多齿配体的合成

多齿配体的合成

及其金属配合物对DNA 的切割研究

王潇 毛宗万*

（中山大学化学与化学工程学院，广州 510275）

摘要 合成了6,6’-二[二(吡啶甲基)胺甲基]-2,2’-联吡啶配体，用元素分析、质谱和核磁共振技术对它们进行了表征．通过紫外吸收光谱和荧光猝灭研究了小牛胸腺DNA 与铜配合物的相互作用，通过凝胶电泳研究了铜配合物及镧配合物对超螺旋pBR322DNA 的断裂，发现镧配合物能快速切割超螺旋DNA 为线型DNA ，并对其进行了动力学研究，得到了它的催化速率常数以及米氏常数，对其切割能力进行了讨论．

关键词 DNA 铜（II ）配合物 镧（III ）配合物 凝胶电泳 水解断裂

脱氧核酸酶在基因组和染色体作图和测序、控制基因表达和调控基因生物活性等领域有着广阔的应用前景。但天然限制性内切酶识别序论短、专一性强，不能满足分子生物学和生物工程的需要。近十年来，人工脱氧核酸酶的开发研究及与此相关联的金属配合物与DNA 相互作用的研究十分活跃[1-4]．过渡、稀土金属多吡啶配合物广泛地被研究用于DNA 构象变化的探针、DNA-蛋白质相互作用分析的足迹试剂、以及基因组和染色体作图和测序的工具试剂等[5,6]．

许多金属离子及其络合物都可以作为Lewis 酸而催化核酸水解．它们有3个方面的催化作用：（1）它们可以与核酸上的磷氧负电荷结合从而提高磷原子的亲电性，这有利于亲核试剂进攻形成五配位磷过渡态；（2）它们可与过渡态中带部分负电荷的离去基团结合，

帮助其离去；（3）H 2O 与金属离子结合后，可以生成与其络合的氢氧根离子作为亲核试剂．

[7] 因此在本论文中我们设计并合成了一种带有多氮芳香环的联吡啶线形三核配体，希望与DNA 的链状结构相匹配，从而能对DNA 进行有效的切割．我们对其进行了表征，系统的研究了其金属配合物与DNA 的作用方式及断裂DNA 的活性． N N N N N

N N N

基金项目 中山大学化学与化工学院第四届创新化学实验与研究基金项目（批准号：03023） 第一作者 王潇（1983年出生），女，中山大学化学与化工学院应用化学专业00级

联系人 毛宗万 Email ：cesmzw@

1 实验部分

合成

1. 1 仪器与试剂

德国Elementar公司VarioEL元素分析仪，美国Thermo Finnigan公司LCQ DECA XP 液相色谱－质谱联用仪(配备ESI和APCI)，美国VARLAN公司CAY100紫外可见分光光度计，Varian INOVA核磁共振仪(500MHz)美国，北京市六一仪器厂电脑三恒多用电泳仪（DYY-12型）．

小牛胸腺DNA(CT DNA)购自华美公司，pBR322DNA，三羟甲基氨基甲烷（Tris），N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸钠（HEPES Sodium Salt），乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA Disodium Salt），购自上海生工公司，二(2-吡啶甲基)胺，6,6’-二甲基-2,2’-联吡啶，购自Aldrich公司．其它试剂均为分析纯．实验用水均为去离子重蒸水．

1. 2 6,6’-二溴甲基-2,2’-联吡啶的合成[8]

称取6,6’-二甲基-2,2’-联吡啶1.000g(5mmol)，N-溴代丁二酰亚胺1.932g（10mmol）至100ml圆底烧瓶，再加入50ml四氯化碳，于80℃回流半小时后，加入过氧苯甲酰15mg，继续回流2小时结束反应．趁热抽滤除去白色固体，并用少量四氯化碳洗涤，将滤液置于低温反应器内，搅拌使产品结晶析出，过滤，将白色固体干燥．产率33％，测其熔点172.0～172.9℃．

1. 3 6,6’-二[二（吡啶甲基）胺甲基]-2,2’-联吡啶的合成[9]

称取二（2-吡啶甲基）胺0.6g（3mmol），三乙胺0.306g（3mmol），四氢呋喃15ml至25ml圆底烧瓶，再加入0.513g（1.5mmol）6,6’-二溴甲基-2,2’-联吡啶，于90℃回流5小时．趁热抽滤去白色固体，滤液旋转蒸发蒸去四氢呋喃，得黄色粘稠液体．液体用少量的甲醇溶解，滴加浓高氯酸至沉淀不再析出。冷却静置2天，倒出溶液，真空干燥，得黄色固体，产率为81﹪．Ｃ36Ｈ34Ｎ8·4HClO4·5H2O EA（实验值: C,40.27; H,4.350; N,10.21, 计算值: C,40.39;H,4.520; N,10.47）, ESI-MS（实验值: [L+H]+,579.3; [L+H]2+,290.2, 计算值: [L+H]+,579.7; [L+H]2+,290.4）, 1HNMR, δH(氘代DMSO): 7.459-8.642(11H, m, ArH), 4.197(6H, s, NCH2Py)．

研究方法

1. 4 DNA与配合物相互作用时的热变性研究

在紫外可见光谱仪的双光路系统中，参比池中加入3mlTris缓冲溶液(PH=7.0)，样品池中加入同样体积的100μmol的DNA溶液，在200～300nm范围内检测DNA电子的吸收光谱的变化．温度范围为50～94℃，其中50～70℃的升温间隔为5℃，70～94℃的升温间隔为3℃．这样测得的就是空白DNA的解旋温度。按此方法，分别测定铜配合物浓度与DNA 浓度比为0.1、0.3、0.5时DNA的解旋温度．

1. 5 配合物与EB-DNA体系相互作用的荧光猝灭研究

研究配合物与DNA作用时，样品均溶解在缓冲溶液(5mMTris和50mMNaCl，PH=7.0)中．小牛胸腺的浓度以ε260=6600M-1cm-1来确定．测试液按固定DNA的浓度逐渐增加配合物浓度的方法配制．

1. 6 凝胶电泳

固定DNA浓度逐渐增加配合物浓度做反应时间的变化，反应后进行凝胶电泳(100mV，120min)，染色后在紫外灯下拍照．

铜配合物：37℃，pH=7.2(HEPES)，pBR322DNA:0.025mg/mL，配合物:150μmol，0.25％溴酚蓝．

镧配合物：37℃，pH=8.1(Tris)，pBR322DNA:0.025mg/mL，配合物:30、40、50、200、300μmol．

反应终止液:50％甘油水溶液，0.02mmolEDTA；电泳缓冲液:1×TBE硼酸溶液系统(pH=8.3)；染色剂:0.5~1.0μg/L溴乙锭(EB)．

2 结果与讨论

2. 1 DNA与配合物相互作用时的热变性研究

在配合物存在下测定DNA溶液的热变性行为有利于了解它的构象变化及配合物对DNA的作用强度．通常有机染料或金属插入剂通常导致DNA双螺旋链的稳定性升高，其熔点因此也会被升高[10]．配合物与DNA作用后的相关数据见表1．DNA的T M均升高，说明配合物与DNA之间有较好的亲和作用．

表1 CT DNA与配合物相互作用时的解旋温度变化

其中，△T M(℃) ＝加入配合物后的熔点-DNA空白的熔点

2. 2 配合物与DNA相互作用的荧光猝灭研究

如果配合物与DNA相互混合后，其荧光光谱发生了变化，表明了配合物与DNA之间发生了某种方式的相互作用．因此，在DNA存在下配合物荧光光谱强度的变化都可能是配合物与DNA的相互作用的有力证据．在该体系中，荧光强度被猝灭的程度越大，表明配合物与DNA的结合越强[11]．这是由于配合物的竞争键合DNA导致了EB分子从插入到的DNA 分子中被取代出来，EB的荧光被溶剂分子所猝灭．图1是体系的荧光强度随配合物浓度增加的变化曲线，结果表明，体系的荧光强度随着配合物浓度的增加而逐渐减小，结合热变性研究说明它与DNA之间有较强的亲和作用．

图1 铜配合物对EB-小牛胸腺DNA体系荧光强度的影响

Cu3L(H2O)4（■）, EB（in the absence of DNA）（●）

2. 3 凝胶电泳结果讨论