细胞迁移和侵袭实验技术

注意事项
1.在用PBS缓冲液冲洗时，注意贴壁慢慢加入，以免冲散单层贴壁细 胞，影响实验拍照结果。 2.一般做划痕实验，都是无血清或者低血清（<2%）否则细胞增殖 就不能忽略。 3. 按照6孔板背后画线的垂直方向划痕，可以形成若干交叉点，作 为固定的检测点，以解决了前后观察时位臵不固定的问题。 4. 实验时应注意细胞生长状况，选择适当的细胞接种浓度。对不同 的细胞要观察细胞的贴壁率等，确定实验时细胞的接种数量和培 养时间，保证培养终止时密度适当。
100
Cell Numbers/HPF
80 60 40 20 0 scr
***
0 1 10 100
#1 #2 MDA-MB-231
#3
肿瘤细胞侵袭试验
Matrigel Invassion Assay
Transwell 系统
Transwell 小室
0.4um孔径聚碳
酯膜的扫描电镜
原理
人工重构ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ底膜材料Matrigel，是一种细胞外基质，4℃ 时是液体，在37 ℃ 会逐渐凝固成胶状。主要成分为层黏连 蛋白和Ⅳ型胶原，能在培养基中重建形成膜结构，这种膜结 构与天然基质膜结构极为相似。
操作步骤
4．放入37℃ 5% CO2培养箱培养。每3h 测量一次细胞运 动的距离，拍照(具体时间依实验需要而定)。
操作步骤
5. 数据处理：每个时间点的距离长度-0 时距离=每个时间长 度细胞整体迁移的距离，求出均数和标准差，时间为横轴， 迁移距离为纵轴（单位mm）作图，并比较初始0 时与实验结 束时实验组与对照组的照片。
实验结果举例
滤膜（聚碳酸脂膜）将小室分隔成上下两部分。靶细胞 在上面，趋化因子在下面，趋化因子通过滤膜形成梯度，细 胞则沿着梯度穿过膜孔，黏附在膜的下面，计数滤膜下表面 的细胞数即可测出趋化因子的趋化能力。
Boyden Chamber 装置
实验步骤
1. 在冰盒内将趋化因子由高浓度向低浓度稀释，将不同浓度的 趋化因子臵于趋化小室的下室，30ml/孔，每个浓度加3 个 孔，其中只加BM的孔为阴性对照； 2. 取对数生长期细胞，0.1%BM 重悬细胞，调整细胞浓度为 5×105/ml； 3. 加样：下室加不同浓度的趋化因子，将膜轻轻对折后展平， 光面朝下毛面朝上，依次盖上胶垫和上室将螺丝对称拧上 拧紧;在上室中加入细胞，50ml/孔，每个浓度加3 个孔；
操作步骤
1．先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀的划横 线，大约每隔0.5~1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过3 条线。
操作步骤
2. 在孔中加入约5×105个细胞，具体数量因细胞种类不 同而不同，接种原则为过夜后融合率达到100%； 3.用10ml tip 枪头用力均匀地在培养皿中划痕，PBS 洗涤 2 次，去除划下的细胞，加入无血清培养基。
实验步骤
4. 将趋化小室在 37℃，5% CO2 的孵化箱中孵育3h； 5. 在膜的两端加上夹子，毛面在PBS 液面上蘸取，光面禁止 碰到液体。毛面在架子上摩擦，再蘸取PBS，反复3 次后 再蘸取一次，晾干； 6. 固定, 染色
实验步骤
7. 取载玻片，剪角放在右上角，滴一滴石蜡，盖玻片封片； 8. 显微镜观察计数，每孔至少 3 个随机视野，3 个孔的数值取 平均值;作柱状图，纵轴趋化指数或细胞数，横轴组别； 9. 趋化指数(Chemotaxis Index)=随着趋化诱导因子的浓度梯度 而迁移的细胞数目/用培养基做对照的迁移细胞数目
实验步骤及注意事项
3. 每孔加入 200ml 1640（或DMEM）培养基使胶重构； 4. 在 Transwell 下室中加入趋化因子或10%FBS 培养基600ml/孔； 5. 在上室孔中准确加入细胞 l×105 个/孔，细胞悬液体积200ml， 臵于5%CO2 培养箱于37°C 培养24h（注意：细胞量和时间根 据实验条件摸索）； 6. 待培养时间结束后，弃去上室液体，小心取出上室，用湿棉签 擦去膜上未穿过膜的细胞；
注意事项
1. 膜，胶垫，上下小室之间防止有气泡产生； 2. 放膜时要对准位臵，过多调整位臵，易发生交叉污染。 3. 枪垂直，枪尖伸入孔中下大概4/5 处，迅速加样，不要迟疑， 打出液体的过程枪逐渐抬起，液体全部打出时枪尖离开液 面。
4. 洗膜时注意，不要把细胞面与非细胞面弄反。
EGF(ng/ml)
肿瘤细胞运动实验技术
肿瘤细胞生物学实验室 张宁PI组
肿瘤细胞运动
体内实验： 皮下移植瘤模型 原位移植瘤模型
体外实验
Text 划痕实验 in here
侵袭实验
肿瘤细胞运动 常用研究方法
趋化运动
划痕实验（伤口愈合实验，Scratch Assay）
实验原理
细胞划痕法是测定了肿瘤细胞的运动特性的方法 之一。在体外培养的单层细胞上，划痕致伤，然后 在加入药物等实验条件下观察其对肿瘤细胞迁移的 影响。
①Transwell小室 ②上层培养液 ③细胞 ④基质胶 ⑤下层培养液
⑥ 细胞培养板
Transwell侵袭实验 示意图
实验步骤及注意事项
7. 4%中性甲醛固定10 分钟，Giemsa 染色10 分钟，PBS 洗涤 3 次，干燥，取下微孔滤膜，倒臵显微镜下直接观察穿过 膜的细胞(200×)； 8. 每张膜中央部分和周围部分各随机取 3 个视野，计数每个 视野内的穿过8mm微孔的细胞数。
原理
滤膜孔径一般为8mm，而且膜孔都被Matrigel覆盖，细胞 不能自由穿过，必须分泌水解酶，并通过变形运动才能穿过 这种铺有Martrigel 的滤膜，这与体内情况较为相似。
Transwell 电镜图片
实验步骤及注意事项
1. 无菌条件下 Matrigel 于冰浴融化，用PBS（或DMEM only 培养基） 稀释成1mg/ml 浓度，-20°C 冻存备用； 2. 取出已稀释好的 Matrigel，冰浴融化，以50ml 的体积铺于Tramwell 小室（24孔板）聚碳酸酯膜上（注意：体积不可太大，以刚把聚碳酸 酯膜浸湿为最好），37°C 放臵lh，使Matrigel 聚合成凝胶（注意： 加基质胶时最好将24 孔板放臵在冰盒上，确保胶完全覆盖孔底，不 要有气泡）；
趋化运动实验（Chemotaxis Assay） 实验原理
趋化运动是指细胞能够感受到外界化学物质的 浓度梯度，并沿着浓度梯度的方向所做的定向运动。 趋化运动是一个非常保守的过程，对于生物体的生 存、生命的繁衍等具有重要的意义。
微孔小室中的趋化实验
微孔小室中的趋化实验是根据靶细胞（单核巨噬细胞， 中性粒细胞或淋巴细胞等）能够趋化性主动迁移，穿过一定 孔径的滤膜而设计的。