课件--第六章 电泳仪

第六章电泳仪(Electrophoresister, EP)(一)、引言：1、现代生命科学研究的方法：分两类。

(1) 形态结构学方法：即把生物组织切片，用各类显微镜电镜等观察切面内的形态和结构，然后研究并总结其中规律。

(2) 生物化学方法：即用分离分析仪器对生物样品组分进行分离，然后用光谱、X光衍射等技术，对各类组分的结构、功能、和物理化学性质进行分析。

2、生命物质的分离技术：常用的有三类，即离心、电泳和层析技术。

支持介质中的带电颗粒，在电场作用下向与其荷电极性相反的电极移动的现象。

3、分离原理：(1) 电泳：带电颗粒(2) 层析：根据颗粒吸附性和摩擦系数进行分离。

(3) 离心：样品质量、密度4、适用性：* 离心方法：适于大量样品粗提纯。

* 电泳和层析：用于小量样品分析性分离。

(二)、电泳1、概念：* 应用：常用于蛋白质和核酸的分离、鉴定及定量分析等。

2、电泳的早期历史1809年：俄国Reuss进行了第一次电泳实验。

1937年：瑞典Tiselius观察了卵白蛋白的电泳迁移过程，用电泳方法证明血清是由白蛋白、 、 和 球蛋白组成的。

为此在1948年荣获诺贝尔化学奖。

* 早期电泳技术和装置的发展：Tiselius于1937年用移动界面电泳方法分离蛋白质，称为自由电泳。

此后几十年，发展了采用不同支持物的电泳技术，如滤纸电泳、醋酸纤维素膜电泳、凝胶电冰等。

各种类型的电泳仪器也不断出现。

* 仪器类型：按操作可分为手工、半自动、全自动等类型。

第一节电泳仪器的工作原理* 电泳原理：许多分子具有可电离基团，在溶液中能形成正、负离子。

(1)缓冲液A、B中各放一电极接直流电源，则两电极间形成一恒定电场。

A、B间用预先被缓冲液浸泡至饱和的支持介质联接，形成一个“桥”。

(2)将电泳的样品液滴在支持介质上。

则在电场作用下，样品中带正(负)电的颗粒移向负(正)极。

(3)在样品的各种离子到达电极之前关闭电源，则样品的各种成分便按照它们的电泳迁移率被分离开。

(一)影响电泳移动速度的若干因素：1、电荷：分子的净电荷越大，其移动速度越高。

2、分子的大小：分子越大，移动越慢。

3、支持介质的性质：孔径：小孔径的有分子筛的作用，能依分子大小或带电不同等分离分子；即具有“筛分”分子的作用。

粘性：阻碍泳动并起吸附作用。

4、电场强度：电压越高，分子的移动速度越大。

5、缓冲液离子强度：离子强度高，则移动速度慢，电泳区带窄而清晰；离子强度低，则移动速度快，电泳区带宽而边缘模糊。

6、温度：温度升高，则泳动速度加快。

(二)迁移率的数学推导1、粒子移动速度：电场中粒子受到的电场力：F=qE粒子运动时受到的阻力，满足stokes 公式：F’=6πηrv式中r 为粒子的半径， 为介质的粘度系数。

当两力平衡时，粒子作匀速泳动，由F =F ’得：v=qE/6πηr2、粒子的迁移率： 指带电粒子在单位电场强度下的迁移速度，可用下式表示： 式中： v －粒子的迁移速度(cm/s)； u －迁移率；d －粒子迁移距离(cm)； E －电场强度或电势梯度(V/cm)； t －通电时间(s)； U －加在支持物两端的实际电压(V)； L －支持物的有效长度(cm)。

(三)电泳的应用－正常人的血清电泳图谱1、原理：血清蛋白中含有α1、α2、β、γ球蛋白等。

不同成分的物质，其颗粒大小、带电量及重量均不一样，故它们迁移率不同。

相同成分的物质，其迁移率很接近，泳动时形成一条带状。

2、方法：把血清蛋白放在支持介质上电泳，一段时间后，迁移率最大的清蛋白移动距离最大，其余依次为α1、α2、β、γ球蛋白排列。

这样各种蛋白质就被分离开来。

3、组分含量测定：方法有多种。

(1)比色测定—血清蛋白电泳后，分离出5条蛋白区带。

将电泳后滤纸烘干、染色，可看见几条色带。

剪下各色带，分别溶于脱色剂，再做比色测定，可求得各种蛋白质所占百分率。

(2)光密度扫描仪测定—烘干染色后的滤纸用扫描仪测吸光度，以吸光度为纵坐标，滤纸的长度为横坐标，绘出电泳图形。

图中每一峰代表一种蛋白质，用面积仪测峰面积，则各峰面积对总面积的百分数，就是各种蛋白质所占的质量百分比。

第二节 电泳技术的基本类型一、电泳类型* 根据工作原理：可分为区带、移动界面、等电聚焦、等速、免疫电泳等；Ut dL L U t d E v u ===//* 根据载体的性质：可分为滤纸、醋酸纤维膜、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶电泳等；* 根据支持载体的位置或形状：可分为水平、垂直、板状、柱状、U型管、倒V字形、毛细管电泳等；* 根据使用目的：可分为核酸、血清蛋白、制备、DNA测序电泳等；* 根据用法：可分为双向、交叉、连续纸电泳、电泳-层析相结合技术等。

几个基本概念：* 自由电泳：指在自由溶液中直接进行、而不需支持介质的电泳。

* 区(条)带电泳：指大分子物质在特殊介质中(如滤纸等)电泳后，支持物上可呈现出不同的条带图谱；其应用最广泛。

* 支持介质：是样品电泳的场所；其种类很多；本章主要介绍需要载体的电泳技术。

二、常用的电泳方法(一)滤纸电泳1、装置：用滤纸作为支持载体，水平架在两个装有缓冲溶液的容器间，样品点于滤纸中央。

当滤纸被缓冲液润湿后，盖上绝缘密封罩，即可输入直流电压进行电泳。

2、特点：(1)电压愈高，带电粒子迁移速度愈快，样品分离时间愈短。

(2)装置简单，分离效果较好。

(二) 凝胶电泳是指用凝胶物质作支持物的区带电泳。

常用凝胶为葡聚糖、聚丙烯酰胺和琼脂糖。

其中琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳应用最多。

* 琼脂糖凝胶电泳：特点：(1) 区带易染色，干燥后背景几乎无色，便于光密度扫描检测。

可用于分离血清蛋白、血红蛋白、脂蛋白等。

(2) 电泳速度快，血清样品无需处理即可直接加样进行检测。

* 聚丙烯酰胺凝胶电泳：可将血清蛋白分离出20多条区带，广泛用于分析某些蛋白质及较小分子的核酸。

(三)等电聚焦电泳1、蛋白质的等电点pI对两性蛋白质，其分子表面带有COO-羧基和NH3+氨基，当溶液酸碱度在某pH值时，分子所带正、负电荷相同(即净电荷为零)，这时蛋白质分子在电场中不会移动，此pH值称为该蛋白质的等电点pI。

(1) pH<pI时：溶液相对于等电点呈酸性，蛋白质带正电，在电场中向负极移动。

(2) pH>pI时：溶液相对于等电点呈碱性，蛋白质带负电，在电场中向正极移动。

2、等电聚焦概念设溶液的pH值是位置的函数，则在一个线性pH梯度的溶液中电泳时，样品中每种被分离的两性物质、在移向与它的等电点一致的pH位置后，便不再移动，称为聚焦。

因这点净电荷正负抵消为零，故又称为等电聚焦。

3、等电聚焦电泳特点(1)条带狭窄，很小样品也能获得清晰的区带界面。

(2)适用于中、大分子量生物组分，如蛋白质的分离。

(3)分辨率高。

(4)电泳速度快。

(四)等速电泳1、方法：在内径250～500 m毛细管内，采用两种不同缓冲液，一为前导缓冲液，其迁移率高于任何样品组分；另一为尾随缓冲液，其迁移率低于所有样品组分。

加电场后，前导液中离子迁移率大，速度快，冲在最前面，紧接的是样品中迁移率最大的组分；以此类推，排最后的是尾随液的离子。

结果各组分的离子形成各自独立的区带而分离。

分离完毕后，各区带都以同一个速度向前移动。

2、特点：(1)所有谱带以同一速度移动。

(2)区带锐化，界面清晰，分离能力强。

(3)区带浓缩，即各区带内离子的浓度为定值。

(五)免疫电泳是将电泳和免疫反应相结合的分析方法。

先利用电泳将蛋白质组分分离，再分别与抗体反应进行检测分析。

常用的免疫电泳技术包括：1、免疫扩散电泳：用于纯化抗原和抗体成分的分析、体液蛋白质的识别分析等。

2、对流免疫电泳：常用于以已知抗体检测相应的抗原。

3、火箭免疫电泳：在抗体量不变时，火箭峰的高度与抗原量成正比。

4、免疫固定电泳：常用于M蛋白的分型鉴定。

(六)、其他电泳方法和技术1、醋酸纤维素膜电泳以醋酸纤维素膜为支持物，电泳结束经染料染色后，用适当试剂使醋酸纤维素膜透明，然后用光密度仪扫描测定。

* 特点：分离速度快，且透明后可长时间保存。

2、淀粉胶电泳可根据表面电荷及分子量不同、用于分离大分子物质。

先根据待分离物所带电荷不同、进行第一向电泳，然后根据分子量大小、进行方向与第一向垂直的第二向电泳。

3、双向电泳* 特点：(1)可多次获得相同的印迹复本，做多次分析鉴定。

(2)灵敏性高，试剂用量少，速度快，操作简便。

4、毛细管电泳是指在极细的毛细管内所进行的各种形式的电泳。

第三节电泳仪器的基本结构分为电源、电泳槽及结果测定分析三个部分。

一、电源作用是建立电泳电场。

而电场与电压有关，一般可分为：* 常压电泳：100～500V，场强1～10V/cm，分离时间较长。

* 高压电泳：500～10kV，场强20～200V/cm，分离时间短。

常用的电泳电源有：1、普通直流电源由整流电路和滤波电路组成。

交流电经变压器变压和整流经滤波后，供给电泳槽。

优点：结构简单、成本低。

缺点：波动较大。

所以现在很少用。

2、直流稳压电源指交流电压或负载电流变化时，输出电压保持不变的电源。

3、直流稳流电源指当输入的电网电压、负载电流及温度发生变化时，输出电流保持不变的电源。

优点：可减少温度波动对电泳的影响。

类型：有两端式、四端式、以及反馈式稳流电源等。

4、双稳电源指输出电压和电流皆稳定的电泳电源。

5、三恒电源指输出电压、电流、功率皆稳定的电源。

6、三恒电源的工作过程共分三个阶段。

等电聚焦电泳过程中，凝胶板阻抗R会随时间t而变化。

故应预先选定好电压、电流和功率这三个参数。

(1)恒流输出阶段：电泳初始时，凝胶板R较小，电流较大。

为避免短路，烧坏凝胶，需限定IW，电流达IW时便保持恒定。

(2)恒功率输出阶段：随着R增加，输出功率P=I2R增大。

为避免凝胶过热，应限定PW，当P达到PW时便保持恒定。

(3)恒压输出阶段：随着R继续增加，输出电压U=(PR)1/2继续上升。

当U达到限定值UW 时便应保持不变。

整个电泳是从恒流 恒功率 恒压自动转换的。

7、电泳仪电源的主要技术指标：包括(1)输出电压、电流、功率：指输出的直流V、I、P范围。

(2)电压、电流、功率稳定度：指输出变化量与输出本身大小的比值。

稳定度越小，性能越高。

(3)输出组数：指电源可同时提供几路输出。

(4)连续工作时间：指电泳仪可连续正常工作的时间。

(5)保护措施：指电源电路的保护方式。

如过流、过压保护等。

(6)显示方式：指对工作电流、电压的显示。

有指针式和数字式两种。

(7)定时方式：电泳时间控制方式。

常用电子石英钟控制。

(8)电源电压、频率：指供电电源的额定电压和频率。

(9)功耗：指电泳仪的耗电功率。

二、电泳槽是样品分离的场所；槽上有盖子。

* 盖子作用：防止缓冲液的蒸发，及防止发生触电危险。