基因在大肠杆菌、酵母中的高效的表达技巧

第四章基因在大肠杆菌、酵母中的高效的表达

前言

基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。

基因工程主要目标之一是生产常规方法难以生产的大量蛋白质产物—即实现基因的高效表达。

基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得原生物活性又可高产的表达产物。

第一节基因的表达系统与表达策略

一、最佳的基因表达体系：

⑴目的基因的表达产量高;

⑵表达产物稳定;

⑶生物活性高;

⑷表达产物容易分离纯化。

二、宿主细胞的选择

（一）适合目的基因表达的宿主细胞的要求:

1、容易获得较高浓度的细胞；

2、能利用易得廉价原料；

3、不致病、不产生内毒素；

4、发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态；

5、容易进行代谢调控；

6、容易进行DNA重组技术操作；

7、产物的产量、产率高，

8、产物容易提取纯化。

（二）宿主细胞分为两大类：

1、原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等；

2、真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。

大肠杆菌目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表达体系。

优越性：

①对大肠杆菌的基础生物学、分子遗传学等背景知识和基因表达的调控机理已有了深刻了解。

②有各类菌株和载体系列。

③目前以实现多种基因的高效表达。表达基因产物形式多样:细胞内不溶性表达(包含体)、细胞内可溶性表达、细胞周质表达等。

④易培养，成本低。

缺点：

①大肠杆菌中的表达不存在信号肽，产品多为胞内产物，提取困难。

②因分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体，表达产物需经变性复性才恢复活性。

③蛋白质不能糖基化。产物蛋白质N端多余一个蛋氨酸残基。

④其内毒素很难除去。

酵母酵母菌是研究基因表达最有效的单细胞真核微生物。其基因组小，世代时间短，有单倍体双倍体两种形式，繁殖迅速，无毒性。能外分泌，产物可糖基化。已有不少真核基因成功表达。

三、根据表达蛋白用途选择基因的表达策略

1.生物化学和分子生物学研究

2.表达蛋白质用作抗原

3.结构研究

真核基因表达的特点

●一条成熟的mRNA只能翻译成一条多肽，不存在象原核生物那样的多基因操纵子模

式；

●基因转录调节区很大，而且往往远离启动子达几百个甚至上千个碱基，它们并不直

接影响RNA聚合酶与启动子区的结合，而是通过改变基因5’上游区DNA的构型来影响RNA聚合酶与启动子区的结合；

●mRNA合成后穿过核膜进入细胞质中后才进行翻译工作，而且通常都有复杂的成熟

和剪接过程；

●基因的启动子区和原核基因差异很大，而且有增强子序列存在。

原核体系中表达真核基因的困难

1.细菌的RNA聚合酶不识别真核基因的启动子；

2.真核基因转录的mRNA在原核细胞中不能结合到核糖体上；

3.真核基因一般含有内含子，而原核细胞没有象真核细胞那样的转录后加工系统，所

以mRNA中的内含子部分不能被切除，不能形成成熟的RNA，也就不能表达出有功能的真核蛋白；

4.表达的真核蛋白在原核细胞中很不稳定，容易被细菌蛋白酶降解破坏。

四、构建表达载体的策略

⑴将真核基因克隆到一个强大的原核启动子和SD序列的下游，使得真核基因处于原核调控体系中。

⑵采用真核基因的cDNA序列作为构建表达载体的目的基因，这样就解决了原核细胞没有RNA剪接功能的问题。

⑶构建载体时，将真核基因插在几个原核密码子的后面，翻译后就得到了原核多肽和真核多肽的融合蛋白，这样就可以避免被原核蛋白酶的识别和降解，最后可以将融合多肽切除。

第二节基因在大肠杆菌中的高效表达

一、大肠杆菌表达载体的成份

⑴启动子

要求是：①强启动子②是诱导性的，如热诱导和化学诱导。

⑵转录终止子

使转录终止，增强mRNA的稳定性，提高蛋白质产物的表达水平。

尤其是将两个终止子串联，转录终止功能更强。

⑶核糖体结合位点

在转录起始位点下游的一段DNA序列（SD，5’AGGAGG3’）

(4)筛选标记基因

(5)密码子的选择

二、常见的大肠杆菌表达系统

①T7表达系统T7噬菌RNA聚合酶能选择性的激活T7噬菌体启动子的转录，其mRNA合成速率相当于大肠杆菌RNA聚合酶的5倍。

②Lac表达系统是β-半乳糖苷酶编码基因LacZ的转录的调控序列，该启动子可以被IPTG 诱导，所以在培养基中加入该安慰诱导物就可以诱导目的基因的表达。

③Tac表达系统是一种由Lac和Trp启动子杂合而成的启动子，其强度得到了很大的提高，也可被IPTG诱导表达。

④λPL表达系统是负责λDNA分子转录的启动子之一，是一种极强的启动子。

三、影响克隆基因表达效率的因素

一般而言，所用启动子的强度、DNA的转录起始序列、密码子的选择、mRNA的二级结构、转录的终止、基因的拷贝数等都会在一定程度上影响到转基因的表达。

1.启动子的结构对表达效率的影响

大多数大肠杆菌启动子都含有两种保守区,即-10区(位于转录其始位点上游5-10bp，故称为-10区，序列为5’--TATAAT)和-35区(位于转录起始位点上游25bp处，一般有10bp组成，5’-- TTGACA故称为-35区，)。当然，实际的启动子中很少具备与上述序列完全一致的区域，但是研究表明，启动子的这两个区域与上述保守序列的相似程度越高，该启动子的表达能力也就越强。另外，这两个保守区间的距离也是影响启动子强度的重要因素，即这个间距越是接近于17bp，启动子的活性就越强。

2.翻译起始序列对表达效率的影响

mRNA的有效翻译依赖于核糖体和其的稳定结合，大肠杆菌的mRNA序列中，核糖体的结合位点是起始密码子AUG和其上游的SD序列。所谓SD序列就是由Shine-Dalgarno 首先提出的一种位于位于起始密码子上游的一段保守序列，为细菌核糖体有效结合和翻译起始所必需。一般SD序列的长度约为3-9bp，位于起始密码子上游3-11碱基的位置，它与16S 核糖体RNA的3‘端互补，控制了翻译的起始。

3.启动子与克隆基因间的距离对基因表达的影响

研究表明启动子和目的基因间的距离对基因的表达效率影响很大，所以在构建新的表达载体时要考虑到这一因素的影响。另外，在克隆基因的末端要就近插入有效的终止子序列，否则会导致细胞能量的大量消耗，或是形成不应有的二级结构，最终影响的目的基因的表达效率。