植物内生菌分离处理方法汇总
植物内生菌DNA提取方法
在提取植物内生菌之前，植物需要表面灭菌，其具体操作为将植物浸泡在添加了0.02%的Tween-20的质量分数为1%的次氯酸钠溶液中1 min，再将植物浸泡在70%酒精中1 min，然后用硫代硫酸盐/Ringer’s（林格氏液）清洗3次，每.次1 min。
根和茎（土表面以上1 cm处）都要灭菌处理，将根茎切成片状。
为了更好地分析细菌的位置，灭菌后茎表皮撕下，茎内部按照之前的方法灭菌。
表皮组织和根最后一次淋洗液中的细胞都用来提取DNA。
植物不同组织的内生菌群落DNA提取通过直接研磨植物组织，步骤为溶解、提取和纯化步骤（方案一），或者在DNA提取前从片状植物组织中淋洗出细胞（方案二）。
东南景天表面灭菌方法：整株植物用自来水冲洗30 min，用蒸馏水洗3次，每次3 min。
用吸水纸吸去植物表面水分，用无菌剪刀在根基部将根系剪下，与植物地上部分开。
将根系用70 %酒精浸泡2 min，无菌水洗3次，3 % NaClO浸泡2次，每次1 min，然后用无菌水冲洗3次，每次2 min，最后一次清洗液涂LB平板。
1. 将2 g左右消毒后植物组织于无菌研钵中，加5 mL磷酸钠缓冲液（19.9 g Na2HPO4·H2O，1.27 g NaH2PO4·2H2O，H2O 定容到1 L）研磨至匀浆。
2. 将植物匀浆转移至50 mL无菌离心管中，摇床200 rpm振荡1-2 h，使细菌细胞尽可能的从植物组织中释放出来。
3. 取4 mL悬液于新的无菌离心管中，12 000×g离心10 min收集菌体细胞。
4. 弃上清，将收集的菌体细胞重新溶于550μL 1×TE buffer（Tris-EDTA；pH8）中加入10 mg mL-1溶菌酶10μL，37℃水浴1-4h。
5. 加入50μL 20% SDS和8μL 20 mg mL-1蛋白酶K，混匀，65℃水浴3h，期间轻轻上下颠倒混匀数次。
6. 加入200μL 5M NaCl，涡旋振荡15 s，12000×g离心10 min。
植物病原菌分离方法
病原菌分离方法一、实验原理：植物患病组织内的真丝菌丝体，如果给予适宜的环境条件，除了个别种类外，一般都能恢复生长和繁殖。
植物病原菌的分离就是指通过人工培养，重染病植物组织中将病原真菌与其他杂菌相分开并从寄主植物中分离出来，再将分离得到的病原菌于适宜环境内纯化，这个过程总称植物病原的分离培养。
二、实验用具：酒精灯、手术剪、镊子、75%酒精、3%~5%次氯酸钠、灭菌水、培养皿、封口膜、乳酸等三、实验前的准备工作：1、煮培养基（PDA）：马铃薯200g,葡萄糖20g，琼脂粉(AGAR)20g（10:1:1）水1000ml（1）将去皮称量好的马铃薯切片后加水煮沸15~20min（水可以适量多加200ml 左右，因为在煮的过程中会蒸发一些），待土豆煮软即可。
（2）三层纱布滤去马铃薯后将过滤的水倒入洗净的锅中，加琼脂粉搅拌充分后再加热煮沸，小火使其充分融化。
（3）加入葡萄糖并不断搅拌，待其完全融化后双层纱布过滤，定容到1000ml，分装到500ml的玻璃瓶内，每个玻璃瓶最多装300ml，121℃湿热灭菌30min。
2、培养皿干热灭菌170℃1h;蒸馏水、枪头等湿热灭菌121℃30min。
四、实验步骤：1、用75%酒精擦拭超净工作台，所有器具用紫外灯灭菌30min,分离室要保持清洁。
2、取样，病斑大小约20个（含病缘线）3、分装培养基：（1）融PDA，松盖在微波炉中加热约3min（看量多少而定）（2）待冷却至50℃后在超净工作台指示灯显绿灯时分装(3) 分装时滴入一管乳酸约20滴（每10ml培养基中加3滴乳酸）（4）左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15m1(300ml一瓶的培养基倒20多个平板)，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。
4、表面消毒：（1）75%的酒精3ml~4ml没过样表面10s，快速吸掉酒精（2）3%~5%次氯酸钠（现配现用、避光）10ml消毒2~3min（3）无菌水冲洗2~3次5、转样：（1）器具经酒精灯消毒后无菌水水洗（2）培养皿上写明名称、分离时间后，在酒精灯旁转五点于培养基上。
菌类的分离和培养技术
菌类的分离和培养技术菌类（Fungi）是一类生物体，包括真菌（True Fungi）和微生物（Microfungi）两个大的类群。
菌类在生物圈中具有广泛的分布和重要的生态功能。
为了研究和利用菌类，科学家们开发了一系列分离和培养技术，以便从自然环境中获取纯种菌株以及大规模培养和应用特定的菌株。
本文将介绍菌类的分离和培养技术的基本原理和常用方法。
一、菌类的分离技术菌类的分离是指从混合菌群中获得纯种菌株的过程。
分离技术的关键是保持菌种的纯度和活力。
下面介绍几种常用的菌类分离技术。
1. 表层分离法表层分离法是最常用的菌类分离技术之一。
它适用于土壤、水域等含大量微生物的环境。
具体操作步骤为：取样→稀释→接种→均匀涂布→培养。
通过稀释操作可以使菌落分布在培养基表面，然后进行培养。
最后通过单菌落转接到新的培养基中得到纯种菌株。
2. 筛选法筛选法适用于需要寻找特定菌株的情况，例如寻找产生特殊代谢产物、拥有特定生态功能的菌株等。
筛选方法一般包括抗生素筛选、生理代谢筛选或染色筛选等。
在培养基中添加适当浓度的抗生素或其他化合物，只有目标菌株具有耐受能力，才能生长并形成菌落。
3. 寄主种菌法寄主种菌法是一种利用特定寄主与菌株共生的技术。
例如，某些菌株只通过与某种植物的根系共生才能生长。
通过将寄主植物的根系或其他寄主组织接种到含有该菌株的培养基上，就可以分离出特定的菌株。
二、菌类的培养技术菌类的培养是指将分离得到的纯种菌株在合适的环境条件下进行大规模的培养和繁殖。
下面介绍几种常用的菌类培养技术。
1. 液体培养法液体培养法是最常用的菌类培养方法之一。
通过将纯种菌株接种到含有营养物质的液体培养基中，利用摇床或震荡培养箱等设备进行培养。
液体培养法适用于大量培养、产生菌体、代谢产物等应用。
2. 固体培养法固体培养法是将菌株接种到固体培养基上，培养出菌落后进行培养的方法，常用的固体培养基有琼脂培养基等。
固体培养法主要用于分离和筛选菌株。
18株植物内生真菌的分离纯化及鉴定
桃金娘科番樱桃属
月橘
Murraya paniculata
芸香科九里香属
半夏
Pinellia ternata
天南星科半夏属
青木
Aucuba japonica 桃叶珊瑚科桃叶珊瑚属
舟山新木姜子 Neolitsea sericea
樟科新木姜子属
水蜡树
Ligustrum obtusifolium
木犀科女贞属
number of isolation and screening to obtain valuable endophytic fungi，it can provide more sources for novel
natural products.In this study，12 kinds of plants were randomly picked.18 strains of endophytic fungi were isolated
山茶花
Camellia japonica
山茶科山茶属
主要功效及用途 清热降火、消肿解毒、活血化瘀 化湿清热、祛风通络，治痢疾、腰痛 药材、调味料，健胃、活血、散寒
叶片肥厚，主要用于观赏 有催吐功效，主要治疗痢疾 盆栽，果肉多汁可食，制作优质软糖 祛风除湿、行气活血、散瘀止痛 用于痰多咳喘，眩晕，呕吐反胃 园林装饰及盆栽，保护肝功能 平喘，抗心律失常，抗真菌
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
收稿日期： 2015－02－12 作者简介： 鲁群（ 1987－ ） ，女，博士，讲师，研究方向： 天然产物化学与食品功能因子，E－ mail： luqun@ 。 基金项目： 中国国家留学基金委资助。
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表 1 采集植物信息 Table 1 Information of plants
(整理)植物内生菌分离处理方法
d植物内生菌分离处理方法文献材料前处理第一次消毒第二次消毒（含三消）处理对照培养基刘明志，2011 南方红豆杉的老树皮、幼茎、叶截成2～3 cm长的小段，去除树皮层75%酒精中浸泡30s0．1%升汞溶液浸泡8 min，无菌水冲洗3～5次研磨成匀浆液，倾倒于PDA上切成0．5 cm左右的块，接种于有100 mg L－1青霉素和链霉素的PDA固体培养基表面。
每皿10块刘金花2011 黄花蒿的根，茎，叶叶切成1cm2,茎和叶切成1cm左右小段（两端皆有切口）将根，茎，叶一次用75%酒精浸1min1%的次氯酸钙溶液浸泡1min,用无菌水冲洗5次置于含双抗的V A培养基平板培养待切口处长出菌落后转至PDA培养基进行内生真菌的分离宋培勇2011 珙桐茎、叶和叶柄将采集的新鲜珙桐的茎、叶和叶柄分别用流水冲洗, 风干表面水分, 剪成小块或小段,无菌水漂洗2 次75%酒精浸泡 1min再用2%NaClO 溶液中浸泡3 min, 转入75%酒精中浸泡30 s,接着用无菌水漂洗3 次,取最后一次漂洗液涂布NA 平板作为对照平放于NA 平板上,28 °C培养2−3 d孙传伯2011 台湾7303毛豆全株采回的样本用自来水洗净, 并用无菌纸吸干水分, 并用无菌纸吸干水分,切取支根110 cm长的小段, 须根切成115 cm的小块用75% 酒精浸泡5m in、7m in、10min分别用0.1% 升汞溶液处理4 m in、6m in、8 m in进行表面灭菌,此试验分别重复3次。
最后用无菌水冲洗4次,。
最后用无菌水冲洗4次将组织块在研钵中充分研磨成匀浆最后一次冲洗液涂3种不同培养基平板, 26~ 28e下培养2~ 3d, 筛选出最佳消毒时间和培养基, 将表面消毒彻底棉花根部切块放入灭菌研钵中用无菌水冲洗4次,取上清液涂抹于培养基上。
以无菌水冲洗为对照试验。
取上清匀浆涂抹于3种不同培养基上, 取匀浆涂布于不同培养基平板, 每浓度重复3次, 然后将培养皿置于26~ 28e 恒温箱中培养2~ 3d, 观察培养出的菌落形态精品文档张鑫2011 植物圣罗勒的健康叶子将叶子用流水冲洗10 min1% 的次氯酸钠中浸泡10min0．02 mol / L、pH7．0 的无菌磷酸钾缓冲液( PB) 漂洗4 次加无菌水将材料研磨涂布培养李铭, 2011 石耳目地衣为了诱导产孢，黑化菌株在光照/黑暗( 12 h∶12h) 条件下，于2%的PDA培养基上，18℃下培养 3 个月刘杰凤2011 健康的小白菜，染病的小白菜根，茎，叶流水冲洗干净，剪成小段75％酒精中浸泡3min10％次氯酸钠浸泡茎为8 min，根和叶由于气孔较茎大，浸泡5 min即可，然后用无菌水浸泡多次，每次3 min无菌条件下用适量的PBS缓冲液捣碎以最后一次的漂洗液作对照，30 ℃下培养一个星期搅拌后静置3 min，取上清液0．5 mL分别涂布于分离培养基平板上，每种材料做3次平行精品文档朱士茂2011 新采集的银杏枝条，叶子和根在自来水中冲洗干净，然后将枝条和根截成 3 －4cm长，将叶子和叶柄分开，分别将根，枝，叶放在不同的灭菌后的广口瓶中（一），根的表面灭菌: 0. 1%的土温20 消毒1min，无菌蒸馏水冲洗 2次。
分离植物内生真菌操作流程
分离植物内生真菌操作流程1.材料准备：植物样本、剪刀、镊子、70%乙醇、3%次氯酸钠（本实验用4%84）、酒精灯、计时器、平板、锥形瓶，无菌水，离心管（带盖，灭菌）、打开无菌操作台灭菌30min。
（1）植物样本的采集：选取生长状态良好，不要有病斑或者枯枝烂叶，每种植物采取三株标本，要带有叶子、叶柄和枝条及其他部位，将样本名字写在小纸条上放在装标本的袋子里，采下来的标本与写有名字的纸条一同拍照，样本上有脏东西时，请用纸轻轻擦掉，若不清楚植物名字，请将整棵植物拍照留用于鉴定，并做好相关记录。
（2）制作PDA固体培养基，在无菌操作台中倒平板，每瓶250ml的培养基大概倒15个板，待其凝固后用于接种。
2.清洗：认真用清水将标本洗净，洗去标本表面的灰尘，去除枯叶，备用。
3.取样：（1）在叶片的左上、右上、左下，右下和正中五个部位进行取样，剪取5mm*5mm的叶片，如果是叶柄或枝干，则剪取5~10mm，若是比较粗的枝干或圆圆的果实之类的，总之比较大的，则将它切开，再剪取样本，样本不要剪的太大或太小。
（2）每种植物的叶子，叶柄，枝干等其他部位，每种部位接种两块板，大板每个要接种五个样本即左上、右上、左下，右下和正中，小板每个接种四个样本即左上、右上、左下，右下，计算好所要剪的样本数，尽量多剪几个，以免后面的表面灭菌中冲洗时被冲掉。
（3）若植物标本有剩余，且是没有洗过的，重新装好，放到冰箱里，备用，洗过的扔掉。
（4）每种植物标本所剪的样本放在一个50ml的离心管中，放在试管架上，并且每个离心管上要标好所对应的植物标本。
4.表面灭菌：在无菌操作台中进行（1）先向各离心管内倒入适量（10~20ml）70%乙醇，拧紧盖子，用计时器开始计时1min,每10秒钟晃动离心管几次，使其充分灭菌。
（2）1min后，拧松盖子，将乙醇倒入事先准备的锥形瓶中，注意不要将管中样本倒出，倒出的样本不要再放入其中，也不要用手碰到样本，样本不可以接触到除了离心管以外的东西。
植物内生菌的分离
植物内⽣菌的分离植物内⽣菌的分离钱昆121140041⼀、实验⽬的1、掌握对植物内⽣菌的分离处理⽅法。
2、熟练掌握对细菌、真菌的染⾊观察技术。
3、了解微⽣物分⼦实验的基本操作流程。
⼆、实验原理在植物的⽣态环境中，存在着各种各样的微⽣物,它们有的附着于植物的表⾯，有的则⽣活于植物体内。
对于附着于植物表⾯和根际的微⽣物已有很多研究，⽽对于植物体内微⽣物的研究却刚刚起步。
但有资料显⽰, ⼀些植物内⽣微⽣物与宿主发⽣关系时，可明显增强宿主的抗病性，提⾼植物的⽣产⼒。
因此，合理利⽤植物的内⽣微⽣物具有重要的理论意义和实⽤价值。
植物内⽣菌作为微⽣物研究领域之⼀，近年来⼀直备受关注。
内⽣菌概念在1866年⾸先由Bary提出的，指那些在其⽣活史的⼀定阶段或全部阶段⽣活于健康植物的组织或器官内部的微⽣物（主要为真菌和细菌）。
其后的很长时间内，内⽣菌研究进展缓慢。
直到1993 年，美国蒙⼤拿州⽴⼤学Strobel等从短叶红⾖杉的韧⽪部位分离到⼀株产新型抗癌物质紫杉醇的内⽣真菌，从⽽启发⼈们可从植物内⽣菌寻找与植物产⽣的相同或相似的化合物，由此促进了植物内⽣菌的研究。
植物内⽣菌为植物组织内的正常菌群，包括植物内⽣真菌、内⽣细菌和内⽣放线菌，⼴泛分布于各种陆⽣及⽔⽣的低等植物和⾼等植物中。
内⽣真菌是在宿主植物的茎和叶内⽣存并完成⽣活周期的真菌。
这类真菌中，有许多种类很少形成孢⼦，或者在宿⽣植物上形成孢⼦（或者孢⼦果），不容易识别。
真菌感染植物组织，菌丝存在于细胞内和细胞间。
与病原菌不同，这些真菌对宿主植物⼏乎没有害处，它们和植物之间或者是相互依存的共⽣关系，或者是不太密切的共⽣关系。
对于现已分离得到的植物内⽣细菌，⼀般可分为专性内⽣细菌与兼性内⽣细菌，前者指⾄今只能在植物体内分离得到的细菌；后者指能在植物根际与⼟壤中分离得到，也能在植物体内分离得到的细菌，⽽且种类居多。
根据内⽣细菌对宿主植物⽣长发育的影响可以将其分成三类：第⼀类对植物的作⽤是中性的，即尚未发现它们的内⽣定殖对宿主植物⽣长与繁殖有影响；第⼆类对植物⽣长发育有促进作⽤，如能提⾼宿主植物抗病、抗逆能⼒，或能通过固氮与分泌激素促进植物⽣长发育等；第三类对植物⽣长具有负⾯影响，在特别条件下接种到原宿主植物或另外的宿主植物会诱发植物病害。
植物病原菌分离方法
植物病原菌分离方法（综合版）植物病原细菌分离方法：分离培养基（NA）植物病原细菌的方法一般采用稀释分离法：1.取灭菌研钵加无菌水适量，切去4 mm大小病块组织，经过表面消毒和无菌水冲洗3次后放入研钵中研碎，静置10-15 min，使组织中的细菌进入水中制成悬浮液；2.配制不同稀释度的细菌悬浮液；准备3-5个灭菌培养皿，每个加200 µl无菌水；3.用灭菌移植环从第1个培养皿中移植1-2环细菌悬浮液到第2个培养皿中，充分混匀后再从第2个培养皿移植1-2环到第3个培养皿中，依次类推；4.平板划线分离，28℃培养2-3天；5.挑取单菌落划线再次纯化；菌落形态观察：1.形状和大小、颜色和光泽、表面是否隆起或凹陷、边缘的形状、透明度和粘度、培养基颜色的变化等；2.菌苔表面有光滑的、不平整的和皱褶的、易挑取、质地均匀3.菌苔颜色也不同，质地有粘质的、膜质的或蜡质的。
有透明的、半透明的或不透明的，表面有暗色或发亮的4.菌落正反面或边缘与中央部位颜色一致等特征注：1.若分离成功，平板上菌落形态和大小比较一致，即使出现几种不同形状的菌落，终有一种是主要的；2.如果菌落类型很多，且不分主次，很可能未分离到病原细菌，应考虑重新分离；3.如果不熟悉一种细菌菌落的性状，就应选择几种不同类型的菌落，分别培养后接种测定其致病性，最终确定病原菌；4.一种细菌病害一般由一种病原菌引起的，平板上出现几种不同类型的菌落实质上只有一种是真正的病原细菌；5.腐烂型的细菌病害即使是混合侵染的，但也有一种是主要的。
6.各种植物病原细菌生长快慢不同：假单胞菌属和欧文氏菌属1-2天土壤杆菌属细菌2-3天黄单胞菌属细菌3-4天棒杆菌属的细菌5-8天才出现明显的菌落植物病原细菌生长量测定法直接法测体积粗放的方法，将待测培养液放在刻度离心管中作自然沉降或进行一定时间的离心，然后观察沉降物的体积。
称干重采用离心法或过滤法测定，一般干重为湿重的10%~20%。
植物内生真菌分离培养的研究方法
$对不同生态环境下或不同地区的同种宿主 的某一组织采样时进行精心挑选， 发现的真菌可 能更为多样。改变培养条件、 样品尺寸 （包括宿主 组织尺寸） 以及培养基的组成也能提高一定样品 中真菌的多样性， 发现更为多样的菌种类型。 %一种宿主常常会寄生有一种或几种其它宿 主所没有的内生真菌， 因此， 内生真菌的多样性可 能就是宿主数 （抽样的宿主数） 的函数， 即随抽样 宿主类型数的变化而变化。 如果要筛选产抗菌活性物质植物内生菌， 则 应遵循以下的策略， 避免筛选的盲目性。首先应 考虑筛选植物的有关背景， 如生长环境、 植物的特 殊分布、 植物种的年代、 抗病性以及药用背景等。 因为植物的生长环境直接影响内生菌的生物多样 性； 植物种的年代越久远， 其内生菌的生物多样性 越丰富； 抗病性能越强的植物， 其所含的内生菌具 有抗菌活性的可能性就越大； 具有药用性能的植 物， 其所含的内生菌有可能产生与植物相同或相 似的抗菌物质， 或产生的抗菌活性物质可能参与
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［ ］ ’ 根菌和假菌根菌） 应属于内生菌 。目前， 关于内
等植物很可能是隐匿着未知真菌的宝库。本文主 要从! 个方面对内生真菌的研究方法进行了简要 综述。
> 植物内生真菌的定义
要弄清内生真菌的定义， 首先要明白内生菌
植物内生真菌分离培养的研究方法
王利娟等： 植物内生真菌分离培养的研究方法
: 8
水冲洗表面残留的消毒剂。家庭用的 ! " # $ %漂 白剂用水稀释至& ’! ( ) ’ 就是最常用的表面消
［ ］ & 毒剂 ， 由于商业次氯酸盐溶液浓度、 可用有效
有时将表面活性剂 （如 ; ） 和消毒剂结合 < 2 2 . = > ) 使用， 消毒后将组织在无菌水或 8 ) ’! 9 : ’ 的乙 醇中浸泡(? 6 .以除去残留的消毒剂。其他的消 毒剂在内生菌研究中并不常用， 包括硝酸银、 氯化 汞 （升汞） 、 福尔马林 （甲醛水溶液） 、 乙醇或丙烯氧 化物。由于升汞的毒性残留以及对自然环境的破 坏作用， 现在国外很少使用， 而是使用一些具有相
高等植物是复杂多样的， 它为各种各样的微 生物提供生存环境。这些微生物中主要是真菌， 有的生活在叶和嫩枝等的表面 （称为表生菌） ， 有 的生活在叶内部组织中 （称为叶内生菌） ， 有的则 生活在树皮中 （称为树皮内生菌） ， 还有的生活在 木材中 （如木质部内生菌和木材腐生菌） 。健康植 物内部组织的内生菌引起越来越多科学家的兴 趣， 从目前己经研究过的植物来看， 可以推断内生 真菌在植物体内是普遍存在的。通过对内生真菌 和宿主专一性分析， 平均每种宿主有! * 种专性 内生真菌， 按地球上有 " 内生真 * 万种植物计算， 菌总数可能超过 # $ $
［ ］ ’ 根菌和假菌根菌） 应属于内生菌 。目前， 关于内
等植物很可能是隐匿着未知真菌的宝库。本文主 要从! 个方面对内生真菌的研究方法进行了简要 综述。
> 植物内生真菌的定义
要弄清内生真菌的定义， 首先要明白内生菌
生菌的概念范畴仍有很大的争议， R = A @ 2 7 2提出的 ［ ］ ’ 内生菌概念被广泛接受 。 植物内生菌包括内生细菌、 内生放线菌和内 生真 菌 。 然而， 过 去’ $ 6中 ， = 7 F G < A =和= 7 F G 3 J K
植物内生菌分离处理方法汇总
刘明志。
南方红豆杉产紫杉醇内生真菌的分离。
热带亚热带植物学报，2011，19(4):360～364剥取红豆杉的老树皮，截成2～3 cm长的小段，去除树皮层，先用75%酒精中浸泡30 s，无菌水冲洗3次，再用0．1%升汞溶液浸泡8 min，无菌水冲洗3～5次。
用无菌滤纸吸干表面水分，用无菌解剖刀将小段切成0．5 cm左右长的小块，接种于加有100 mg L－1青霉素和链霉素的PDA固体培养基表面。
每皿放置10块，依次编号，置于25℃恒温培养箱中培养。
幼茎内生菌的分离方法同上，将幼茎切成1 cm长的小段，以伤口断面垂直接种于PDA 固体培养基上培养。
红豆杉叶片内生菌的分离采用两种方法，第一种方法与树皮内生菌的分离方法类似，分离时将叶片切成2至3段，接种于PDA固体培养基上;第二种方法是将叶片消毒后用无菌研钵研磨成匀浆液，然后将研磨液倾倒于PDA固体培养基上，置于25℃恒温培养箱中培养。
1刘金花。
黄花蒿内生菌的分离与初步鉴定。
２０１１，３３（４）：２７～３０黄花蒿的根，茎，叶，叶切成1cm2,茎和叶切成1cm左右小段（两端皆有切口），将根，茎，叶一次用75%酒精浸1min，再用1%的次氯酸钙溶液浸，置于含双抗的V A培养基平板培养泡1min,用无菌水冲洗5次。
待切口处长出菌落后转至PDA培养基进行内生真菌的分离。
2宋培勇，珙桐内生细菌的分离鉴定及系统发育分析，2011, 38(1): 8−13将采集的新鲜珙桐的茎、叶和叶柄分别用流水冲洗, 风干表面水分, 剪成小块或小段,无菌水漂洗2 次, 75%酒精浸泡 1 min, 再用2%NaClO 溶液中浸泡 3 min, 转入75%酒精中浸泡30 s,接着用无菌水漂洗3 次, 平放于NA 平板上, 28 °C培养2−3 d。
取最后一次漂洗液涂布NA 平板作为对照。
内生菌分离和纯化。
将NA 平板上组织块下或周缘长出的菌落或菌苔划线稀释分离1-2 次直到获得纯培养3孙传伯。
植物内生菌分离处理方法汇总
d 植物内生菌分离处理方法刘明志。
南方红豆杉产紫杉醇内生真菌的分离。
热带亚热带植物学报，2011，19(4):360～364剥取红豆杉的老树皮，截成2～3 cm 长的小段，去除树皮层，先用75%酒精中浸泡30 s，无菌水冲洗3次，再用0．1%升汞溶液浸泡8 min ，无菌水冲洗3～5次。
用无菌滤纸吸干表面水分，用无菌解剖刀将小段切成0．5 cm 左右长的小块，接种于加有100 mg L －1青霉素和链霉素的PDA 固体培养基表面。
每皿放置10块，依次编号，置于25℃恒温培养箱中培养。
幼茎内生菌的分离方法同上，将幼茎切成 1 cm 长的小段，以伤口断面垂直接种于PDA固体培养基上培养。
红豆杉叶片内生菌的分离采用两种方法，第一种方法与树皮内生菌的分离方法类似，分离时将叶片切成2至3段，接种于PDA 固体培养基上;第二种方法是将叶片消毒后用无菌研钵研磨成匀浆液，然后将研磨液倾倒于PDA 固体培养基上，置于25℃恒温培养箱中培养。
1刘金花。
黄花蒿内生菌的分离与初步鉴定。
２０１１，３３（４）：２７～３０黄花蒿的根，茎，叶，叶切成1cm2,茎和叶切成1cm 左右小段（两端皆有切口），将根，茎，叶一次用75%酒精浸1min ，再用1%的次氯酸钙溶液浸，置于含双抗的VA 培养基平板培养泡1min, 用无菌水冲洗5 次。
待切口处长出菌落后转至PDA 培养基进行内生真菌的分离。
2宋培勇，珙桐内生细菌的分离鉴定及系统发育分析，2011, 38（1）: 8-13将采集的新鲜珙桐的茎、叶和叶柄分别用流水冲洗, 风干表面水分, 剪成小块或小段,无菌水漂洗2 次, 75%酒精浸泡1 min, 再用2%NaClO 溶液中浸泡3 min, 转入75%酒精中浸泡30 s,接着用无菌水漂洗3 次, 平放于NA 平板上, 28 °C培养2-3 d。
取最后一次漂洗液涂布NA 平板作为对照。
内生菌分离和纯化。
将NA 平板上组织块下或周缘长出的菌落或菌苔划线稀释分离1-2 次直到获得纯培养3孙传伯。
植物内生真菌的分离
植物内生真菌的分离一、实验目的1.理解内生真菌存在的普遍性和多样性2.掌握常规的微生物分离纯化方法3.掌握分菌过程中的一些基本操作技能二、实验原理植物内生真菌( Endophyte) 是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的真菌或细菌，而宿主植物一般不表现出外在的症状。
所有植物中几乎都存在内生菌. 由于植物内生真菌与宿主在长期的进化过程中形成了特殊的生态关系，因而内生真菌能产生与宿主相同或相似的具有生理活性的次生代谢产物，从内生菌中寻找和发现新的活性化合物越来越成为微生物次生代谢产物的研究热点之一。
采用微生物学常规的组织分离法从植物中分离内生真菌三、实验材料板蓝根新鲜健康的叶片试剂：次氯酸钠、无水乙醇、葡萄糖、琼脂、青霉素、链霉素培养基：PDA培养基、分离培养基四、实验步骤(一)、配制PDA培养基10月27号晚上:(1)配置PDA培养基,用电子称称取去皮的土豆100g，煮沸30min，4层纱布过滤，滤液加热，加入琼脂7.5克，琼脂完全融化后加入葡萄糖10g，待稍冷却后加水至500毫升。
(2)准备10瓶无菌水，每瓶150ml左右。
(3)包好烧杯，培养皿，涂布棒等实验仪器，等待消毒。
(二)、配制分离培养基28号中午：（1）配置分离培养基，将PDA培养液均分成两份，一份备用，另一份待高温灭菌后，加入青霉素100mg／L、链霉素200mg／L的混合液20ml，即得到分离培养基。
（2）用消毒后的培养皿在通风橱中倒平板，注意在整个过程中保证无菌操作。
(三)、采集新鲜板蓝根叶片28号晚上到实验室外采集新鲜健康叶片完整的板蓝根叶片。
(四)、植物组织表面消毒28号晚上将新鲜、健康的板蓝根叶片于自来水下冲洗干净，用吸水纸吸干表面水分后剪成小段（片）做如下表面消毒处理：75%酒精漂洗3min，无菌水冲洗4~5次，5%次氯酸钠溶液漂洗叶3min，无菌水冲洗4~5次，无菌滤纸吸干水分。
（五）、接种并培养28号晚上：（1）将上述表面消毒后的材料剪切成0.5cm 2 小块，放入含有分离培养基的平板中（3块／每板）28℃恒温培养3~15天。
植物内生菌DNA提取方法
在提取植物内生菌之前,植物需要表面灭菌,其具体操作为将植物浸泡在添加了0.02%的Tween-20的质量分数为1%的次氯酸钠溶液中1min,再将植物浸泡在70%酒精中1min,然后用硫代硫酸盐/Ringer’s林格氏液清洗3次,每.次1min;根和茎土表面以上1cm处都要灭菌处理,将根茎切成片状;为了更好地分析细菌的位置,灭菌后茎表皮撕下,茎内部按照之前的方法灭菌;表皮组织和根最后一次淋洗液中的细胞都用来提取D N A;植物不同组织的内生菌群落DNA提取通过直接研磨植物组织,步骤为溶解、提取和纯化步骤方案一,或者在DNA提取前从片状植物组织中淋洗出细胞方案二;东南景天表面灭菌方法：整株植物用自来水冲洗30min,用蒸馏水洗3次,每次3min;用吸水纸吸去植物表面水分,用无菌剪刀在根基部将根系剪下,与植物地上部分开;将根系用70%酒精浸泡2min,无菌水洗3次,3%NaClO浸泡2次,每次1min,然后用无菌水冲洗3次,每次2min,最后一次清洗液涂LB平板;1.将2g左右消毒后植物组织于无菌研钵中,加5mL磷酸钠缓冲液19.9gNa2HPO4·H2O,1.27gNaH2PO4·2H2O,H2O定容到1L研磨至匀浆;2.将植物匀浆转移至50mL无菌离心管中,摇床200rpm振荡1-2h,使细菌细胞尽可能的从植物组织中释放出来;3.取4mL悬液于新的无菌离心管中,12000×g离心10min收集菌体细胞;4.弃上清,将收集的菌体细胞重新溶于550μL1×TEbuffer Tris-EDTA；pH8中加入10mgmL-1溶菌酶10μL,37℃水浴1-4h;5.加入50μL20%SDS和8μL20mgmL-1蛋白酶K,混匀,65℃水浴3h,期间轻轻上下颠倒混匀数次;6.加入200μL5MNaCl,涡旋振荡15s,12000×g离心10min;7．取上清液,并向上清液中加入等体积的氯仿-异戊醇24:1,彻底混匀,12000×g离心10min;8.上清液转移至新的无菌离心管中,重复步骤7一次;9.上清液转移至新的无菌离心管中,加入0.6倍体积0.6vol的冰冷的异丙醇,4℃放置1h;10.4℃,12000×g离心10min,弃上清;11.沉淀用70%冰乙醇清洗,离心,弃上清;12.DNA沉淀室温风干后,用无菌超纯水溶解;13.DNA纯化采用TIANquickMidiPurificationKit;微生物16SrRNA基因V5-V6-V7区域扩增引物：799F2：GATGGCCATTACGGCCNNNNNN1193R：ACGCATCCCCACCTTCCTC用含10%SDS提取缓冲液NaP缓冲液重新悬浮细胞团块;用直径0.11mm的玻璃珠珠打操作50s,以溶解细胞;用苯酚-Tris pH8溶液和氯仿/异戊醇提取,用0.6vol的异丙醇和0.5mol/LNaCl通过沉淀再次获得DNA;用70%的乙醇洗涤细胞团块,真空干燥,再溶解在50μl的超纯水中;原始DNA提取物用Glassmilkpurificationkit Bio101,LaJolla,CA进一步纯化;所需试剂：Na2HPO4·H2O,NaH2PO4·2H2O,10%SDS十二烷基硫酸钠,Tris饱和酚,氯仿/异戊醇体积比24:1混合,异丙醇,0.5mol/LNaCl,70%乙醇;苯酚、氯仿、异戊醇在DNA提取时的作用抽提DNA去除蛋白质时,怎样使用酚与氯仿较好酚与氯仿是非极性分子,水是极性分子,当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时,蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去,使蛋白失去水合状态而变性;经过离心,变性蛋白质的密度比水的密度为大,因而与水相分离,沉淀在水相下面,从而与溶解在水相中的DNA分开;而酚与氯仿有机溶剂比重更大,保留在最下层;作为表面变性的酚与氯仿,在去除蛋白质的作用中,各有利弊,酚的变性作用大,但酚与水相有一定程度的互溶,大约10％～15％的水溶解在酚相中,因而损失了这部分水相中的DNA,而氯仿的变性作用不如酚效果好,但氯仿与水不相混溶,不会带走DNA;所以在抽提过程中,混合使用酚与氯仿效果最好;经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚,由于酚与氯仿是互溶的,可用氯仿第二次变性蛋白质,此时一起将酚带走;也可以在第二次抽提时,将酚与氯仿混合1:1使用;为什么用酚与氯仿抽提DNA时,还要加少量的异戊酵在抽提DNA时,为了混合均匀,必须剧烈振荡容器数次,这时在混合液内易产生气泡,气泡会阻止相互间的充分作用;加入异戊醇能降低分子表面张力,所以能减少抽提过程中的泡沫产生;一般采用氯仿与异戊酵为24：1之比;也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为25：24:1不必先配制,可在临用前把一份酚加一份24：1的氯仿与异戊醇即成,同时异戊醇有助于分相,使离心后的上层水相,中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定Tris平衡苯酚的配制方法1.使用原料：大多数市售液化苯酚是清亮无色的,无需重便可用于分子生物学实验;但有些液化苯酚呈粉红色或黄色,应避免使用;同时也应避免使用结晶苯酚,结晶苯酚必须在160℃对其进行重除去诸如醌等氧化产物,这些氧化产物可引起磷酸二酯键的断裂或导致RNA和DNA的交联等;因此,苯酚的质量对DNA、RNA 的提取极为重要,我们推荐使用高质量的苯酚进行分子生物学实验;2.操作注意：苯酚腐蚀性极强,并可引起严重灼伤,操作时应戴手套及防护镜等;所有操作均应在通风橱中进行,与苯酚接触过的皮肤部位应用大量水清洗,并用肥皂和水洗涤,忌用乙醇;3.苯酚平衡：因为在酸性pH条件下DNA分配于有机相,因此使用苯酚前必须对苯酚进行平衡使其pH值达到7.8以上,苯酚平衡操作方法如下：①液化苯酚应贮存于-20℃,此时的苯酚呈现结晶状态;从冰柜中取出的苯酚首先在室温下放置使其达到室温,然后在68℃中使苯酚充分溶解;②加入羟基喹啉8-Quinolinol至终浓度0.1％;该化合物是一种还原剂、RNA 酶的不完全抑制剂及金属离子的弱螯合剂,同时因其呈黄色;有助于方便识别有机相;③加入等体积的1M -HClpH8.0,使用磁力搅拌15分钟,静置使其充分分层后,除去上层水相;④重复操作步骤③;⑤加入等体积的0.1M -HClpH8.0,使用磁力搅拌15分钟,静置使其充分分层后,除去上层水相;⑥重复操作步骤⑤,稍微残留部分上层水相;⑦使用pH确认有机相的pH值大于7.8;⑧将苯酚置于棕色玻璃瓶中4℃避光保存唐琳的引物：F357GC5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGC AG-3’R5185’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’。
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d植物内生菌分离处理方法刘明志。
南方红豆杉产紫杉醇内生真菌的分离。
热带亚热带植物学报，2011，19(4):360～364剥取红豆杉的老树皮，截成2～3 cm长的小段，去除树皮层，先用75%酒精中浸泡30 s，无菌水冲洗3次，再用0．1%升汞溶液浸泡8 min，无菌水冲洗3～5次。
用无菌滤纸吸干表面水分，用无菌解剖刀将小段切成0．5 cm左右长的小块，接种于加有100 mg L－1青霉素和链霉素的PDA固体培养基表面。
每皿放置10块，依次编号，置于25℃恒温培养箱中培养。
幼茎内生菌的分离方法同上，将幼茎切成1 cm长的小段，以伤口断面垂直接种于PDA固体培养基上培养。
红豆杉叶片内生菌的分离采用两种方法，第一种方法与树皮内生菌的分离方法类似，分离时将叶片切成2至3段，接种于PDA固体培养基上;第二种方法是将叶片消毒后用无菌研钵研磨成匀浆液，然后将研磨液倾倒于PDA固体培养基上，置于25℃恒温培养箱中培养。
1刘金花。
黄花蒿内生菌的分离与初步鉴定。
２０１１，３３（４）：２７～３０黄花蒿的根，茎，叶，叶切成1cm2,茎和叶切成1cm左右小段（两端皆有切口），将根，茎，叶一次用75%酒精浸1min，再用1%的次氯酸钙溶液浸，置于含双抗的VA培养基平板培养泡1min,用无菌水冲洗5次。
待切口处长出菌落后转至PDA培养基进行内生真菌的分离。
2宋培勇，珙桐内生细菌的分离鉴定及系统发育分析，2011, 38(1): 8?13将采集的新鲜珙桐的茎、叶和叶柄分别用流水冲洗, 风干表面水分, 剪成小块或小段,无菌水漂洗 2 次, 75%酒精浸泡 1 min, 再用 2%NaClO 溶液中浸泡 3 min, 转入 75%酒精中浸泡 30 s,接着用无菌水漂洗 3 次, 平放于 NA 平板上, 28 °C培养 2?3 d。
取最后一次漂洗液涂布 NA 平板作为对照。
内生菌分离和纯化。
将 NA 平板上组织块下或周缘长出的菌落或菌苔划线稀释分离 1-2 次直到获得纯培养3孙传伯。
毛豆内生菌的分离及生物学特征观察。
(2011)10- 0026- 02（1）从供试材料上取植物组织 1. 0 g, 用 70% (体积分数 )酒精浸泡 30 s, 用无菌水漂洗后, 置于 1% (体积分数 )次氯酸钠水溶液中表面消毒 3- 5min(其中叶片和花消毒 3 m in, 茎和果消毒 5m in), 再取出植物组织用无菌水冲洗 3次. 样品晾干后分别置于无菌研钵中加 5 mL 无菌水研磨成浆状, 静置 10- 15 m in后, 每一样品各取上层澄清液 50 LL 分别涂布在培养基 ( NA、KB和TSA ) 平板上, 每种培养基涂布 3皿, 28 e 黑暗培养48- 72 h, 计算每一平板的菌落数. 表面消毒后, 在研磨前取 50 LL 无菌水冲洗液涂布平板;或是通过组织印迹试验, 将最后一次清洗的植物组织在培养基平板上印一下, 按上述条件培养 48 h, 观察有无菌落产生, 以验证采用该消毒方法是否能杀死供试材料表生微生物. 根据菌落形态、颜色等挑取单菌落, 划线分离、纯化后保存、备用.在融化并冷却至 45 e 的NA 培养基中加入待测病原菌的悬浮液, 其中每 100 mL 培养基加 1 mL 细菌悬浮液, 倒入平板. 采用点接法将内生菌接种于 NA平板上, 每个平板上等距离点接 5株不同的内生细菌菌株, 每组进行 2次平行试验, 在恒温箱中 28 e 下培养, 2 d后观察有无抑菌圈生成.（2）采用组织切块法, 进行表面消毒,再用灭菌的蒸馏水清洗, 检验灭菌效果。
内生细菌的分离前,将采回的样本用自来水洗净, 并用无菌纸吸干水分,切取支根 110 cm 长的小段, 须根切成 115 cm的小块, 进行组织表面清毒, 棉花根部切段后经无菌水冲洗 3次,用 75% 酒精浸泡 5m in、7m in、10m in后, 然后分别用011% 升汞溶液处理 4 m in、6 m in、8 m in进行表面灭菌,此试验分别重复 3次。
最后用无菌水冲洗 4次, 最后一次冲洗液涂 3种不同培养基平板, 26~ 28e 下培养2~ 3d, 筛选出最佳消毒时间和培养基, 将表面消毒彻底棉花根部切块放入灭菌研钵中用无菌水冲洗 4次,取上清液涂抹于培养基上。
以无菌水冲洗为对照试验。
培养 2d后观察灭菌效果, 直到彻底表面灭菌, 再进行最后的内生菌分离。
将组织块在研钵中充分研磨成匀浆,取上清匀浆涂抹于 3种不同培养基上, 取匀浆涂布于不同培养基平板, 每浓度重复 3次, 然后将培养皿置于26~ 28e 恒温箱中培养2~ 3d, 观察培养出的菌落形态。
（3）再将材料放进经过紫外线消毒的超净工作台内, 切割成小段, 按常规无菌操作进行表面消费处理: 75% 乙醇浸泡 3 min y无菌水冲洗 3 遍 y011% 升汞浸泡 8 m in y 无菌水冲洗 3 遍。
将上述处理过的材料经滤纸吸干水分后, 在无菌条件下切成015 cm@015 cm 的小块, 放置于新鲜的 PDA 平板培养基上, 每个平板放置 4 块, 28 e 恒温培养 3~ 7 d。
待切口边缘长出真菌菌丝, 及时转接至新鲜 PDA 培养基上培养, 采用菌丝顶端纯化法逐步纯化。
同时, 以消毒后不做切割的材料作为空白对照, 同样条件下观察是否有菌长出, 结果对照材料周围无任何菌长出, 证明表面消费彻底。
212 内生真菌的鉴定: 采用真菌学插片培养方法,对分离获得的见血封喉内生真菌进行显微形态特征( 菌丝、孢子形态等) 的观察、分类鉴定。
分类检索参照文献报道[ 8]。
213 内生真菌的发酵上清液制备: 将分离得到的菌株, 切取黄豆粒大小的菌丝块, 接种于 PDB 培养基中。
1 L 三角瓶装400 mL 培养液, 室温, 164 r/ min振荡培养7 d, 同时以纯培养基作空白对照。
无菌条件下取发酵液 15 mL 于离心管中, 12 000 r/ min 离心 30 min 后取上清液, 用 012Lm 微孔滤膜滤过除菌, - 20 e 保存备用。
214 抑菌活性测定: 采用杯碟法测定样品抑菌活性。
金黄色葡萄球菌和 MRSA 采用 NA 培养基, 白色念珠菌采用 YPD 培养基。
将金黄色葡萄球菌、M RSA 和白色念珠菌分别制成一定浓度的菌悬液( 1@105~ 1@107cfu/ m L) , 用棉签将其均匀涂布在供试无菌培养皿中, 制成含菌平板, 然后在每个平板放入 3 个牛津杯, 分别取样品 200 微升加入其内, 同时以发酵纯培养基作阴性对照。
金黄色葡萄球菌和M RSA 在 37 e 下恒温培养, 白色念珠菌在 28 e 下恒温培养。
24 h 后观察结果, 测量并记录抑菌圈直径。
每个样品做 3 个重复, 以抑菌圈直径的平均值为试验结果4张鑫，生菌的分离方法及其次级代谢产物研究,(2011)02-0023-04内从药用植物圣罗勒的健康叶子上分离出4 种内生细菌 OS －9、OS －10、OS －11和 OS －12。
他们首先将叶子用流水冲洗 10 min，随后于 1% 的次氯酸钠中浸泡 10 min，再用0． 02 mol / L、pH 7． 0 的无菌磷酸钾缓冲液( PB) 漂洗4 次，每次洗后取100 μL 漂洗液转移到装有 5 mL肉汤培养基的离心管中，经过 48 h 震荡培养( 条件是 200 rpm，28 ℃) ，检测样品表面消毒是否彻底。
分离过程为选用紫外线和75%酒精作为表面消毒剂，经过多次消毒，加无菌水将材料研磨后，再将研磨液涂布。
5李铭, 石耳目地衣(2011) 02-0014-07无6刘杰凤, 小白菜内生菌的分离及菌核菌拮抗菌的筛选（2011）13－2676-04健康的小白菜，染病的小白菜。
采回的植株用流水冲洗干净，剪成小段，75％酒精中浸泡3 min，再用10％次氯酸钠浸泡一定时间：茎为8 min，根和叶由于气孔较茎大，浸泡5 min即可，然后用无菌水浸泡多次，每次3 min，表面消毒检测至漂洗液无菌落长出为止，一般为3～4次。
在无菌条件下用适量的PBS缓冲液捣碎，充分搅拌后静置3 min，取上清液0．5 mL分别涂布于分离培养基平板上，每种材料做3次平行，以最后一次的漂洗液作对照，30 ℃下培养一个星期。
挑取不同形态的菌落，平板划线进行3～4次的传代纯化、镜检、斜面低温保存。
选取具有明显菌核菌病症的小白菜，采用常规组织分离方法从长菌丝及菌核处取样，接种于PDA培养基中（添加10％的1 ／ 3 000孟加拉红溶液），30 ℃培养至长出白色菌丝后，取白色菌丝进行多次划线纯化至纯种，斜面低温保存。
7将朱士茂，银杏内生菌的分离与鉴定 2011新采集的银杏枝条，叶子和根放在自来水中冲洗干净，然后将枝条和根截成3 －4cm 长，将叶子和叶柄分开，分别将根，枝，叶放在不同的灭菌后的广口瓶中．之后在超净工作台进行消毒。
根的表面灭菌: 0. 1%的土温 20 消毒 1min，无菌蒸馏水冲洗 2 次，75%的乙醇消毒30s，无菌蒸馏水冲洗 2 次，0. 1% 升汞消毒 5min，无菌蒸馏水冲洗 5 次。
枝的表面灭菌: 75% 的乙醇消毒 30s，无菌蒸馏冲洗 3 次，0. 1% 升汞消毒7min，无菌蒸馏水冲洗 5 次，叶子和叶柄的灭菌: 75% 的乙醇消毒 10s，无菌蒸馏冲洗 3 次，0. 1% 升汞消毒5min，无菌蒸馏水冲洗 5 次，对照实验: ①将以上接入的每种平皿按相同的方法接入 5min 后用无菌镊子取出;②用无菌蒸馏水冲洗已表面灭菌后的材料，然后将此液体移入培养基中，培养观察。
2. 3 内生菌的分离在超净工作台中用无菌镊子挑取根放在无菌培养皿中，将其表皮剥离，用无菌小刀纵切表皮取其中间的部分，然后将其切成0. 5cm ×0. 5cm 大小，插入到培养基中。
茎皮内生菌的获取同上，其次茎的木质部切成半径 1cm 长 2cm 的部分接入培养基中。
叶，叶柄中内生菌的获取一是将叶切成0. 5 ×0. 5 大小接入培养基中，二是用研钵将叶磨碎 ( 内放石英砂和生理盐水) 然后用无菌移液管吸取0. 2ml 放入培养皿中，最后用玻璃涂棒涂布均匀 ( 以上材料均接入五种培养基中，且每种均接三次) 。
对照实验: 将表面消毒过的材料用无菌镊子夹取后在培养基中滚动2min 后弃掉，而且最后一次永无菌蒸馏水冲洗的冲洗液转入到五种培养基中培养( 将上述培养皿放入温箱终于27℃培养) 。
8肖淑贤, 植物内生菌的研究概况及应用进展 2011.01.013分离时可选取长势好、无病害的植株。
分离方法通常是直接切取植物组织或榨取植物组织汁液稀释。