用亲和层析策略解决质粒DNA纯化的难题王亮根
亲和层析原理和步骤 ppt课件
亲和层析原理和步骤
一、原理
亲和层析是利用生物大分子所具有的专 一亲和力而设计的纯化技术
➢ 寻找配基 ➢ 配基固定化 ➢ 制成亲和层析柱
亲和层析原理和步骤
基本过程
•固相化
+
亲和层析原理和步骤
吸附
+
+ 洗 脱
亲和层析原理和步骤
解吸
+
亲和层析原理和步骤
断键方法：硫酯键、偶氮键、二硫键 （3）专一性洗脱
亲和层析原理和步骤
4、亲和柱的再生：
已使用过和柱，经过再生处理，去除 非特异吸附的杂质后，可重复使用
再生步骤： 起始缓冲液重复平衡一次 用高离子强度和低离子强度溶液处理 用弱酸或弱碱溶液处理
亲和层析原理和步骤
三、特点
1、一步纯化步骤 2、产物非常纯 3、可从很稀的溶液中纯化到所需物质 4、可去除已变性或部分降解物质
（5）多孔玻璃 特点：不受微生物的侵蚀
耐酸、碱、有机溶剂 表面非专一性吸附
亲和层析原理和步骤
（二）配基的选择 1、对于欲纯化的物质应有专一亲和力 2、必须具备能被修饰的功能基团
亲和层析原理和步骤
以酶和底物为例：
KL：解离常数 E： 酶
E+L
KL
EL
L： 底物 EL：复合物
KL =[E][L]/[EL]=[E0-EL][L0-EL]/[EL]
（2）葡聚糖凝胶 特点： 化学及物理性质稳定
多孔性比琼脂糖低
亲和层析原理和步骤
（3）琼脂糖凝胶
浓度 商品 2% Sepharose 2B 4% Sepharose 4B 6% Sepharose 6B
亲和层析_精品文档
利于酸性蛋白的偶联。
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5、CM-生物胶A、亲和胶202和亲和胶102 CM Bio-Gel A，无“手臂” 的羧基衍生物； Affi-Gel 102具有6个原子“手臂”，未端为氨基。 Affi-Gel202具有10个原子的“手臂”，未端具有羧基；
（二）、空间障碍的影响
空间位阻。 对于分子大的配体以及小分
子配基更明显。
“手臂”，增加与载体相连 配基的活动度，减轻载体的 立体障碍。
常用的“手臂”多为烃链。
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（三）、配基与载体的结合位点的影响
多肽或蛋白质等大分子配基 须控制偶联反应条件，使它以最少的功能基
团与载体连接。 保持蛋白质原有的高级结构，使亲和吸附剂
（2）当ESI稳定性与EI相同时，I的存在并不 影响E对S的结合，非竞争性效应。
（3）反竞争性效应，即ESI比EI稳定，I使E与 S结合更紧密（负洗脱） 。
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反竞争性效应
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亲和层析中配基的选择和洗脱条件
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（三）、亲和吸附剂的再生
用缓冲液充分平衡后即可重复使用。 亲和力下降，非特异吸附增加，大多由
联。
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34
3、环氧活化型Sepharose 6B
由亲水“手臂”与Sepharose 6B载体 通过醚链形成的衍生物。
用于小分子配基的固定化。 用于偶联脂多糖、蛋白等大分子配基。
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4、活化型亲和胶10和15
由N-羟琥珀酰亚胺与琼脂糖衍生物形成的活化酯。 Affi-Gel10的“手臂”长为10个碳原子，产生一些负电荷，有
择性。
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（二）、亲和层析的洗脱
3种进行基因工程表达目的蛋白质的分离纯化方法
3种进行基因工程表达目的蛋白质的分离纯化方法在基因工程研究中，蛋白质分离纯化是非常重要的一环。
下面将介绍三种常用的基因工程表达目的蛋白质分离纯化方法。
1. 亲和层析法：亲和层析法是一种常用的蛋白质纯化方法，基于特定配体与目标蛋白质之间的选择性结合。
通常，可以在目标蛋白质中引入一个标签序列，如融合标签或标签标记，使其与固定在纯化层析柱上的配体相互作用。
配体可以是金属离子、抗体、亲和剂或其他具有与目标蛋白质选择性相互作用的分子。
利用这种亲和层析柱进行分离纯化时，可以通过洗脱缓冲液中高浓度的竞争性配体或特定的环境条件来实现目标蛋白质的高效纯化。
2. 凝胶电泳法：凝胶电泳法是一种常用的蛋白质分离技术，根据蛋白质在电场中的迁移速率差异进行分离纯化。
通常，首先将表达目的蛋白质从细胞裂解物或培养基中提取出来，并用浓缩技术进行初步富集。
然后，将蛋白质样品加载到凝胶（如SDS-PAGE凝胶）中，通过应用电场分离蛋白质。
根据蛋白质的大小和电荷来进行分离，并用染色或质谱等方法进行检测和分析。
3. 逆流层析法：逆流层析法是一种有效的分离纯化方法，根据蛋白质在逆流梯度中的亲和性差异进行分离。
该方法可通过将纯化柱分为若干区域，每个区域都包含不同浓度的缓冲液，从而形成逆流梯度。
蛋白质溶液经过逆流层析柱时，蛋白质会在不同条件下与纯化柱表面相互作用，并在梯度中发生多次吸附和洗脱过程。
通过逆流层析的多次循环，可以逐步富集并纯化目标蛋白质。
综上所述，亲和层析法、凝胶电泳法和逆流层析法是基因工程表达目的蛋白质常用的分离纯化方法。
这些方法各具优势，可以根据目标蛋白质的性质和实验要求选择适合的方法，以获得高纯度的表达目的蛋白质。
[doc] 亲和层析一步纯化IgM类单克隆抗体
![[doc] 亲和层析一步纯化IgM类单克隆抗体](https://img.taocdn.com/s3/m/0fed02adf12d2af90242e6b2.png)
亲和层析一步纯化IgM类单克隆抗体嚷克休通讯1989年第一(譬苹26朝J:6一亲和层析一步纯化IgM类单克隆抗体玉芳范春荣黄劲松(一胃药.I1,生物一硷童所,七京)本文夼绍j用免抗鼠IgM血清制备的亲知层沂柱从小鼠腹水中一步提纯单克隆抗体IgM的方法提纯的IgM压用琼脂糖电泳检测为一个区带应用迁碌条件下的SDS—PAGE拴测分离为分子量～80K的重链和～25K的轻篷两条医带,几未见其他鲁带;应用免疫印米法鉴引.进一步确证IgM,不合常见的鲁质IgG.实验过程还发现提她的IgMT-够稳定,在贮存过程有降解现象.另外厘用同一亲和柱从吸附IgG后的小鼠血清中提取多克隆抗体IgM的砬襄也是良好的,经用还原条件下的SDS—PAGE检测,同样也只分离为轻童链两睾匡带,未见混有其他奈蛋白.随着单克隆抗体(McAb)的广泛应用.对其研究也日益深入,但含McAb的细胞培养上清腹水和血清中含有大量的杂蛋白和其他犬分子物质使McAb的研究和应用受到一定的限制,固而常需进行纯化各实验室制备的McAb最常见的为IgG类和1gM类抗体,一般来说,提纯IgG类抗体的方法较多,操作较简易,而igM类抗体的纯化就较困难,常用的方法是凝胶过滤法如Nicholas等(1982)”?和B&livet等(1984)报道的方法,撵作都较繁锁,提取的IgM纯度也不高;亲和层折法虽是提取IgM的简易有效法,又常受难于得到理想免疫吸附荆的限制而无法采用我们于1986年采用一个简易微量法研制成功了兔抗鼠IgM血清:,为采用亲和层析法提取IgM创造了必要的条件,用该法一步提纯的IgM经琼脂糖电泳分析为一条区带SDS—PAGE(还原)分离为重链和轻链两条区带.几乎未樯出其他杂蛋白区带材料和方法～材料来源McAbJgM系兰州生物制品研究所赠送的HBsAgMcab小鼠腹水正常小鼠血清为昆明}1小鼠血清:SF2/0瘤株小鼠腹水,本所茁苗二室制备;免抗鼠IgM血清,本实验室研制:辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG血清丹麦Kern—En—Tee产品:硝酸纤维膜(卜C)浙江黄岩化工厂产品;其他化学试剂为分析纯级.=,抗鼠IgM亲和屡折柱的制备免抗鼠IgM血清8m{经50饱和度硫酸胺粗提后,用 D.1MNe,HCO3—0.5MNaCI透析平衡,J52.5gCNBr活化Se!ab;arose4B(瑞典Pha—illarcia产品)偶联,操作参照其使用说明书进行,然后装柱(1×11CEl1),用流洗缓冲渡(o.01MTris—HC】_0.001MEDTA一0.1MNaCIpH7.6)平衡待用三,蛋白含量测定分光光度法,280rim波长测光密度值(oD)四HBsAg抗体活性测定血凝法,血球诊断试剂系北京生物制品研究所生产.五,琼脂糖电泳用0.06MpH8.6巴比妥缓冲液配制l琼脂糖凝胶,按常规浇板打孔电泳染色脱色.67六,sDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)(还原)参照fJeamm(A(1970)”方法进行?分离胶浓度为10或l3%.七,免疫印染参照Towbi(1979):方法进行,先将抗原采用SDS—PAGE(还原)分离,再应用LKB2005Transphor电转移仪将聚丙烯酰胺凝胶上己分离的抗原区带转移至硝酸纤维素膜(NC)上,用2吐温20封闭,加相应的第一抗体(适当稀释)冰箱过夜次日洗涤后,加辣根过氧化物酶标记第二抗体(5O0~IOOU倍稀释)室温培育l一2小时.再加二氨基联苯胺底物液显色,换蒸馏水终止反应,观察结果结果和讨论一,IgM类McAb的提取将HBsAgMcAbIgM小鼠蝮水2ml加于抗鼠IgM亲和柱上,待样品完全进胶后置冰箱过夜,使其充分吸附,次日取出用0.01MTris-HC1—0001MEDTA一01MNaCIpH7,6缓冲液充分流冼,除去未结合的蛋白,换用01M甘氨酸一HC1pH24缓冲液洗脱吸附蛋白,分管收集,每管约4m1,并立即用lNNaOH调pH至6.0L右,测OD及HBsAB 抗体活性,由图l看出冼脱液中含单一蛋白锐峰,经活性测定为HBsAg抗体.1?3?号4.图lMcAbIgM的洗脱蟑=.提纯IgM的琼脂糖电泳图2提纯McAbIgM的琼脂电泳由于TgM的分子量比较大,故提igVJ后的标本采用无分}筛效应的琼脂糖电泳进行.并同时用HBsAgMcAhIgM/]~鼠腹水,正常小鼠血清及鼠血清IgG作对照分析结果见图2.可看出提纯的IgM除加样孔左侧呈现一条区带外,未检出对照媛水中的其他蛋白医带,以及与主要泳动在加样孔周围的鼠血清IgG也完全不同,表明经亲和星析提取出单一.的IgM类McAb舳M愎叫地嘴椽三,提纯ticAbIgti的SDS-PAGE(还原)将图l中亲和层析纯化MeAbIgM洗脱的第3,4,5管与提纯前的HBsAhMcAbtJ~鼠腹水,正常小鼠血清,小鼠血清IgG同时进行SDS—PAGE(还原)分析,并以己知分子量标志物作对照,结果见图3,可看出第3,4,5管样品皆解离为分子量一80K(相当髓)和一2sK(相当轻链)的两个区带,除长二区带外未见其他蛋白医带.而小鼠血清IgG重链(Y链)一55K.轻链也一25K,以上结果再次汪明经亲和层析一步纯化的McAbIgM,除去了原腹水中各黎蛋白达到了电泳纯:1.正常小鼠『血清2.HBAgMcAb/j,裂膛求3.挺缝的McAbIgM第3管4.提纯的McAbIgM第4管5.提纯的McAbIgM第5管6.小鼠血清IgG7.巳知蛋白分子量标志(从上到下)rrk,681~,k,45k,25k,11.rk图3提纯McAbIgM的SDS—PAGE(还原)四,用兔瘦印染法鉴定提纯的M~AbIgM按照免疫印染法先采用SDS—PAGE(还原)将提纯的McAbIgM进行分离,同时以McAbIgG(IgG)及小鼠血清IgG作对照(图4A).然后电转移至NC膜上,一式三份,一份考马斯亮监染色后作对照(图4B):一份加抗鼠IgM血清与之作用,显色(图4C);一份加抗鼠IgG血清与之作弼,显色(图4D),结果如下:(一)由图4C看出三}样品与抗鼠IgM血清作用后,待检IgM的链和轻链显色很深,确证该样品为IgM娄,但除此尚有非重轻链的两条区带(因含量较低,图4A和B皆未染出)也显色,是否杂蛋白.留持下面讨论:对照McAbIgG仅轻链显色,显示未检出IgM,但轻链与待槛IgM的轻链有交义反应:小鼠血清lgG无显色区带,表明不含igMf二)由图4D看出三珊样品与抗鼠lgG血清作用后,待橙IgM仅轻链显色,证明不含IgG.只是一次证叼其轻链与IgG的轻链出现交义反应;对照McAbI§G 因为IBG亚类.所链和轻链显色都很深,陈此尚有分子量小于链的8—9条医带显色,我们分析是由于该抗体不姑稳定,在保存过程IgG分子形成碎片,故也显色小鼠血清IgG,因JgG仅为其69成分之一其余为其他亚类,因而虽然其加样量NMcAbIgG相近(皆约1.5fig),但链的显色远~McAhI§G浅,轻链未显色就可能是NMcAhIEG的轻链非同种,图4提纯McAblgM的免疫印染图5(A)SDS—PAGE(还原)1.小鼠皿清IgG2.提纯的McAbIgM3.McAbIgGl贮存McAbIgM的sDs—PAGE(还原)1.正常小鼠皿清2.,鼠请IgG3.贮存2个多月~MeAbIgM(B)转咎有A中二种样品的NC(,芎马斯亮蓝染色)(C)转移有A中三种洋品的NC与抗鼠IgM结台船显色图谱(D)转移有A巾三种样品的NC与抗鼠IgG结台的显色图谱综上结果即本实验提纯的IgM进一步确证为IgM类,且不含血清中的主要成分IgGl,至于图4C中尚拉出非链和轻链的区带问题,我们认为并非杂蛋白,而是IgM分子的降解产物,不仅其能与抗IgM血清作用,显色,而且在我们以前的实验中曾发现新提取的该抗体,采用SDS—PAGE(还原)分析仅解离成链和弪链两条区带,但同一标本在冰箱贮存一段时间后,再次分析,就可出现上述解离为4条区带的现象,见图5,只是这钟不稳定现象是个别MeAbIgM的特点,还是IgM分子的通性,就有待进一步观察了; 五,鼠血清多克隆IgM的提取在应用抗IgM亲和层析拄提~McAbIgM之后,叉应用同一亲和柱从经SPA一4B柱吸附IgG后的小鼠血清中提取了鼠多克隆IgM.结果经用SDS—PAGE(还原)证明,提取的效果也是良好的同样只梭出IgM的重链和轻链两条区带,未见混有其他杂蛋白成分见图6.7O】.已知蛋白分子量标志(上到下)7rk86k,5,45k,11.7k2.小鼠血清IgG3.Se2/0瘤株小鼠腹水4.HBAgMcAb小鼠腹.提纯的McAbIgM6.犍纯的McAbIgM27.提取McAbIgM.c~的小鼠疆瘩8.正常小鼠血清9.拄纯的小鼠血谪IgM10.提取IgG’TnIgM后的小鼠血清固6提纯小鼠血清Ig_’vl的SDS—PAGE(还原)参考文献1.Kicholas,J.eEa1.:j.ImmItI101.Meth.53(2).150,1982. .BouvetJ.P.eta1:J.Imrattno].Meth.66,209,1984.范舂荣等《i…疫学泶》待发裘..Leamm1I,U.R.,NatrifeLondon),227,680,1970.5.Towbin,H.eta1:A.6,4350,1979. 鸡传染性法氏囊病病毒单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立乔忠詹丽娥枥静赵秋成孙世兴指导史振马丛林刘玎(i西省发科院畜牧兽医研究所土臣)(长春军事兽医大学军事兽医研宄所)鸡传染睫法氏囊病(IBD)又称甘博罗病,这是鸡的一种高度接触性传染病该病毒可引起免疫抑制,使新城疫苗的免疫效果降低或失败.使鸡对各种病原体的易感性增强,病死率增高,给养鸡业造成严重的经济损失.本文用经硫酸铵沉淀,高速度离心并经蔗糖密度梯度离心提纯的鸡传染性法氏囊病病毒免疫BALB/c小鼠取免疫鼠脾细胞与NS-l小鼠骨髓瘤细胞融台,共获儿株阳性杂交瘤细胞系,搔一次克隆化和ELISA检测,筛选出三三株(113-,5D,6D)能保持分泌IBD病毒单克隆抗体的杂炎瘤细胞系.培养上清液的ELISA效价为6.4>-il0,免疫脱水效价1.6×lEl..三株杂交瘤细胞系的染色体数为85—105条,证实为杂交细胞.本单克隆抗体的研制给鸡传染性法氏囊病的诊断和免疫提供r制剂=7l。
用免疫亲和层析柱作为预处理通过LC-MSMS法检测农水产品中氯霉素的残留-毕业论文
---文档均为word文档，下载后可直接编辑使用亦可打印--- 摘要食品安全引人重视，国计民生时刻关注。
食品安全无疑是小民生里渗透着的大科学。
如何使民众的身体健康与生命安全的得到有效保障？严峻的形势亟待我们建立一种有效的针对食品中存在的有毒有害物质进行提取，纯化并与检测仪器结合使用的高效分析检测方法。
这种预处理方法还应该具备简单、便捷、高效和可靠的特点。
氯霉素作为一种对人体健康有害的，常被滥用于农水产品的抗生素，有必要施行对它的便捷的预处理，以便后续检测。
本实验旨在建立一种单组分的氯霉素的免疫亲和色谱法，用于萃取分离富集虾肉样品的氯霉素残留。
将样品用免疫亲和层析柱预处理，再用高效液相色谱-质谱联用检测，在准确可靠的前提条件下，使得样品预处理的操作简单高效化，从而缩短分析时间，达到了简单便捷，高效可靠的目标。
本研究采用的免疫亲和柱，是把Protein G 树脂胶纯化的氯霉素的单克隆抗体，和溴化氰活化Sepharose 4B琼脂糖凝珠共价结合交联，再将此种复合物分装进EP管中制备而成的多个微型小“柱”。
经过实验的验证，实际样品虾肉能够用采用这种方法制备的免疫亲和色谱柱分析：它能将氯霉素从虾肉样品中提取分离，每50μL柱胶的最大柱容量为200ng每50μL柱胶。
在探究上样、淋洗和洗脱的条件后，建立梯度浓度氯霉素标液的S型曲线测定，找到了线性关系、检测限，线性范围内标液的回收率为78.9%-129.9%。
之后的实际样品的加标测定结果为：虾肉和奶粉加标量分别为2ng g−1时，回收率在80%左右，奶粉达到了90%。
为保证实验严谨，还进行了空白样品过柱实验作为阴性对照，并用HPLC-MS/MS进行测定无信号证明虾肉基质本身呈阴性。
关键词：样品预处理免疫亲和层析柱虾肉检测氯霉素高效液相色谱-质谱联用食品安全AbstractFood safety and people's livelihood attracts attention a lot. Food safety is undoubtedly a kind of great science that permeates the small people's livelihood. How to ensure people's food security, health and life quality? This is a grim situation that calls for us to establish an effective detection method for harmful toxic substances contained in food. This method should be simple, convenient, efficient and reliable as well. Chloramphenicol as a kind of antibiotic that harmful to human health, is often abused in agricultural water products ,so it’s naturally to carry out a kind of convenient detection of it. The aim of this experiment was to establish a single component of chloramphenicol immunoaffinity chromatography for the extraction of chloramphenicol residues in the samples. The sample pretreatment with immune affinity chromatography column, then detect with HPLC-MS/MS detection, at the same time ensuring the premise that accurate and reliable, make sample pretreatment operation simple and efficient, so as to shorten the analysis time, to achieve a simple and convenient, reliable and efficient target.The immune affinity column used in this research adopts chloramphenicol monoclonal antibody that has been purified and dialysis with the Protein G resin, covalently combine with CNBr activated Sepharose 4B gel beads, then repackage this compound into EP tube into multiple tiny little "column". As the experimental verification shows, the actual samples of the preparation of shrimp can use this immune affinity chromatography column way to analysis: it can do extraction and separation of chloramphenicol from the shrimp samples, every 50μL column glue has the maximum column capacity of 200ng. Oninquiry, leaching and elution conditions, establish the gradient concentration determination of chloramphenicol to draw a standard curve that give us the linearity, detection limit and the recovery rate of the fluid inside the limits of 78.9%-129.9%.The result of the addition of the actual sample was: 2ng g-1,recovery of shrimp on average is 80% and for milk it’s 90%.In order to conduct an accurate enough experiment, the blank sample was carried out as the negative control, with detection using HPLC-MS/MS.The outcome shows relative standard deviation of the real sample is blank.Keywords: specimen pretreatment, immune affinity chromatography column ，shrimp flesh detection, chloramphenicol, HPLC-MS/MS, food safety.第一章绪论1.1 引言对样品进行分析测试的整个流程大致为：目标样品的收集，样品的分解，样品净化，样品进样前的处理和样品上机测定一共五个流程，并且除了样品的测定外，剩余步骤粗泛而言都属于样品预处理。
磁珠法分离纯化DNA原理及其步骤
磁珠法别离纯化DNA原理及其步骤日期：2021-05-22 来源：互联网标签：核酸纯化核酸别离磁珠法纯化DNA摘要: 磁珠法纯化DNA主要是利用利息交换吸附材料吸附核酸，从而将核酸和蛋白质等其细胞中其他物质别离。
本文主要概述了磁珠法纯化DNA原理、核酸别离与纯化的原那么、核酸别离与纯化的步骤。
欢度大力神杯之夏，参与BRAND竞猜活动，获赠BRAND产品！GeneCopoeia：qPCR mix免费试用体验活动开场！磁珠法纯化DNA主要是利用利息交换吸附材料吸附核酸，从而将核酸和蛋白质等其细胞中其他物质别离。
本文主要概述了磁珠法纯化DNA原理、核酸别离与纯化的原那么、核酸别离与纯化的步骤。
磁珠法纯化DNA原理磁珠法核酸纯化技术采用了纳米级磁珠微珠，这种磁珠微珠的外表标记了一种官能团，能同核酸发生吸附反响。
硅磁(Magnetic Silica Particle)就是指磁珠微珠外表包裹一层硅材料，来吸附核酸，其纯化原理类型于玻璃奶的纯化方式。
离心磁珠是指磁珠微珠外表包裹了一层可发生离心交换的材料(如DEAE，COOH)等，从而到达吸附核酸目的。
不同性质的磁珠微珠所对应的纯化原理是不一致。
使用磁珠法来纯化核酸的最大优点就是自动化。
磁珠在磁场条件下可以发生聚集或分散，从而可彻底摆脱离心等所需的手工操作流程。
Omega拥有全面的磁珠法核酸别离试剂盒，基于这种技术的试剂盒，名称前都有’Mag-Bind’。
核酸别离与纯化的原那么核酸在细胞中总是与各种蛋白质结合在一起的。
核酸的别离主要是指将核酸与蛋白质、多糖、脂肪等生物大分子物质分开。
在别离核酸时应遵循以下原那么:保证核酸分子一级构造的完整性：排除其他分子污染。
核酸别离与纯化的步骤大多数核酸别离与纯化的方法一般都包括了细胞裂解、酶处理、核酸与其他生物大分子物质别离、核酸纯化等几个主要步骤。
每一步骤又可由多种不同的方法单独或联合实现。
1. 细胞裂解:核酸必须从细胞或其他生物物质中释放出来。
dna亲和层析
dna亲和层析
DNA亲和层析是一种常用的分离和纯化DNA的方法。
它利用DNA 与某些化合物或蛋白质之间的特异性相互作用，将目标DNA从混合物中分离出来。
DNA亲和层析的原理是基于DNA与某些化合物或蛋白质之间的特异性相互作用，这种相互作用可以是静电相互作用、氢键相互作用、范德华力相互作用等。
DNA亲和层析的步骤包括：制备亲和层析柱、样品处理、样品加载、洗脱和回收。
首先，制备亲和层析柱，选择合适的亲和基质，将其填充到柱子中。
然后，将待纯化的DNA样品处理，去除杂质，使其达到适合亲和层析的纯度。
接着，将样品加载到亲和层析柱中，目标DNA与亲和基质发生特异性相互作用，被捕获在柱子中。
随后，进行洗脱，用洗脱缓冲液洗去非特异性结合的杂质，保留目标DNA。
最后，回收目标DNA，用适当的缓冲液洗脱，得到纯净的DNA。
DNA亲和层析具有高效、高选择性、易于操作等优点。
它可以用于分离和纯化各种类型的DNA，如基因组DNA、质粒DNA、RNA-DNA杂交物等。
此外，DNA亲和层析还可以与其他技术相结合，如PCR、DNA测序等，用于分析和研究DNA序列、结构和功能等方面的问题。
DNA亲和层析是一种重要的DNA分离和纯化技术，具有广泛的应用前景。
随着生物技术的不断发展，DNA亲和层析技术将在基因工程、生物医学、农业等领域发挥越来越重要的作用。
亲和层析法纯化酶的研究进展
亲和层析法纯化酶的研究进展亲和层析法是一种常用的酶纯化技术，其通过利用酶与其特异性结合物（亲和柱上的配体）之间的相互作用，对复杂的混合物进行分离和纯化。
本文将探讨亲和层析法在酶纯化领域的研究进展。
一、亲和层析法的原理亲和层析法基于酶与其特异性配体之间的特定相互作用。
酶可以与配体形成高度特异性和稳定的复合物，这是亲和层析法的基础。
配体通常通过共价或非共价结合在固定相（如亲和柱）上，而酶则在流经柱子时与配体结合。
通过对流动相的调节，可以实现在柱子上进行选择性的酶结合和洗脱，从而纯化目标酶。
二、亲和柱的选择选择适当的亲和柱对于酶的纯化至关重要。
常见的亲和柱包括亲和素亲和柱、金属螯合层析柱、亲和抗体亲和柱等。
根据目标酶与配体的相互作用类型，合理选择亲和柱可以提高亲和层析法的分离效果和纯化程度。
三、多步骤纯化策略的应用亲和层析法可以与其他纯化技术相结合，形成多步骤纯化策略，以提高酶纯化的效果。
常见的多步骤纯化策略包括离子交换层析、凝胶渗透层析、亲和层析法等。
通过不同纯化步骤的有序进行，可以有效地去除杂质，并提高纯化程度。
四、亲和层析法在酶纯化中的应用案例亲和层析法在酶纯化中得到广泛应用。
以乳酸脱氢酶（LDH）为例，研究人员利用LDH与NAD+/NADH的特异结合，设计了亲和层析法纯化方案。
首先，将NAD+/NADH修饰在亲和柱上，随后经过样品加载、非特异性洗脱和特异性洗脱等步骤，最终获得高纯度的LDH。
另外，亲和层析法还可以与其他技术相结合，用于纯化具有糖基化修饰的酶。
例如，将糖结合蛋白（如Concanavalin A）修饰在亲和柱上，可实现糖酶的选择性捕获和纯化。
五、亲和层析法的优势与限制亲和层析法具有选择性高、纯化程度高、操作简便等优点，广泛应用于酶纯化领域。
然而，亲和层析法也存在一些限制。
例如，某些配体可能与其他组分结合形成非特异性复合物，导致纯化效果下降。
此外，亲和柱的制备成本较高，也制约了亲和层析法的广泛应用。
亲和层析分离纯化技术
亲和层析分离纯化技术亲和层析分离纯化技术，这可是个厉害的玩意儿呢！咱就这么说吧，它就像是一位超级厉害的伯乐，能从一堆“千里马”中精准地挑出那匹最特别的。
你看啊，在这个复杂的生物世界里，各种物质混合在一起，就好像是一场混乱的派对。
而亲和层析呢，就像是派对上那个最有眼光的人，能一下子找到它要找的目标。
它的原理其实也不难理解。
就好比你有一个特别喜欢的东西，比如一个特定的玩具，然后你就会对这个玩具特别敏感，能一下子在一堆玩具中找到它。
亲和层析就是利用这种类似的原理，通过一个特定的“结合位点”，去和目标物质紧密结合。
比如说，咱要纯化一种蛋白质。
那亲和层析就会用一个专门针对这种蛋白质的“诱饵”，把它给吸引过来，然后牢牢地抓住它，其他的杂质就被排除在外啦。
这多厉害呀！这技术在生物领域的作用那可太大了。
就好像是一个神奇的魔法棒，能让科学家们在研究和应用中如鱼得水。
想想看，如果没有亲和层析，要从那么多复杂的混合物中分离出我们想要的东西，那得费多大的劲啊！简直就像是在大海里捞针。
但有了它，就像是有了一双神奇的眼睛，一下子就能找到那根针。
而且啊，亲和层析还特别精准。
它不会随便乱抓一气，而是只针对它设定好的目标。
这就好比一个神枪手，一枪一个准，绝不会打偏。
它的应用那也是相当广泛呢！在制药行业，能帮助分离出有效的药物成分；在生物技术领域，能助力研究各种生物分子的特性。
这不就是在为我们的科技进步添砖加瓦嘛！再想想，要是没有亲和层析，我们怎么能得到那么纯净的生物制品呢？那我们的医学研究、药物开发不都得受到很大的影响嘛！所以说呀，亲和层析分离纯化技术真的是太重要啦！它就像是一位默默无闻的英雄，在背后为我们的科技发展贡献着自己的力量。
我们真应该好好感谢它，不是吗？你说，这么厉害的技术，我们能不好好研究它、利用它吗？它可真是生物领域的一大宝贝呀！。
质粒DNA纯化及内毒素去除策略研究进展
质粒DNA纯化及内毒素去除策略研究进展李卫玲;易初丽【摘要】质粒DNA(plasmid DNA)是最常用的基因工程和基因疫苗载体,近年来在生物医学和环境科学等领域得到了广泛应用.质粒DNA纯化是分子生物学研究中常用的实验技术,纳米磁性粒子等固相载体技术和色谱技术优化了DNA纯化方法.对大肠杆菌质粒DNA常用纯化方法、内毒素去除策略以及自动化纯化设备进行综述,为质粒DNA的应用研究提供支持.【期刊名称】《江汉大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2018(046)001【总页数】5页(P62-66)【关键词】质粒DNA;内毒素;核酸自动纯化仪【作者】李卫玲;易初丽【作者单位】江汉大学武汉生物医学研究院,湖北武汉 430056;江汉大学武汉生物医学研究院,湖北武汉 430056【正文语种】中文【中图分类】Q782质粒是染色体外能够自我复制的双链闭合环状DNA分子，以超螺旋状态存在，几乎完全裸露，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。
质粒具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。
质粒DNA广泛应用于基因工程、生物医学的研究以及生物产品的开发和应用。
质粒DNA纯化是其应用的关键步骤，直接影响到转化、测序、PCR、酶切和转染等下游实验。
一般质粒DNA约为2～20 kb，初步纯化的质粒DNA构型分为超螺旋、开口环状及线性3种，其中超螺旋结构的质粒DNA转化和表达效率最高。
质粒DNA安全性好、毒性低和免疫原性较低、便于分离和提取，在DNA重组技术、转基因方面有广泛应用。
1 质粒DNA常用纯化方法质粒DNA分离纯化的方法大致可分为两类：一是传统萃取抽提的液相法，如煮沸法、苯酚氯仿法、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法等；二是固体介质法，如硅胶膜法、阴离子交换膜法及磁珠法等。
后者操作步骤简便，提取纯度较好。
1.1 硅胶为基础的提取方法硅胶可以吸附核酸，DNA分子与硅胶表面的相互作用主要包括静电作用、疏水作用、氢键作用等［1］。
基因工程抗体蛋白纯化的原理
基因工程抗体蛋白纯化的原理说起基因工程抗体蛋白纯化的原理，我有一些心得想分享。
我还记得我刚开始接触这个领域的时候，整个人都是懵的，就像进入了一个迷宫找不到出口。
基因工程抗体蛋白纯化这个概念听起来就很复杂，但是后来我发现，咱们可以通过生活中的一些现象来理解它。
比如说，咱们家里淘米，目的是把米留下来，把一些杂质去掉。
其实基因工程抗体蛋白纯化有点类似这个过程，就是要从一堆混合的物质里面把我们需要的基因工程抗体蛋白单独提取出来，让它达到一个比较纯净的状态。
这里面涉及到很多不同的纯化原理和技术。
首先呢，有一个叫亲和层析的技术，这个技术就像是找对象一样，是根据特定的识别和特异性结合。
基因工程抗体蛋白和它对应的配体具有很强的亲和力。
打个比方，如果把抗体蛋白比作一把锁，那它的配体就像唯一能开这把锁的钥匙。
它们之间的这种特异性结合能够把抗体蛋白从混合物中抓取出来，和其他物质分离。
就像在一群人里，只有特定的两个人才有那种默契的吸引力，直接牵手站在一边了。
还有离子交换层析，这就有点像整理有正负极的小物件。
有的蛋白质带正电，有的带负电。
离子交换层析介质就像是一块特制的板子，它根据电荷不同来吸引或者排斥不同的抗体蛋白，从而达到分离纯化的目的。
例如，带正电的离子交换介质就像一个喜欢收集带负电的小珠子的磁铁，如果抗体蛋白带负电，就会被吸附到这个“磁铁”上，而那些不带负电或者电荷分布不符合的就会留在原地或者被洗脱冲走。
实际应用案例有很多，例如在制药领域。
在生产单克隆抗体药物时，准确的纯化是非常关键的。
如果纯化不达标，药物里面可能会混有杂质，比如说一些没有正确折叠的蛋白质或者其他杂质，这就像在一碗好米饭里混进了沙子，用到病人身上就会产生不良反应，或者让药物效果大打折扣。
说到这里，你可能会问，是不是只要用一种纯化技术就可以完美解决问题呢？老实说，我一开始也这么认为，但是实际情况并不是这么简单。
通常需要多种纯化技术联合来达到理想的效果。
用亲和层析策略解决质粒DNA纯化的难题王亮根
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金属螯合亲和层析（IMAC） 三重螺旋亲和层析（ THAC ） 蛋白质DNA亲和层析 氨基酸的DNA亲和层析
金属螯合亲和层析（IMAC）
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三重螺旋亲和层析（ THAC ）
• 是基于该序列特异性相互作用的三螺旋形成 寡核苷酸的质粒DNA • Wils等人研究的质粒pXL2563纯化的特殊情况， (GAA)17能和 (CTT)7在酸性条件下结合→用THAC纯化scpDNA的可能
蛋白质DNA亲和层析
关于亲和层析的论文
关于亲和层析的论文简介：亲和层析（Affinity Chromatography）是利用生物分子间专一的亲和力而进行分离的一种层析技术。
人们很早就认识到蛋白质、酶等生物大分子物质能和某些相对应的分子专一而可逆的结合，可以用于对生物分子的分离纯化。
但由于技术上的限制，主要是没有合适的固定配体的方法，所以在实验中没有广泛的应用。
直到60年代末，溴化氰活化多糖凝胶并偶联蛋白质技术的出现，解决了配体固定化的问题，使得亲和层析技术得到了快速的发展。
亲和层析是分离纯化蛋白质、酶等生物大分子最为特异而有效的层析技术，分离过程简单、快速，具有很高的分辨率，在生物分离中有广泛的应用。
同时它也可以用于某些生物大分子结构和功能的研究。
亲和层析是利用生物分子所具有的特异的生物学性质－亲和力来进行分离纯化的。
由于亲和力具有高度的专一性，使得亲和层析的分辨率很高，是分离生物大分子的一种理想的层析方法。
基本原理：生物分子间存在很多特异性的相互作用，如我们熟悉的抗原－抗体、酶－底物或抑制剂、激素－受体等等，它们之间都能够专一而可逆的结合，这种结合力就称为亲和力。
亲和层析的分离原理简单的说就是通过将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。
被固定在基质上的分子称为配体，配体和基质是共价结合的，构成亲和层析的固定相，称为亲和吸附剂。
亲和层析时首先选择与待分离的生物大分子有亲和力物质作为配体，例如分离酶可以选择其底物类似物或竞争性抑制剂为配体，分离抗体可以选择抗原作为配体等等。
并将配体共价结合在适当的不溶性基质上。
将制备的亲和吸附剂装柱平衡，当样品溶液通过亲和层析柱的时候，待分离的生物分子就与配体发生特异性的结合，从而留在固定相上；而其它杂质不能与配体结合，仍在流动相中，并随洗脱液流出，这样层析柱中就只有待分离的生物分子。
通过适当的洗脱液将其从配体上洗脱下，就得到了纯化的待分离物质。
自制肝素亲和柱分离纯化载脂蛋白H及其抗体制备与鉴定_王相栋
¹本文为国家自然科学基金资助项目(No.30471649)、江苏省/六大人才高峰0基金(No.20050203)作者简介:王相栋(1980年-),男,硕士研究生,技师,主要从事脂蛋白与动脉粥样硬化发病机制关系的研究,E -mail:southern -lake@;通讯作者及指导教师:张春妮(1963年-),女,博士,主任技师,硕士生导师,主要从事脂蛋白与动脉粥样硬化发病机制关系的研究,E -mail:zchunni27@ 。
#免疫学技术与方法#自制肝素亲和柱分离纯化载脂蛋白H 及其抗体制备与鉴定¹王相栋 张春妮 汪俊军 田 迎(南京大学医学院临床学院南京军区南京总医院检验科,南京210002)中国图书分类号 R392-33 文献标识码 A 文章编号 1000-484X (2008)10-0931-05[摘 要] 目的:自制肝素-琼脂糖6B 亲和柱提纯人血清载脂蛋白H (apoH),免疫制备多克隆抗体,为大量制备与进一步研究做准备。
方法:利用间接还原胺化法制备亲和层析柱,并优化反应条件。
运用高氯酸沉淀、离子交换及亲和层析从人血清中纯化抗原,制备兔源多克隆抗体。
结果:自制亲和柱肝素结合量约5mg/g (介质体积)。
纯化的抗原经SDS -PAGE 鉴定分子量约50kD,无杂带;16种氨基酸组成分析结果与报道一致。
多克隆抗体与购置的国外抗体一样,在进行E LISA 与do-t E LISA 时与小牛血清白蛋白有交叉反应;但在变性且还原的条件下,Western blot 结果显示无交叉反应。
结论:自制亲和柱成本低、亲和性好、肝素结合稳定,用之分离纯化得到了高纯度apoH;兔多克隆抗体用于检测血清中载脂蛋白H 含量时需进一步纯化。
[关键词] 亲和层析;肝素;载脂蛋白H;抗体;纯化与鉴定Isolation and purification of apolipoprotein H with heparin affinity column and preparation and identification of ant-i ApoHWANG Xiang -Dong,Z HANG Chun -Ni,WANG Jun -Jun,TIAN Ying.Department o f Clinic Laboratory ,Jinling Hos pital,Clinical School o f Medicine,Nanjing University ,Nanjing 210002,China[Abstract] Objective:To puri fy apolipoprotein H (apoH)from fresh human serum with heparin affinity column sel-f p repared and to prepare polyclonal antibody ant-i ApoH.Methods:Affinity colu mn was made by reaction of indirect reductive amination and operating conditions were op timized and thei r effects were investigated.T he apolipoprotein H antigen was purified from human serum by methods of perchloric acid precipitati on,ion ex change and affini ty chromatography.The polyclonal an tiseru m against the antigen was obtained by immuning rabbi ts.Re -sults:The amount of heparin i mmobilized on the synthesized gel was 5mg/ml (medium).Molecular weight of the purified anti gen was about 50kD by SDS -PAGE and no other bands were seen,the percentages of 16amino acids were consis ten t with that reported previously.In ELISA and do-t ELISA,the polyclonal antibody displayed a cross reaction with bovine seru m albumi n,while no such reaction was observed in result of West -ern blot under reduced and denatured condition.C onclusion:The sel-f prepared affinity colu mn costs very low,but has excellen t affini ty perfor -mance and stable heparin linking,and high purified apoH can be obtained by using the reagent.Polyclonal antibody needs to be further purified before detectin g serum apolipoprotei n H.[Key w ords] Affini ty chromatography;Heparin;Apolipoprotein H;Antibody;Purification and identi fication载脂蛋白H (apolipoprotein H,apo H )又称B 2-糖蛋白Ñ(B 2-glycoprotein I,B 2-GP I),是一种由肝脏合成的血浆糖蛋白,分子量50kD,由326个氨基酸残基组成。
dna亲和层析
dna亲和层析DNA亲和层析是一种分离和纯化特定DNA序列的技术。
它基于DNA结构的物理和化学特性，利用无机和有机化学反应的基础进行操作。
DNA亲和层析的基本原理是通过DNA双链结构的独特性质，将含有亲和指定的蛋白或化合物与其他DNA序列分离。
下面我们将更具体的了解DNA亲和层析的步骤。
1、预处理样品样品处理是DNA亲和层析的首要环节，对于纯化产品的收获直接反映样品质量。
样品应该充分摇匀后，使用必要的杀菌剂对样品进行消毒处理，如不含重金属，并保持营养成分的不变性。
另外，这是使用前操作纯化树脂的关键步骤，以去除不纯物质和局部污染，保持树脂材料的完整性和生物特征。
2、DNA连接DNA连接的目的是连接特定的连接部位，以便亲和柱树脂上的DNA结合。
DNA连接通常是通过将亲和融合蛋白注入，将融合蛋白与适当的表达质粒截取，并在水中孵育24小时用于纯化目的。
3、树脂滴定树脂滴定的目的是在样品通过过滤小孔树脂技术时产生的混合物中固定目标DNA。
购买树脂时需要注意其特定用途和亲和指数。
在使用前应通过相关材料得知树脂规格和性质，在标准化材料上进行初步实验后进行实验。
4、色谱洗脱和纯化色谱洗脱和纯化是通过DNA亲和树脂池中的柱子，将目标物分离出来的最后一步。
此步骤是通过以逆向溶液作为洗脱液，分别分离特定DNA 分析、基因进行分级分体分析。
在此步骤中，最重要的是确保一个合适的洗脱液种类和浓度的选择，这定义了分离效率的高或低。
DNA亲和层析利用DNA双链结构独特的物理、化学特性，采用有机和无机化学反应进行操作。
预处理样品、DNA连接、树脂滴定、色谱洗脱和纯化是DNA亲和层析的主要步骤。
正确的DNA亲和层析操作将在分离达到优良效果和富集纯度较高的目标DNA时反映出来，具有良好的应用前景。
亲和层析技术在现代蛋白质研究中的应用及新发展
亲和层析技术在现代蛋白质研究中的应用及新发展
李洪利;黄倢;周丽
【期刊名称】《海洋湖沼通报》
【年(卷),期】2005()3
【摘要】亲和层析技术是目前重要的蛋白质研究技术之一。
本文介绍了免疫亲和层析、凝集素亲和层析、核酸亲和层析、金属螯合亲和层析以及染料配体亲和层析等几类常规亲和层析的原理及在蛋白质分离纯化以及分析鉴定方面的应用;简要叙述了当今蛋白质组研究中新出现的两种与亲和层析有关的技术,串联亲和层析技术和SELDI芯片技术。
并且提出了存在的问题以及今后发展趋势。
【总页数】9页(P86-94)
【关键词】亲和层析;蛋白质;纯化;鉴定
【作者】李洪利;黄倢;周丽
【作者单位】中国海洋大学;中国水产科学研究院黄海水产研究所
【正文语种】中文
【中图分类】Q51
【相关文献】
1.亲和层析技术在生物科学中的应用及发展 [J], 李杨;韩梅
2.亲和层析技术在生物科学中的应用与发展探讨 [J], 李停;
3.亲和分离在蛋白质泛素化修饰研究中的应用进展 [J], 钟卉菲;黄嫣嫣;金钰龙;赵睿
4.亲和层析技术在生物科学中的应用与发展 [J], 赵艺玮
5.亲和分离技术在蛋白质糖基化修饰研究中的应用进展 [J], 顾晨露;王启晓;田胜;李秀;童珊珊
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金属螯合亲和层析（IMAC） 三重螺旋亲和层析（ THAC ） 蛋白质DNA亲和层析 氨基酸的DNA亲和层析
金属螯合亲和层析（IMAC）
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三重螺旋亲和层析（ THAC ）
• 是基于该序列特异性相互作用的三螺旋形成 寡核苷酸的质粒DNA • Wils等人研究的质粒pXL2563纯化的特殊情况， (GAA)17能和 (CTT)7在酸性条件下结合→用THAC纯化scpDNA的可能
蛋白质DNA亲和层析
• 第一个例子：蛋白质-DNA色谱法的应用， 使用双功能蛋白的亲和力连接组成的一个锌指DNA结合蛋白（融 合谷胱甘肽S -转移酶(GST-ZF) ）将孤立的质粒DNA直接从原油裂 解物。 ZF 结构域结合5’-GGGGCGGCT-3’，GST 结构域结合到带有谷胱甘 肽的Sepharose 亲和基 • 另一策略： pDNA连接的Lac 操纵子序列和抑制子Lac I 蛋白相互 作用
４种方法的比较
结论与展望
• 以符合严格的质量保证需要治疗质粒DNA生产，更有选择性的， 可靠的和高效率的纯化过程，需要将允许获取质粒产品提供必要 的纯度。 • 质粒DNA从宿主细胞提取分离很复杂，杂质与质粒DNA结构 和化 学性质相似→质粒DNA的选择性纯化遭遇困难。 • 强调质粒DNA纯化的亲和层析法的潜力。 • THAC及蛋白质-DNA亲和层析法利用高度特异性相互作用来纯化 质粒DNA，高效地从dDNA分离sDNA。↘不足以从pDNA中分离 gDNA或分离 不同的pDNA同形物。 • 在我们看来，的亲和层析法前景更好← 它结合与单一简单的小分 子自然发生的生物相互作用的选择性。 ↘支持的质粒DNA容量低 是仍待解决的问题，以及由于质粒DNA样本分子量大使其扩为配体可分离sc pDNA • His亲和方法获得的pDNA纯度高：gDNA和内毒素污染在可接受的 水平上，并没有检测蛋白质&RNA ；转染实验中使用此法纯化的 pDNA还证实，它可以有效地驱动基因在真核细胞中表达；pDNA 结合能力是合理的和可比的。 • 主要缺点：产量低和高盐浓度需要洗脱 • Arg作为配体可能更好←Arg-base相互作用在多数pro-DNA结构为 最普遍
用亲和层析策略解决质粒DNA纯化的难题
生物系第二组 王亮根（10808051）
前言
pDNA结构
pDNA主要以cccDNA形式存在
pDNA 色谱法
pDNA的亲和层析
• 亲和层析是一种吸附层析，抗原（或抗体）和相应的抗体（或抗 原）发生特异性结合，而这种结合在一定的条件下又是可逆的。 所以将抗原（或抗体）固相化后，就可以使存在液相中的相应抗 体（或抗原）选择性地结合在固相载体上，借以与液相中的其他 生物大分子分开，达到分离提纯的目的。