课件--第六章 电泳仪

第六章电泳仪(Electrophoresister, EP)

(一)、引言：

1、现代生命科学研究的方法：分两类。

(1) 形态结构学方法：即把生物组织切片，用各类显微镜电镜等观察切面内的形态和结构，然后研究并总结其中规律。

(2) 生物化学方法：即用分离分析仪器对生物样品组分进行分离，然后用光谱、X光衍射等技术，对各类组分的结构、功能、和物理化学性质进行分析。

2、生命物质的分离技术：

常用的有三类，即离心、电泳和层析技术。

支持介质中的带电颗粒，在电场作用下向与其荷电极性相反的电极移动的现象。

3、分离原理：

(1) 电泳：带电颗粒

(2) 层析：根据颗粒吸附性和摩擦系数进行分离。

(3) 离心：样品质量、密度

4、适用性：

* 离心方法：适于大量样品粗提纯。

* 电泳和层析：用于小量样品分析性分离。

(二)、电泳

1、概念：

* 应用：常用于蛋白质和核酸的分离、鉴定及定量分析等。

2、电泳的早期历史

1809年：俄国Reuss进行了第一次电泳实验。

1937年：瑞典Tiselius观察了卵白蛋白的电泳迁移过程，用电泳方法证明血清是由白蛋白、 、 和 球蛋白组成的。为此在1948年荣获诺贝尔化学奖。

* 早期电泳技术和装置的发展：

Tiselius于1937年用移动界面电泳方法分离蛋白质，称为自由电泳。

此后几十年，发展了采用不同支持物的电泳技术，如滤纸电泳、醋酸纤维素膜电泳、凝胶电冰等。各种类型的电泳仪器也不断出现。

* 仪器类型：按操作可分为手工、半自动、全自动等类型。

第一节电泳仪器的工作原理

* 电泳原理：

许多分子具有可电离基团，在溶液中能形成正、负离子。

(1)缓冲液A、B中各放一电极接直流电源，则两电极间形成一恒定电场。A、B间用预先被缓冲液浸泡至饱和的支持介质联接，形成一个“桥”。

(2)将电泳的样品液滴在支持介质上。则在电场作用下，样品中带正(负)电的颗粒移向负(正)极。

(3)在样品的各种离子到达电极之前关闭电源，则样品的各种成分便按照它们的电泳迁移率被分离开。

(一)影响电泳移动速度的若干因素：

1、电荷：分子的净电荷越大，其移动速度越高。

2、分子的大小：分子越大，移动越慢。

3、支持介质的性质：

孔径：小孔径的有分子筛的作用，能依分子大小或带电不同等分离分子；即具有“筛分”分子的作用。

粘性：阻碍泳动并起吸附作用。

4、电场强度：电压越高，分子的移动速度越大。

5、缓冲液离子强度：离子强度高，则移动速度慢，电泳区带窄而清晰；离子强度低，则移动速度快，电泳区带宽而边缘模糊。

6、温度：温度升高，则泳动速度加快。

(二)迁移率的数学推导

1、粒子移动速度：

电场中粒子受到的电场力：F=qE

粒子运动时受到的阻力，满足stokes 公式：F’=6πηrv

式中r 为粒子的半径， 为介质的粘度系数。

当两力平衡时，粒子作匀速泳动，由F =F ’得：

v=qE/6πηr

2、粒子的迁移率： 指带电粒子在单位电场强度下的迁移速度，可用下式表示： 式中： v －粒子的迁移速度(cm/s)； u －迁移率；

d －粒子迁移距离(cm)； E －电场强度或电势梯度(V/cm)； t －通电时间(s)； U －加在支持物两端的实际电压(V)； L －支持物的有效长度(cm)。

(三)电泳的应用－正常人的血清电泳图谱

1、原理：

血清蛋白中含有α1、α2、β、γ球蛋白等。不同成分的物质，其颗粒大小、带电量及重量均不一样，故它们迁移率不同。

相同成分的物质，其迁移率很接近，泳动时形成一条带状。

2、方法：把血清蛋白放在支持介质上电泳，一段时间后，迁移率最大的清蛋白移动距离最大，其余依次为α1、α2、β、γ球蛋白排列。这样各种蛋白质就被分离开来。

3、组分含量测定：方法有多种。

(1)比色测定—血清蛋白电泳后，分离出5条蛋白区带。将电泳后滤纸烘干、染色，可看见几条色带。剪下各色带，分别溶于脱色剂，再做比色测定，可求得各种蛋白质所占百分率。

(2)光密度扫描仪测定—烘干染色后的滤纸用扫描仪测吸光度，以吸光度为纵坐标，滤纸的长度为横坐标，绘出电泳图形。

图中每一峰代表一种蛋白质，用面积仪测峰面积，则各峰面积对总面积的百分数，就是各种蛋白质所占的质量百分比。

第二节 电泳技术的基本类型

一、电泳类型

* 根据工作原理：可分为区带、移动界面、等电聚焦、等速、免疫电泳等；

Ut dL L U t d E v u ===//

* 根据载体的性质：可分为滤纸、醋酸纤维膜、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶电泳等；

* 根据支持载体的位置或形状：可分为水平、垂直、板状、柱状、U型管、倒V字形、毛细管电泳等；

* 根据使用目的：可分为核酸、血清蛋白、制备、DNA测序电泳等；

* 根据用法：可分为双向、交叉、连续纸电泳、电泳-层析相结合技术等。

几个基本概念：

* 自由电泳：指在自由溶液中直接进行、而不需支持介质的电泳。

* 区(条)带电泳：指大分子物质在特殊介质中(如滤纸等)电泳后，支持物上可呈现出不同的条带图谱；其应用最广泛。

* 支持介质：是样品电泳的场所；其种类很多；本章主要介绍需要载体的电泳技术。

二、常用的电泳方法

(一)滤纸电泳

1、装置：

用滤纸作为支持载体，水平架在两个装有缓冲溶液的容器间，样品点于滤纸中央。当滤纸被缓冲液润湿后，盖上绝缘密封罩，即可输入直流电压进行电泳。

2、特点：

(1)电压愈高，带电粒子迁移速度愈快，样品分离时间愈短。

(2)装置简单，分离效果较好。

(二) 凝胶电泳

是指用凝胶物质作支持物的区带电泳。常用凝胶为葡聚糖、聚丙烯酰胺和琼脂糖。其中琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳应用最多。

* 琼脂糖凝胶电泳：

特点：(1) 区带易染色，干燥后背景几乎无色，便于光密度扫描检测。可用于分离血清蛋白、血红蛋白、脂蛋白等。

(2) 电泳速度快，血清样品无需处理即可直接加样进行检测。

* 聚丙烯酰胺凝胶电泳：

可将血清蛋白分离出20多条区带，广泛用于分析某些蛋白质及较小分子的核酸。

(三)等电聚焦电泳

1、蛋白质的等电点pI

对两性蛋白质，其分子表面带有COO-羧基和NH3+氨基，当溶液酸碱度在某pH值时，分子所带正、负电荷相同(即净电荷为零)，这时蛋白质分子在电场中不会移动，此pH值称为该蛋白质的等电点pI。

(1) pH

(2) pH>pI时：溶液相对于等电点呈碱性，蛋白质带负电，在电场中向正极移动。

2、等电聚焦概念

设溶液的pH值是位置的函数，则在一个线性pH梯度的溶液中电泳时，样品中每种被分离的两性物质、在移向与它的等电点一致的pH位置后，便不再移动，称为聚焦。因这点净电荷正负抵消为零，故又称为等电聚焦。

3、等电聚焦电泳特点

(1)条带狭窄，很小样品也能获得清晰的区带界面。

(2)适用于中、大分子量生物组分，如蛋白质的分离。