细胞迁移和侵袭实验技术
(完整word版)细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)
迁移实验（cell migration assay）实验介绍细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔,将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。
实验步骤：1材料准备：可拍照显微镜，Transwell小室，孔径8μm，没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用)，Transwell 迁移实验的细胞培养板24孔板.细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，无血清DMEM，（1%胎牛血清)DMEM和1640培养基,DMEM完全培养基，1640完全培养基（也可加到20%血清），无菌PBS，棉签，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液（0.1%（g/ml）PBS结晶紫）2步骤和流程2。
1基质胶铺板：用BD公司的Matrigel 1：8（根据细胞产生mmp的量来决定）稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。
使用前进行基底膜水化.2.2制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。
但这一步并不是必须的。
②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的无血清培养基重悬.调整细胞密度至5×105/ml。
2.3接种细胞①取细胞悬液100µl加入Transwell小室。
②24孔板下室一般加入600µl含20%FBS的培养基,特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。
细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)
细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)实验介绍：细胞迁移和侵袭实验是通过将Transwell小室放入培养板中，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，研究细胞在不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜下的共培养、细胞趋化、细胞迁移和侵袭等多种方面的实验。
实验步骤：1.材料准备：可拍照显微镜、Transwell小室（孔径8μm，没包被胶的），24孔板、BD公司的Matrigel、无血清DMEM、(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基、DMEM完全培养基、1640完全培养基（也可加到20%血清）、无菌PBS、棉签、胰酶、4%多聚甲醛固定液或者甲醇、结晶紫染液（0.1%（g/ml）PBS结晶紫）。
2.实验步骤：2.1 基质胶铺板：用XXX的Matrigel稀释1：8，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。
使用前进行基底膜水化。
2.2 制备细胞悬液：细胞撤血清饥饿12-24小时后，消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用含BSA的无血清培养基重悬。
调整细胞密度至5×105/ml。
2.3 接种细胞：取细胞悬液100µl加入Transwell小室，24孔板下室加入600µl含20%FBS的培养基。
注意避免气泡的产生。
2.4 培养细胞：常规培养12-48小时。
24小时较常见，时间点的选择除了要考虑到细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。
2.5 结果统计：通过给细胞染色，在镜下计数细胞。
胞悬液；将细胞悬液加入上室中央，保持液面水平；将下腔室中加入含有20% FBS的条件培养基；37℃培养箱中孵育20-24小时；取出transwell，用PBS洗涤2次，用4℃的5%戊二醛固定，加入结晶紫或Giemsa染色；用棉球擦去上表面细胞，显微镜下观察。
注意事项包括确保transwell在24孔板中浸泡1小时，消化细胞时用无血清培养基洗涤2次并计数，将细胞悬液加入上室中央保持液面水平，下腔室中加入含有20% FBS的条件培养基，37℃培养箱中孵育20-24小时，用PBS洗涤2次，用4℃的5%戊二醛固定，加入结晶紫或Giemsa染色，用棉球擦去上表面细胞，并小心避免混淆实验组和对照组。
细胞迁移侵袭试验技术（Transwell）
细胞迁移侵袭试验技术（Transwell）迁移实验（cell migration assay）实验介绍细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。
实验步骤：1材料准备：可拍照显微镜，Transwell小室，孔径8μm，没包被胶的(Coster 和Corning公司的也较常用)，Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。
细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，无血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基，DMEM 完全培养基，1640完全培养基（也可加到20%血清），无菌PBS，棉签，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液（0.1%（g/ml）PBS结晶紫）2步骤和流程2.1基质胶铺板：用BD公司的Matrigel 1：8（根据细胞产生mmp的量来决定）稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。
使用前进行基底膜水化。
2.2制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。
但这一步并不是必须的。
②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的无血清培养基重悬。
调整细胞密度至5×105/ml。
2.3接种细胞①取细胞悬液100μl加入Transwell小室。
②24孔板下室一般加入600μl含20%FBS的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。
boyden小室法原理
boyden小室法原理
BoydenChamberAssay（小室实验）:
Boyden小室实验是一种用于研究细胞迁移和侵袭的经典实验方法之一。
该实验通常涉及使用Boyden小室（BoydenChamber），其中包含两个相邻的室，它们之间通过一个微孔分隔。
这个微孔的大小和特性可以控制。
这个实验主要用于评估细胞的迁移能力，特别是细胞穿越微孔进入另一个室，模拟细胞在体内组织中的侵袭过程。
Boyden小室实验的基本步骤:
1.制备小室：使用Boyden小室，通常有两个室，它们之间通过一个孔隙分隔。
2.涂覆基底膜：在孔隙的底部涂覆基底膜，模拟细胞在组织中的侵袭环境。
3.准备细胞：将待测试的细胞放置在上室中。
4.孵育：孵育一段时间，允许细胞迁移到孔隙中。
5.固定和染色：固定细胞，然后通过染色技术，例如Giems染色，来观察和计数细胞在底部室的数量。
这个实验可以用于研究肿瘤细胞的侵袭能力、免疫细胞的迁移等。
这是一个常见的实验技术，被广泛应用于细胞生物学和肿瘤研究领域。
请注意，如果你确实在谈论不同的"Boyden小室法"或者其他主题，提供更多背景信息可能有助于我更好地回答你的问题。
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细胞迁移和侵袭实验
细胞迁移和侵袭实验细胞迁移和侵袭实验实验准备：细胞，24孔板，transwell小室（8μm，24孔板专用），ECM Gel，10%FBS+培养基，无血清培养基，10 μ、200 μL、1000 μL移液器及配套枪头，1.5 mL EP 管，冰盒实验设计：实验分组一般分为阴性组（上下层均没有趋化因素），实验组（按照实验需要，上层或者下层加入趋化因素），对照组（趋化因素与实验组中的相反）。
如果有特别需要，可以再加上阳性组（上下层都有趋化因素）。
实验操作（请细读注意事项）：一、细胞侵袭实验1.ECM Gel原液提前1 h放在4 ℃冰箱中解冻，实验前转移到冰盒中。
2.将1.5 mL EP、枪头盒、transwell放在24孔板里面后，置于冰上预冷。
3.根据自己的使用量，按照ECM Gel : 无血清培养基=1 : 7.5在冰上稀释成使用液。
4.把枪头剪去一小段（约3 μm）后在冰上吸取40 μL/孔ECM Gel 使用液轻轻加入transwell上室中，加入时慢慢移动枪头，保证液体平铺在底部。
5.放在37 ℃孵箱15 min，让胶凝固。
6.消化、离心、计数细胞后，按照2.5x104 / mL用无血清培养基稀释细胞，制成细胞悬液（如果细胞很多，这一步可以提前，在4、5之前做）。
7.按照每孔200 μL，将细胞悬液加入transwell上室，同时在transwell下室加入10%FBS+培养基500 μL，放入37 ℃孵箱培养。
8.若干小时后取出，吸去transwell上室多余液体，用PBS清洗两次，用棉棒在上室中轻轻转动，吸干水分并擦去膜内侧的细胞。
9.在上室中加入结晶紫染液，染色5 min，回收染液，用流水缓缓冲去染液，再次用棉棒在上室中轻轻转动，吸干水分。
10.在正置显微镜上放置一块载玻片，将transwell小孔倒置放在上面，拍照。
11.在100倍视野下，对膜的上下左右及中间计数，做平均数。
12.清洗transwell，可以反复使用。
细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)
细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)迁移实验〔cell migration assay〕实验介绍细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。
实验步骤： 1材料准备：可拍照显微镜，Transwell小室，孔径8μm，没包被胶的(Coster和Corning 公司的也较常用)，Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。
细胞培养板应当与购置的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，无血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基，DMEM完全培养基，1640完全培养基〔也可加到20%血清〕，无菌PBS，棉签，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液〔0.1%〔g/ml〕PBS结晶紫〕 2步骤和流程 2.1基质胶铺板：用BD公司的Matrigel 1：8〔根据细胞产生mmp的量来决定〕稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。
使用前进行基底膜水化。
2.2制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。
但这一步并不是必须的。
②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，〔用PBS洗1－2遍〕，用含BSA的无血清培养基重悬。
调整细胞密度至5×105/ml。
2.3接种细胞①取细胞悬液100μl参加Transwell小室。
②24孔板下室一般参加600μl含20?S的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。
培育技术中的细胞迁移和侵袭研究方法简介
培育技术中的细胞迁移和侵袭研究方法简介培育技术中的细胞迁移和侵袭是现代生物医学领域中重要的研究方向之一。
细胞迁移和侵袭能力是癌症发展和转移的关键步骤，因此了解和掌握这些研究方法对于深入研究癌症等疾病的发生和发展机制至关重要。
本文将对几种常见的培育技术中的细胞迁移和侵袭研究方法进行简介。
首先，细胞迁移和侵袭实验中最常用的方法是Transwell实验。
Transwell实验通过在一个具有孔洞的膜上涂覆细胞并将其置于培养皿中进行培养，通过孔洞上、下的培养液来观察细胞迁移和侵袭的情况。
该方法简单易行，可以模拟细胞穿过基底膜进入邻近组织的过程。
此外，也可将上下孔洞的培养液分别加入不同的试剂，以研究其对细胞迁移和侵袭能力的影响。
其次，划痕实验也是常用的细胞迁移实验方法之一。
该方法通过在细胞培养皿中划出一条明显的划痕，然后观察一定时间后细胞填充划痕的程度，来评估细胞的迁移能力。
划痕实验可以直观地观察到细胞的迁移情况，并且操作简单快捷。
然而，由于该方法不模拟细胞穿越基底膜的过程，所以不能全面评估细胞的侵袭能力。
除了以上两种方法，还有其他一些更加先进和精确的技术用于研究细胞迁移和侵袭。
例如，全息成像技术可以实时观察细胞的三维迁移和侵袭过程，提供更为全面的视角。
单细胞迁移技术可以追踪和记录单个细胞的迁移轨迹，揭示细胞迁移的空间和时间特征。
这些方法需要更加复杂的设备和技术条件，但可以提供更为准确和详细的研究结果。
在细胞迁移和侵袭研究中，细胞系的选择也是至关重要的。
常用的细胞系包括癌细胞和原代细胞。
癌细胞系具有较强的迁移和侵袭能力，是研究肿瘤转移的理想模型。
原代细胞系则来自于患者的组织，具有更高的生物学真实性。
不同细胞系的选择需要根据具体研究目的和实验要求进行。
细胞迁移和侵袭研究方法的发展为探索癌症转移的分子机制提供了重要工具和平台。
通过合理选择合适的实验方法和细胞系，研究者们可以逐步揭示细胞迁移和侵袭的调控机制，为深入理解癌症等疾病的发生和发展提供重要线索。
细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)
迁移实验（cell migration assay）实验介绍细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。
实验步骤：1材料准备：可拍照显微镜，Transwell小室，孔径8μm，没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用)，Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。
细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，无血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基，DMEM 完全培养基，1640完全培养基（也可加到20%血清），无菌PBS，棉签，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液（0.1%（g/ml）PBS结晶紫）2步骤和流程2.1基质胶铺板：用BD公司的Matrigel 1：8（根据细胞产生mmp的量来决定）稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。
使用前进行基底膜水化。
2.2制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。
但这一步并不是必须的。
②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的无血清培养基重悬。
调整细胞密度至5×105/ml。
2.3接种细胞①取细胞悬液100µl加入Transwell小室。
②24孔板下室一般加入600µl含20%FBS的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。
细胞迁移和侵袭实验的区别
细胞迁移是细胞在化学信号（如：趋化因子）的驱使下沿着浓度梯度从一个区域转移到另一区域的运动。
细胞侵袭与细胞迁移比较类似，但是“侵袭”需要细胞穿过胞外基质层（ECM）或基底膜基质层（BME），在这个过程中细胞先酶解去除ECM/BME的阻碍，从而在趋化因子浓度梯度驱使下完成从一处到另一处的移动。
从名字来看，这两种行为既有联系又有区别——迁移是在没有阻力的情况下的细胞移动，但侵袭则需要裂解“阻力”后才能实现移动能力。
简单总结就是，细胞侵袭是一种特殊的细胞迁移，侵袭细胞具有迁移能力，但并非所有的迁移细胞都具有侵袭性。
一、细胞迁移细胞迁移(cell migration)也称为细胞爬行、细胞移动或细胞运动，是指细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的梯度后而产生的移动。
细胞迁移为细胞头部伪足的延伸、新的黏附建立、细胞体尾部收缩在时空上的交替过程。
细胞迁移是正常细胞的基本功能之一，是机体正常生长发育的生理过程，也是活细胞普遍存在的一种运动形式。
胚胎发育、血管生成、伤口愈合、免疫反应、炎症反应、动脉粥样硬化、癌症转移等过程中都涉及细胞迁移。
细胞迁移的过程大致可以分为4步：①细胞前端伸出片状伪足；②细胞前端伪足和细胞外基质形成新的细胞黏附；③细胞体收缩；④细胞尾端和周围基质黏着解离，细胞向前运动。
细胞迁移需要胞外、胞内信号分子调控细胞骨架动力装置所给予的驱动力与肌动蛋白细胞骨架介导的黏附所提供的锚定力之间的协调运作。
目前，细胞迁移基本在细胞培养物中进行，主流的方法有：Boyden小室（跨膜法）、间隙封闭分析等；其中，Boyden小室可用于分析贴壁或不贴壁细胞，并可检测趋化梯度下的迁移，但这种方法不适用实时动态迁移；间隙封闭分析则可以对细胞迁移进行实时监测，甚至可有实现三维细胞的迁移分析，其缺点是不能分析不贴壁细胞和趋化梯度下的迁移。
因此，可以根据实际情况进行实验方案的设定。
同时，细胞划痕也可以测定细胞迁移运动与修复能力的方法，类似体外伤口愈合模型。
细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)
迁移实验(ceｌl migratioｎａsｓaｙ)实验介绍细胞迁移与侵袭实验将Trａｎｓwｅll小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔,将研究得细胞种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中得成分可以影响到上室内得细胞,应用不同孔径与经过不同处理得聚碳酸酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面得研究。
实验步骤:ﻫ１材料准备:可拍照显微镜,Transwell小室,孔径8μｍ,没包被胶得(Cｏstｅr与Ｃornｉng公司得也较常用),Ｔransweｌｌ迁移实验得细胞培养板2４孔板。
细胞培养板应当与购买得Traｎsｗell 小室相配套,ＢD公司得Matrigeｌ,无血清ＤＭEＭ,(1%胎牛血清)DMＥM与16４0培养基,DMＥM完全培养基,１６4０完全培养基(也可加到2０％血清),无菌PＢS,棉签,胰酶,4%多聚甲醛固定液或者甲醇,结晶紫染液(0、1％(g/mｌ)PＢS结晶紫)2步骤与流程2.1基质胶铺板:ﻫ用BD公司得Mａtrｉgｅl 1:8(根据细胞产生mmp得量来决定)稀释,包被Trａnsｗell小室底部膜得上室面,置37℃30min使Mａtriｇel聚合成凝胶。
使用前进行基底膜水化、2。
2制备细胞悬液ﻫ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h,进一步去除血清得影响、但这一步并不就是必须得。
ﻫ②消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,(用PＢS洗1－２遍),用含BSA得无血清培养基重悬。
调整细胞密度至5×105／mｌ、ﻫ2。
3接种细胞①取细胞悬液1０0µl加入Ｔｒansｗｅll小室。
②24孔板下室一般加入６0０µｌ含20％FBS得培养基,特别注意得就是,下层培养液与小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液得趋化作用就减弱甚至消失了,在种板得时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板。
细胞迁移侵袭实验操作步骤
迁徙实验（ cell migration assay）实验介绍细胞迁徙与侵袭实验将 Transwell 小室放入培育板中，小室内称上室，培育板内称下室，上基层培育液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，因为聚碳酸酯膜有通透性，基层培育液中的成分能够影响到上室内的细胞，应用不一样孔径和经过不一样办理的聚碳酸酯膜，就能够进行共培育、细胞趋化、细胞迁徙、细胞侵袭等多种方面的研究。
实验步骤：1 资料准备：可摄影显微镜， Transwell小室，孔径8μm，没包被胶的 (Coster 和 Corning 企业的也较常用) ，Transwell 迁徙实验的细胞培育板24 孔板。
细胞培育板应该与购置的Transwell 小室相当套， BD企业的 Matrigel ，无血清DMEM，(1%胎牛血清 )DMEM和 1640 培育基， DMEM完整培育基， 1640 完整培育基（也可加到20%血清），无菌 PBS，棉签，胰酶，4%多聚甲醛固定液或许甲醇，结晶紫染液（%（ g/ml ） PBS结晶紫）2 步骤和流程基质胶铺板：用 BD企业的 Matrigel 1： 8（依据细胞产生mmp的量来决定）稀释，包被Transwell 小室底部膜的上室面，置 37℃ 30min 使 Matrigel聚合成凝胶。
使用行进行基底膜水化。
制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿 12－ 24h，进一步去除血清的影响。
但这一步其实不是一定的。
②消化细胞，停止消化后离心弃去培育液，（用 PBS洗 1－ 2 遍），用含 BSA的无血清培育基重悬。
调整细胞密度至 5×105/ml 。
接种细胞①取细胞悬液100μl加入 Transwell小室。
②24 孔板下室一般加入 600μl含 20%FBS的培育基，特别注意的是，基层培育液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，基层培育液的趋化作用就减弱甚至消逝了，在种板的时候要特别留意，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培育板。
transwell统计方法
transwell统计方法Transwell统计方法是一种常用的实验技术，用于研究细胞迁移和侵袭的过程。
本文将介绍Transwell统计方法的原理、操作步骤以及其在细胞研究中的应用。
一、原理Transwell统计方法基于Transwell腔室，通过人工模拟细胞迁移和侵袭的环境，来研究细胞在不同条件下的迁移和侵袭能力。
Transwell腔室由两个隔离的腔室组成，中间隔以小孔，可以允许细胞通过。
上腔室涂有一层基底膜，用于模拟细胞迁移和侵袭的环境。
通过上腔室内细胞的迁移和侵袭情况，可以评估细胞的迁移和侵袭能力。
二、操作步骤1. 准备Transwell腔室：将Transwell腔室放入无菌培养皿中，加入适量的培养基，使其浸没在培养基中。
保持腔室表面湿润。
2. 细胞处理：将需要研究的细胞分离培养，并将其洗涤至适宜的细胞密度。
3. 细胞接种：将细胞悬液加入上腔室，将上腔室放置在含有培养基的培养皿中。
保持上腔室表面湿润，并确保细胞不会溢出。
4. 添加诱导剂：根据研究需要，可以向上腔室中添加适当的诱导剂，以模拟特定的迁移和侵袭环境。
5. 培养：将培养皿放入恒温培养箱中，以适宜的温度和湿度进行培养。
根据研究需要，可以选择不同的培养时间。
6. 细胞染色：培养结束后，将上腔室中的细胞染色，以便观察和计数。
常用的染色方法有克里斯蓝染色、伊红染色等。
7. 观察和计数：使用显微镜观察上腔室中的细胞，并通过计数细胞数量来评估细胞的迁移和侵袭能力。
三、应用Transwell统计方法在细胞研究中具有广泛的应用。
主要有以下几个方面：1. 细胞迁移和侵袭的研究：通过Transwell统计方法可以评估不同细胞在不同环境条件下的迁移和侵袭能力，从而深入了解细胞的功能和机制。
2. 肿瘤转移的研究：肿瘤转移是恶性肿瘤的重要特征，Transwell 统计方法可以模拟肿瘤细胞在体内转移的过程，为研究肿瘤转移提供重要的工具。
3. 药物筛选和评估：Transwell统计方法可以用于评估抑制细胞迁移和侵袭的药物效果，为药物筛选和评估提供依据。
细胞生物学中的细胞迁移和侵袭检测技术
细胞生物学中的细胞迁移和侵袭检测技术细胞迁移和侵袭是细胞生物学中两个重要的生理过程，也与一些疾病的发展和转移相关。
为了更好地理解和研究这些生理过程，科学家们开发了各种细胞迁移和侵袭检测技术。
本文将介绍一些常见的细胞迁移和侵袭检测技术，以及它们在细胞生物学研究领域中的应用。
一、划痕实验法划痕实验法是一种简单有效的细胞迁移检测技术。
在该方法中，细胞被种植在培养皿中，并留下一道划痕。
随着时间的推移，观察细胞是否填补划痕。
如果细胞填补了划痕，则说明细胞进行了迁移。
这种方法的优点是操作简单，无需复杂的设备或试剂。
然而，它也存在一些局限性，例如无法提供关于细胞侵袭性的信息，只能提供关于细胞迁移的信息。
二、Transwell迁移实验法Transwell迁移实验法是一种常见的细胞迁移和侵袭检测技术。
在该方法中，细胞被种植在Transwell孔的上室，并在下室中加入诱导迁移的物质。
细胞通过Transwell孔进行迁移，最终到达下室。
通过计算孔底部细胞数量或染色，可以评估细胞的迁移程度。
Transwell迁移实验法具有较高的准确性和可重复性。
它还可以通过更换Transwell上室或添加支持层来评估细胞的侵袭能力。
然而，该方法需要特定的设备和试剂，操作过程较为繁琐。
三、倒置显微镜法倒置显微镜法是一种常用的细胞迁移和侵袭检测技术。
在该方法中，细胞被种植在培养皿的底部，并通过倒置显微镜观察细胞的迁移和侵袭过程。
倒置显微镜可以提供高清晰度的图像，并可以连续观察细胞的动态变化。
倒置显微镜法适用于观察单个细胞或细胞群的迁移和侵袭过程。
它可以提供详细的细胞形态和细胞行为信息。
然而，该方法需要倒置显微镜等专业设备，并且观察时间可能较长。
四、细胞侵入试验法细胞侵入试验法是一种常见的细胞侵袭检测技术。
在该方法中，细胞被种植在含有基底膜模拟物的Transwell孔上室。
通过加入诱导细胞侵袭的化学物质，细胞可以穿过基底膜模拟物并进入下室。
细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)
迁移实验（cell migration assay）实验介绍细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。
实验步骤：1材料准备：可拍照显微镜，Transwell小室，孔径8μm，没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用)，Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。
细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，无血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基，DMEM 完全培养基，1640完全培养基（也可加到20%血清），无菌PBS，棉签，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液（0.1%（g/ml）PBS结晶紫）2步骤和流程2.1基质胶铺板：用BD公司的Matrigel 1：8（根据细胞产生mmp的量来决定）稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。
使用前进行基底膜水化。
2.2制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。
但这一步并不是必须的。
②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的无血清培养基重悬。
调整细胞密度至5×105/ml。
2.3接种细胞①取细胞悬液100µl加入Transwell小室。
②24孔板下室一般加入600µl含20%FBS的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。
细胞迁移侵袭试验操作步骤Transwell
迁移实验〔cellmigrationassay实验介绍细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔,将研究的细胞种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞,应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究.实验步骤：1材料准备：可拍照显微镜,Transwell小室,孔径8〔im,没包被胶的〔Coster和Corning公司的也较常用〕,Transwell 迁移实验的细胞培养板24孔板.细胞培养板应当与购置的Transwell小室相配套,BD公司的Matrigel,无血清DMEM,〔1%胎牛血清〕DMEM和1640培养基,DMEM完全培养基,1640完全培养基〔也可加到20%血清〕,无菌PBS,棉签,胰酶,4%多聚甲醛固定液或者甲醇,结晶紫染液〔0.1%〔g/ml〕PBS结晶紫〕2步骤和流程2.1基质胶铺板：用BD公司的Matrigel1:8〔根据细胞产生mmp的量来决定〕稀释,包被Transwell小室底部膜的上室面,置37c30min使Matrigel聚合成凝胶.使用前进行基底膜水化.2.2制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12-24h,进一步去除血清的影响.但这一步并不是必须的.②消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,〔用PBS洗1—2遍〕,用含BSA的无血清培养基重悬.调整细胞密度至5X105/ml.2.3接种细胞①取细胞悬液100dl参加Transwell小室.②24孔板下室一般参加600M含20%FBS的培养基,特别注意的是,下层培养液和小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了,在种板的时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板.③培养细胞：常规培养12—48h〔主要依癌细胞侵袭水平而定〕.24h较常见,时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外,处理因素对细胞数目的影响也不可无视.2.4结果统计直接计数法,贴壁〞细胞计数,这里所谓的贴壁〞是指细胞穿过膜后,可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去,通过给细胞染色,可在镜下计数细胞.取出Transwell小室,弃去孔中培养液,用无钙的PBS洗2遍,甲酉|固定30分钟,将小室适当风干.0.1%结晶紫染色20min,用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞,用PBS洗3遍.400倍显微镜下随即五个视野观察细胞,记数.实验材料(1)Transwellchamber:24-well,8.0-m mporemembranes(Corning)(2)细胞培养相关试剂：无血清培养基,10%血清培养基,PBS0.02%EDTA(3)固定液：甲醇(4)染色液：Giemsa染液(5)封片剂：中性树胶(6)其他：小银子,棉棒,载玻片,盖玻片操作步骤(1)所有细胞培养试剂和Transwellchamber放在37c温育；(2)待测细胞培养至对数生长期,消化细胞,用PBSft无血清培养基先后洗涤一次,用无血清培养基悬浮细胞,计数,调整浓度为2X105/ml;(3)在下室(即24孔板底部)参加600—800小含10%血清的培养基,上室参加100—150小细胞悬液,继续在孵箱培养24小时；(4)用银子小心取出chamber-,吸干上室液体,移到预先参加约800仙l甲醇的孔中,室温固定30分钟；(5)取出chamber,吸干上室固定液,移到预先参加约800屋Giemsa染液的孔中,室温染色15—30分钟；(6)轻轻用清水冲洗浸泡数次,取出chamber,吸去上室液体,用湿棉棒小心擦去上室底部膜外表上的细胞；(7)用小银子小心揭下膜,底面朝上晾干,移至载玻片上用中性树胶封片；(8)显微镜下取9个随机视野计数,统计结果.考前须知(1)根据待测细胞体积大小选择适宜孔径的chamber-o常用的为8.0-^m孔径(如AGSffi胞),如果细胞体积较大可以考虑用10-仙m孔径；(2)根据待测细胞的迁移水平强弱调整细胞数和迁移时间.常规24-wellchamber接种细胞数约为2^5X104/well,迁移时间12^36小时；(3)由于Corning公司的24-Transwell内含12个独立的chamber,为了防止操作污染,每次实验可预先另准备一块24孔普通培养板(Corning)；(4)如果细胞迁移水平较弱,下室液体可用3T3细胞无血清培养24小时获得的上清加50(ig/mlFN(Fibronectin),具体可查阅相关文献；(5)细胞悬液参加膜中央,尽量保证液面水平；(6)固定染色擦洗时动作小心,防止擦去膜底面的细胞.但一定要充分擦净膜外表上未迁移的细胞,以免影响读数.尤其是膜周边上可用细牙签或小银子缠上湿棉花擦洗,但要小心防止将膜戳破；(7)Chambe泡膜上都无法标记,操作时应小心防止混淆实验组和对照组；(8)充分晾干,防止残留水分导致镜下聚焦不一致.细胞侵袭实验(cellinvasionassay)实验材料(1)Matrigel(BD5mg/ml),-20C保存(2)其余材料同迁移实验操作步骤(1)Matrigel在4c过夜融化；(2)用4c预冷的无血清培养基稀释Matrigel至终浓度1mg/ml,冰上操作；(3)在chamber上室底部中央垂直参加100口稀释后的Matrigel,37c温育4-5小时使其干成胶状；(4)后续步骤同迁移实验(1-8).考前须知(1)Matrigel在过高或过低的温度均易凝固,因此操作所需枪头和离心管应提前在4c预冷；(2)铺胶时保证液面水平,胶的厚度均匀一致,切勿产生气泡；(3)其他考前须知同迁移试验.其他Transwell做肿瘤侵袭实验的具体步骤⑴基质胶准备：将冻存于—80度冰多!的BDmatrigel4度过夜(24h),变成液态；］(2)取300ul无血清培养基,参加60ul(或50ug/每室)Matrigel,混匀,(4c操作,最好在冰浴上),参加上室各100ul(3个室)；放入37c培养箱中,孵育4-5h(>5h);此间经常观察,当出现白色层〞时,说明已经变为固态.注释：无血清培养基和基质胶按1:5稀释,每孔加50ul,在37c培养箱中1-2ho(3)消化细胞,无血清培养基洗3次,计数,配成细胞悬液；1(4)用无血清培养基洗Matrigel洗1次；每孔参加100ul细胞悬液；(5)下腔室中参加500ul含有20%FBS条件培养基；」(6)37c培养箱中,孵育20-24h;(7)取出transwell用PBS洗2遍,5%戊二醛固定,4C；(8)参加结晶紫(0.1%)染色或Giemsa染色(5—10min),室温0.5h,PBS洗2遍,用棉球擦去上外表细胞,显微镜下观察.迁移实验transwell在24孔板中浸泡1小时；消化细胞,无血清培养基洗2次,计数,配成细胞悬液,每孔参加100ul细胞悬液；加药刺激；下腔室中参加条件培养基或其他刺激因子；37c培养箱中,孵育20-24h;取出transwell用PBS洗2遍,5%戊二醛固定,4C；PBS洗2遍,参加结晶紫〔0.1%〕染色,室温0.5h,PBS洗2遍,用棉球擦去上外表细胞,显微镜下观察计数10照相,记录.］侵袭实验取300ul无血清培养基,参加30ul〔或50ug/每室〕Matrigel,混匀,〔4C操作,最好在冰浴上〕,参加上室各100ul〔3个室〕；放入37C培养箱中,孵育4-5h〔＞5h〕;消化细胞,无血清培养基洗3次,计数,配成细胞悬液；用无血清培养基洗Matrigel洗1次；每孔参加100ul细胞悬液；下腔室中参加600ul无血清条件培养基；37C培养箱中,孵育20-24h;取出transwell用PBS洗2遍,5%戊二醛固定,4C；PBS洗2遍,参加结晶紫〔0.1%〕染色,室温0.5h,PBS洗2遍,用棉球擦去上外表细胞,显微镜下观察transwell小室是否可以重复利用,该怎样消毒用棉签轻轻擦去胶和反面细胞,清水冲洗,超声清洗,低挡,30min,清水3X5min,蒸储水3X5min,室温凉干,用前紫外线小室正面3h,反面6h,微波,低火10minX2,效果很好.。
transwell assay原理
转移孔试验（Transwell Assay）是一种常用的细胞实验技术，用于研究细胞的迁移能力和侵袭性。
它在生物医学研究中非常重要，特别是在肿瘤转移和疾病发展的研究中扮演着关键的角色。
1. 原理Transwell Assay的原理基于细胞在不同化学环境下的迁移和侵袭行为。
该实验通常使用转移孔板（Transwell Plate）进行，该板上有一个具有微孔滤膜的孔，可分为上下两个腔室。
上腔室通常包含待检测的细胞悬液，下腔室为培养基或其他化学物质。
2. 应用范围Transwell Assay广泛应用于肿瘤转移、细胞迁移和侵袭、药物筛选等领域。
通过该实验，可以评估细胞对化学因子、药物的反应以及细胞自身的迁移和侵袭能力。
3. 操作步骤a. 孵育：将细胞悬液加入上腔室，培养一定时间以使细胞附着并生长。
b. 处理：根据实验设计，在上下腔室分别加入化学因子或药物。
c. 染色：对下腔室的细胞进行染色，观察和统计细胞迁移或侵袭情况。
d. 分析：通过显微镜观察和图像分析，得出细胞迁移和侵袭情况的定量结果。
4. 个人观点我认为Transwell Assay可以帮助我们更好地理解细胞迁移和侵袭的机制。
通过该实验，我们可以研究不同因素对细胞行为的影响，为疾病的治疗和药物的研发提供重要参考。
总结：Transwell Assay以其独特的原理和广泛的应用范围成为细胞生物学领域中不可或缺的技术手段。
通过逐步的操作步骤，我们可以准确地评估细胞的迁移和侵袭能力，为研究和临床应用提供可靠的数据支持。
我相信随着科技的不断发展，Transwell Assay将在更多领域展现其重要价值。
Transwell Assay作为一种先进的细胞实验技术，已经在许多领域得到了广泛的应用和发展。
在肿瘤转移方面，Transwell Assay可以帮助科学家们深入研究肿瘤细胞的侵袭和转移机制，从而为肿瘤的早期诊断和治疗提供重要的理论依据。
在药物筛选和药理学研究中，Transwell Assay的应用也为新药研发提供了有效的评台，有助于评估药物对细胞迁移和侵袭的抑制或促进作用。
细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)
迁移实验（cell migration assay）宇文皓月实验介绍细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用分歧孔径和经过分歧处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。
实验步调：1资料准备：可拍照显微镜，Transwell小室，孔径8μm，没包被胶的(Coster和Corning公司的也较经常使用)，Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。
细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套，BD 公司的Matrigel，无血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基，DMEM完全培养基，1640完全培养基（也可加到20%血清），无菌PBS，棉签，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液（0.1%（g/ml）PBS结晶紫）2步调和流程2.1基质胶铺板：用BD公司的Matrigel 1：8（根据细胞发生mmp的量来决定）稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。
使用前进行基底膜水化。
2.2制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。
但这一步其实不是必须的。
②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的无血清培养基重悬。
调整细胞密度至5×105/ml。
2.3接种细胞①取细胞悬液100µl加入Transwell小室。
②24孔板下室一般加入600µl 含20%FBS的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡发生，一旦发生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。
细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)
迁移实验（cell migration assay）之老阳三干创作实验介绍细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔,将研究的细胞种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞,应用不合孔径和经过不合处理的聚碳酸酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究.实验步调：1资料准备：可拍照显微镜,Transwell小室,孔径8μm,没包被胶的(Coster和Corning公司的也较经常使用),Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板.细胞培养板应当与采办的Transwell小室相配套,BD公司的Matrigel,无血清DMEM,(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基,DMEM 完全培养基,1640完全培养基（也可加到20%血清）,无菌PBS,棉签,胰酶,4%多聚甲醛固定液或者甲醇,结晶紫染液（0.1%（g/ml）PBS结晶紫）2步调和流程 2.1基质胶铺板：用BD公司的Matrigel 1：8（按照细胞产生mmp的量来决定）稀释,包被Transwell小室底部膜的上室面,置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶.使用前进行基底膜水化.2.2制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h,进一步去除血清的影响.但这一步其实不是必须的.②消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,（用PBS洗1－2遍）,用含BSA的无血清培养基重悬.调整细胞密度至5×105/ml.2.3接种细胞①取细胞悬液100µl加入Transwell小室.②24孔板下室一般加入600µl含20%FBS的培养基,特别注意的是,下层培养液和小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了,在种板的时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板.③培养细胞：常规培养12－48h（主要依癌细胞侵袭能力而定）.24h较罕见,时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外,处理因素对细胞数目的影响也不成忽视.2.4结果统计直接计数法,“贴壁”细胞计数,这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后,可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去,通过给细胞染色,可在镜下计数细胞.取出Transwell小室,弃去孔中培养液,用无钙的PBS洗2遍,甲醇固定30分钟,将小室适当风干.0.1%结晶紫染色20 min,用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞,用PBS洗3遍.400倍显微镜下随即五个视野不雅察细胞,记数.实验资料（1）Transwell chamber: 24-well, 8.0-μm pore membranes (Corning)（2）细胞培养相关试剂：无血清培养基,10％血清培养基,PBS,0.02％EDTA（3）固定液：甲醇（4）染色液：Giemsa染液（5）封片剂：中性树胶（6）其他：小镊子,棉棒,载玻片,盖玻片操纵步调（1）所有细胞培养试剂和Transwell chamber 放在37℃温育；（2）待测细胞培养至对数生长期,消化细胞,用PBS和无血清培养基先后洗涤一次,用无血清培养基悬浮细胞,计数,调整浓度为2×105 /ml；（3）在下室（即24孔板底部）加入600－800μl 含10％血清的培养基,上室加入100－150μl细胞悬液,继续在孵箱培养24小时；（4）用镊子小心取出chamber,吸干上室液体,移到预先加入约800μl甲醇的孔中,室温固定30分钟；（5）取出chamber,吸干上室固定液,移到预先加入约800μl Giemsa染液的孔中,室温染色15－30分钟；（6）轻轻用清水冲洗浸泡数次,取出chamber,吸去上室液体,用湿棉棒小心擦去上室底部膜概略上的细胞；（7）用小镊子小心揭下膜,底面朝上晾干,移至载玻片上用中性树胶封片；（8）显微镜下取9个随机视野计数,统计结果.注意事项（1）按照待测细胞体积大小选择合适孔径的chamber.经常使用的为8.0-μm孔径（如AGS细胞）,如果细胞体积较大可以考虑用10-μm孔径；（2）按照待测细胞的迁移能力强弱调整细胞数和迁移时间.常规24-well chamber接种细胞数约为2≈5×104/well,迁移时间12≈36小时；（3）由于Corning公司的24-Transwell内含12个独立的chamber,为了避免操纵污染,每次实验可预先另准备一块24孔普通培养板（Corning）；（4）如果细胞迁移能力较弱,下室液体可用3T3细胞无血清培养24小时获得的上清加50μg/ml FN（Fibronectin）,具体可查阅相关文献；（5）细胞悬液加入膜中央,尽量包管液面水平；（6）固定染色擦洗时动作小心,避免擦去膜底面的细胞.但一定要充分擦净膜概略上未迁移的细胞,以免影响读数.尤其是膜周边上可用细牙签或小镊子缠上湿棉花擦洗,但要小心避免将膜戳破；（7）Chamber和膜上都无法标识表记标帜,操纵时应小心避免混淆实验组和对照组；（8）充分晾干,避免残留水分导致镜下聚焦不一致.细胞侵袭实验（cell invasion assay）实验资料（1）Matrigel (BD 5mg/ml),-20℃保管（2）其余资料同迁移实验操纵步调（1）Matrigel在4℃过夜融化；（2）用4℃预冷的无血清培养基稀释Matrigel至终浓度1mg/ml,冰上操纵；（3）在chamber上室底部中央垂直加入100μl稀释后的Matrigel,37℃温育4－5小时使其干成胶状；（4）后续步调同迁移实验（1-8）.注意事项（1）Matrigel在过高或过低的温度均易凝固,因此操纵所需枪头和离心管应提前在4℃预冷；（2）铺胶时包管液面水平,胶的厚度均匀一致,切勿产生气泡；（3）其他注意事项同迁移试验.其他Transwell做肿瘤侵袭实验的具体步调(1) 基质胶准备：将冻存于－80度冰箱的BD matrigel 4度过夜（24h）,酿成液态；（2）取300ul无血清培养基,加入60ul（或50ug/每室）Matrigel ,混匀,（4℃操纵,最好在冰浴上）,加入上室各100ul（3个室）；放入37℃培养箱中,孵育4-5h （>5h）；此间经常不雅察,当出现“白色层”时,说明已经变成固态.注释：无血清培养基和基质胶按1：5稀释,每孔加50ul,在37℃培养箱中1-2h.（3）消化细胞,无血清培养基洗3次,计数,配成细胞悬液；（4）用无血清培养基洗 Matrigel洗1次；每孔加入100ul细胞悬液；（5）下腔室中加入500ul含有20％FBS条件培养基；（6）37℃培养箱中,孵育20-24h；（7）取出transwell用PBS洗2遍, 5%戊二醛固定,4℃；（8）加入结晶紫（0.1%）染色或Giemsa染色（5－10min）,室温0.5h,PBS洗2遍,用棉球擦去上概略细胞,显微镜下不雅察.迁移实验transwell在24孔板中浸泡1小时；消化细胞,无血清培养基洗 2 次,计数,配成细胞悬液,每孔加入100ul细胞悬液；加药刺激；下腔室中加入条件培养基或其他刺激因子；37℃培养箱中,孵育 20-24h；取出 transwell用 PBS洗2遍,5% 戊二醛固定, 4℃；PBS洗2遍,加入结晶紫（0.1%）染色,室温0.5h,PBS 洗 2 遍,用棉球擦去上概略细胞,显微镜下不雅察计数10 照相,记录.侵袭实验取 300ul 无血清培养基 ,加入 30ul （或 50ug/ 每室） Matrigel ,混匀,（ 4 ℃ 操纵,最好在冰浴上）,加入上室各 100ul （ 3 个室）；放入37 ℃ 培养箱中,孵育 4-5h （ >5h ）；消化细胞,无血清培养基洗 3 次,计数,配成细胞悬液；用无血清培养基洗 Matrigel 洗 1 次；每孔加入 100ul 细胞悬液；下腔室中加入 600ul 无血清条件培养基；37 ℃ 培养箱中,孵育 20-24h；取出 transwell 用 PBS 洗 2 遍, 5% 戊二醛固定, 4 ℃ ；PBS 洗 2 遍,加入结晶紫（ 0.1% ）染色,室温 0.5h , PBS 洗 2 遍,用棉球擦去上概略细胞,显微镜下不雅察transwell小室是否可以重复利用,该怎样消毒用棉签轻轻擦去胶和背面细胞,清水冲洗,超声清洗,低挡,30min,清水3×5min,蒸馏水3×5min,室温凉干,用前紫外线小室正面3h,背面6h,微波,低火10min×2,效果很好.。
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趋化运动实验（Chemotaxis Assay） 实验原理
趋化运动是指细胞能够感受到外界化学物质的 浓度梯度，并沿着浓度梯度的方向所做的定向运动。 趋化运动是一个非常保守的过程，对于生物体的生 存、生命的繁衍等具有重要的意义。
微孔小室中的趋化实验
微孔小室中的趋化实验是根据靶细胞（单核巨噬细胞， 中一定 孔径的滤膜而设计的。
100
Cell Numbers/HPF
80 60 40 20 0 scr
***
0 1 10 100
#1 #2 MDA-MB-231
#3
肿瘤细胞侵袭试验
Matrigel Invassion Assay
Transwell 系统
Transwell 小室
0.4um孔径聚碳
酯膜的扫描电镜
原理
人工重构基底膜材料Matrigel，是一种细胞外基质，4℃ 时是液体，在37 ℃ 会逐渐凝固成胶状。主要成分为层黏连 蛋白和Ⅳ型胶原，能在培养基中重建形成膜结构，这种膜结 构与天然基质膜结构极为相似。
操作步骤
4．放入37℃ 5% CO2培养箱培养。每3h 测量一次细胞运 动的距离，拍照(具体时间依实验需要而定)。
操作步骤
5. 数据处理：每个时间点的距离长度-0 时距离=每个时间长 度细胞整体迁移的距离，求出均数和标准差，时间为横轴， 迁移距离为纵轴（单位mm）作图，并比较初始0 时与实验结 束时实验组与对照组的照片。
实验步骤及注意事项
3. 每孔加入 200ml 1640（或DMEM）培养基使胶重构； 4. 在 Transwell 下室中加入趋化因子或10%FBS 培养基600ml/孔； 5. 在上室孔中准确加入细胞 l×105 个/孔，细胞悬液体积200ml， 臵于5%CO2 培养箱于37°C 培养24h（注意：细胞量和时间根 据实验条件摸索）； 6. 待培养时间结束后，弃去上室液体，小心取出上室，用湿棉签 擦去膜上未穿过膜的细胞；
原理
滤膜孔径一般为8mm，而且膜孔都被Matrigel覆盖，细胞 不能自由穿过，必须分泌水解酶，并通过变形运动才能穿过 这种铺有Martrigel 的滤膜，这与体内情况较为相似。
Transwell 电镜图片
实验步骤及注意事项
1. 无菌条件下 Matrigel 于冰浴融化，用PBS（或DMEM only 培养基） 稀释成1mg/ml 浓度，-20°C 冻存备用； 2. 取出已稀释好的 Matrigel，冰浴融化，以50ml 的体积铺于Tramwell 小室（24孔板）聚碳酸酯膜上（注意：体积不可太大，以刚把聚碳酸 酯膜浸湿为最好），37°C 放臵lh，使Matrigel 聚合成凝胶（注意： 加基质胶时最好将24 孔板放臵在冰盒上，确保胶完全覆盖孔底，不 要有气泡）；
肿瘤细胞运动实验技术
肿瘤细胞生物学实验室 张宁PI组
肿瘤细胞运动
体内实验： 皮下移植瘤模型 原位移植瘤模型
体外实验
Text 划痕实验 in here
侵袭实验
肿瘤细胞运动 常用研究方法
趋化运动
划痕实验（伤口愈合实验，Scratch Assay）
实验原理
细胞划痕法是测定了肿瘤细胞的运动特性的方法 之一。在体外培养的单层细胞上，划痕致伤，然后 在加入药物等实验条件下观察其对肿瘤细胞迁移的 影响。
①Transwell小室 ②上层培养液 ③细胞 ④基质胶 ⑤下层培养液
⑥ 细胞培养板
Transwell侵袭实验 示意图
实验步骤及注意事项
7. 4%中性甲醛固定10 分钟，Giemsa 染色10 分钟，PBS 洗涤 3 次，干燥，取下微孔滤膜，倒臵显微镜下直接观察穿过 膜的细胞(200×)； 8. 每张膜中央部分和周围部分各随机取 3 个视野，计数每个 视野内的穿过8mm微孔的细胞数。
注意事项
1. 膜，胶垫，上下小室之间防止有气泡产生； 2. 放膜时要对准位臵，过多调整位臵，易发生交叉污染。 3. 枪垂直，枪尖伸入孔中下大概4/5 处，迅速加样，不要迟疑， 打出液体的过程枪逐渐抬起，液体全部打出时枪尖离开液 面。
4. 洗膜时注意，不要把细胞面与非细胞面弄反。
EGF(ng/ml)
操作步骤
1．先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀的划横 线，大约每隔0.5~1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过3 条线。
操作步骤
2. 在孔中加入约5×105个细胞，具体数量因细胞种类不 同而不同，接种原则为过夜后融合率达到100%； 3.用10ml tip 枪头用力均匀地在培养皿中划痕，PBS 洗涤 2 次，去除划下的细胞，加入无血清培养基。
实验步骤
4. 将趋化小室在 37℃，5% CO2 的孵化箱中孵育3h； 5. 在膜的两端加上夹子，毛面在PBS 液面上蘸取，光面禁止 碰到液体。毛面在架子上摩擦，再蘸取PBS，反复3 次后 再蘸取一次，晾干； 6. 固定, 染色
实验步骤
7. 取载玻片，剪角放在右上角，滴一滴石蜡，盖玻片封片； 8. 显微镜观察计数，每孔至少 3 个随机视野，3 个孔的数值取 平均值;作柱状图，纵轴趋化指数或细胞数，横轴组别； 9. 趋化指数(Chemotaxis Index)=随着趋化诱导因子的浓度梯度 而迁移的细胞数目/用培养基做对照的迁移细胞数目
实验结果举例
注意事项
1.在用PBS缓冲液冲洗时，注意贴壁慢慢加入，以免冲散单层贴壁细 胞，影响实验拍照结果。 2.一般做划痕实验，都是无血清或者低血清（<2%）否则细胞增殖 就不能忽略。 3. 按照6孔板背后画线的垂直方向划痕，可以形成若干交叉点，作 为固定的检测点，以解决了前后观察时位臵不固定的问题。 4. 实验时应注意细胞生长状况，选择适当的细胞接种浓度。对不同 的细胞要观察细胞的贴壁率等，确定实验时细胞的接种数量和培 养时间，保证培养终止时密度适当。
滤膜（聚碳酸脂膜）将小室分隔成上下两部分。靶细胞 在上面，趋化因子在下面，趋化因子通过滤膜形成梯度，细 胞则沿着梯度穿过膜孔，黏附在膜的下面，计数滤膜下表面 的细胞数即可测出趋化因子的趋化能力。
Boyden Chamber 装置
实验步骤
1. 在冰盒内将趋化因子由高浓度向低浓度稀释，将不同浓度的 趋化因子臵于趋化小室的下室，30ml/孔，每个浓度加3 个 孔，其中只加BM的孔为阴性对照； 2. 取对数生长期细胞，0.1%BM 重悬细胞，调整细胞浓度为 5×105/ml； 3. 加样：下室加不同浓度的趋化因子，将膜轻轻对折后展平， 光面朝下毛面朝上，依次盖上胶垫和上室将螺丝对称拧上 拧紧;在上室中加入细胞，50ml/孔，每个浓度加3 个孔；