物化学实验原理和方法,李建武等编,北京大学出版社1994年 3.The tools of Biochemistry,Terrance G,Cooper,1977
（6）标准无机磷储备液（含磷量1mg/1ml）
将磷酸二氢钾（A· R）于110℃烘至恒重（一般需4 小时以上），然后置于干燥器内冷却。用分析天平精 确称取1.0967克，定溶至250ml。此液为储备液，放 入冰箱内保存，用时再稀释。
3、仪器设备
恒温水箱 分光光度计
三、方法和步骤
1、标准曲线的制作 吸取0.5 ml标准无机磷储备液于 50 ml容量瓶中，用蒸馏水稀释 至刻度，配制成含磷量10 ug/1ml的标准无机磷溶液。 取6支试管，编号，按表内要求，加入标准磷溶液蒸馏水及定 磷试剂。加毕摇匀，于45℃水浴保温15分钟，冷却，用721型分 光光度计分别测定其光吸收值（A660nm）。
表1.无机磷标准曲线的绘制
2、总磷的测定
准确称取样品（如粗核酸）0.1克，用少量水溶解，（如不溶， 可滴加5%氨水调至pH7.0），转移至50ml凯氏烧瓶中,加水至刻度。
吸取上面的样品液 1.0mL，置于 50ml 凯氏烧瓶中，加入 2.5 毫升 10mol/L H2SO4，将凯氏烧瓶接在凯氏消化架上（或在通风橱内）， 在电炉上加热，至溶液透明，表示消化完成。冷却，将消化液移 入100ml容量瓶中，用少量蒸馏水洗涤凯氏烧瓶两次，洗涤液一并