免疫共沉淀详细顺序
免疫共沉淀实验原理及详细步骤
免疫共沉淀实验原理及详细步骤免疫沉淀（immunoprecipitation，简称IP）是一种广泛应用于生物学和生物化学研究中的实验方法，用于检测和分离复合物中的特定蛋白质。
它结合了特异性抗体与蛋白质-抗体相互作用的原理，利用抗体选择性地沉淀出目标蛋白质，并与其相关的复合物。
本文将详细介绍免疫共沉淀实验的原理及步骤。
免疫共沉淀实验利用抗体与目标蛋白质相互结合的特异性，通过该特异性结合，将目标蛋白质及其相关的复合物选择性地沉淀出来。
该实验主要包括以下几个步骤：1.抗体与抗原的结合：在实验中，需要选择特异性的抗体与目标蛋白质结合。
2.抗体与蛋白质-抗体复合物的沉淀：将抗体结合的蛋白质与复合物从样本中沉淀。
3.洗涤：洗涤沉淀的复合物，去除非特异性结合的蛋白质和杂质。
4.释放目标蛋白质：将目标蛋白质从抗体中释放出来，以进行后续的下游分析。
1.细胞预处理：在进行免疫共沉淀实验之前，需要将细胞或组织进行必要的处理，例如刺激剂的刺激或疾病模型的建立。
可以选择不同条件下的实验处理组和对照组进行对比。
同时，还需要对实验样本进行适当的裂解，以确保目标蛋白质的充分释放。
2.抗体选择：选择特异性的抗体与目标蛋白质结合。
抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，也可以是特异性抗体。
此外，需要选择适当的免疫沉淀试剂盒，确保实验的准确性。
3.抗原结合：将适当的抗体与目标蛋白质结合，形成抗原-抗体复合物。
这一步骤可以在实验前进行或将其加入样本中进行。
为确保抗原-抗体结合的充分性，可以进行一定的反应时间和反应温度。
4.免疫沉淀：将抗原-抗体复合物选择性地沉淀出来。
可以采用多种方法进行免疫沉淀，例如蛋白A/G琼脂糖，特效筛选柱等。
通过离心或过滤等方式从沉淀中收集复合物。
5.洗涤：洗涤步骤用于去除非特异性结合的蛋白质和杂质。
洗涤液的组成可以根据实验需要进行调整。
洗涤步骤需要进行多次，确保洗涤得到干净的复合物。
6.释放目标蛋白质：将目标蛋白质从抗体中释放出来，以进行后续的下游分析。
免疫共沉淀(Co-IP)详细步骤教程
免疫共沉淀(Co-IP)详细步骤教程一、原理：免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。
是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。
其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。
如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。
目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。
这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。
其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。
缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。
二、准备工作：预冷PBS，RIPA Buffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS；2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶，0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4℃，缓慢晃动15min（EP管插冰上，置水平摇床上）4. 4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中5. 准备Protein A agarose，用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠6. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10min（EP 管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景7. 4℃，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A 珠子8. (Bradford 法)做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月）9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如10 μg/μl）10. 加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育12. 加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2 μl"过渡抗体"（兔抗鼠IgG，兔抗鸡IgG）13. 14000rpm瞬时离心5s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的RIPA buffer洗3遍，800μl/遍，RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以使用PBS14. 用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定（60 μl足够上三道）15. 将上样样品煮5min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5min 变性。
免疫共沉淀Co-IP实验步骤
免疫共沉淀Co-IP实验步骤Co-IP实验步骤一、制备细胞样品1.10cm盘细胞用PBS清洗两次，加入1mL RIPA裂解液和10μL PMSF（100mM稀释至1mM）；2.充分混匀吹打后，冰上裂解4h，充分吹打吸入1.5mL EP管中，-80℃保存；3.取出样品，1200rpm离心10min，取上清弃沉淀，测定蛋白浓度。
二、Co-IP，拉出蛋白1.每管取出少量蛋白样（15~30μL）作为input；2.将磁珠充分混匀后，取出50μL于1.5mL EP管中，置于磁力架上，弃上清。
（有几个样品就准备几管）；3.加入200μL Ab binding&washing Buffer（可用PBST代替），加入对应抗体，加入后轻弹混匀，360°混合仪上旋转30min；4.500rpm离心使管壁液体下来，弃上清，200μL PBS清洗（旋转5min）；5.加入1000μg 蛋白样品于EP管中，轻弹混匀，旋转1h，弃上清；6.加入200μL was hing buffer（或PBST）清洗3次；7.加入100μL washing buffer 悬浮磁珠并将溶液转移至新的EP 管中；8.弃上清，加入6μL 5×loading buffer，24μL Elution buffer （或ddw，洗脱液）；9.100℃煮10min，吸取上清；10.进行WB或SDS-PAGE。
注意事项：1.标记：样品名+抗体名；2.抗体上必须标有“IP”字样，有推荐用量；3.Co-IP中pull down 抗体与WB抗体的来源（M,R）必须不同；4.PBST=PBS + 0.02% 吐温。
免疫共沉淀原理及步骤
免疫共沉淀原理及步骤
第一步：制备抗体或抗原
第二步：交叉链接抗体或抗原
为了增强免疫共沉淀的稳定性，可以通过交叉链接抗体或抗原来使其形成更稳定的复合物。
交叉链接可以通过化学交联剂（如戊二醛）或交叉链接抗体分子的抗体-抗体结合位点实现。
交叉链接后的抗体或抗原会形成二聚体或多聚体结构。
第三步：取样和预处理
目标蛋白所在的细胞、组织或培养上清需要经过取样和预处理来获得纯净的样本。
这通常包括细胞裂解、蛋白质提取、离心、过滤等步骤。
预处理的目的是去除可能干扰检测结果的其他蛋白质或物质。
第四步：抗体结合和免疫沉淀
将抗体加入预处理样本中，使其与目标蛋白结合。
可以选择直接加入抗体，也可以将抗体固定在固相材料上，如蛋白A/G琼脂糖小柱或磁珠，然后将样本与固相材料接触，使抗体与目标蛋白结合。
第五步：洗涤
为了去除非特异性结合或杂质，需要对固相材料进行洗涤。
洗涤缓冲液的选择和洗涤次数将影响免疫沉淀的特异性和纯度。
第六步：洗脱和分析
将洗涤后的固相材料加入一定体积的洗脱缓冲液，使免疫沉淀物从固相材料上被洗脱下来。
洗脱后的沉淀物可以进行进一步的分析，如Western blot、质谱分析、蛋白质定量等。
总结：免疫共沉淀是一种用于检测和分离特定蛋白质复合物的免疫学技术。
该技术基于抗体与抗原结合的特异性，通过将目标蛋白与抗体结合并经过洗涤和洗脱步骤，实现对复合物的检测和纯化。
免疫共沉淀步骤包括制备抗体或抗原、交叉链接、取样和预处理、抗体结合、洗涤、洗脱和分析等过程。
这个技术广泛应用于生物医学研究中，可用于蛋白质相互作用的研究、药物研发和疾病诊断等领域。
免疫共沉淀原理及步骤
免疫共沉淀原理及步骤
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）原理：是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。
是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）步骤：
✧配制100 ml 的modified RIPA buffe：
✧称取790 mg 的Tris-Base，加到75 ml 去离子水中，加入900
mg 的NaCl，搅拌，直到全部溶解，用HCl 调节PH 值到7.4；
✧加10 ml 10% 的NP-40；
✧加2.5 ml 10% 的去氧胆酸钠，搅拌，直到溶液澄清；
✧加1 ml 100 mM 的EDTA，用量筒定容到100 ml，2～8 ℃保
存；
✧理论上，蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入（抑
蛋白酶肽，亮抑酶肽, 胃蛋白酶抑制剂各100 μl；PMSF，Na3VO4，NaF 各500 μl），但是PMSF 在水溶液中很不稳定，
30 分钟就会降解一半，所以PMSF 应该在使用前现加，其他抑
制剂成分可以在水溶液中稳定 5 天。
染色体免疫共沉淀(chip)步骤
染色体免疫共沉淀(chip)步骤
染色体免疫共沉淀（ChIP）是一种常用的实验技术，用于研究染色体上特定蛋白质与DNA的相互作用。
以下是染色体免疫共沉淀的基本步骤：
1. 交联：将细胞或组织与形成蛋白质-DNA复合物的交联剂（如甲醛）处理，使蛋白质与DNA之间形成致密的交联。
这一步骤有助于保持蛋白质与DNA的相互作用并固定其在细胞或组织中的位置。
2. 细胞破碎和核裂解：将交联后的细胞或组织进行破碎和核裂解，以释放细胞内的染色质。
这可以通过机械方法（如超声波处理）或化学方法（如利用细胞裂解缓冲液和蛋白酶进行破碎）完成。
3. 免疫共沉淀：在破碎的细胞或组织提取物中，加入特异性抗体，该抗体可以与目标蛋白质结合。
免疫抗体与目标蛋白质形成免疫复合物，并与形成蛋白质-DNA复合物的目标区结合。
4. 洗涤：通过一系列洗涤步骤，去除非特异性和非特定结合的蛋白质和核酸，以减少背景信号的干扰。
5. 解交联：通过加热或酶处理等方法，解除细胞或组织中的蛋白质-DNA交联，并将DNA释放出来。
6. DNA提取：通过加入DNA提取缓冲液和有机溶剂，从溶液中沉淀出DNA，并用适当的方法进行纯化和浓缩。
7. 分析：对提取的DNA进行进一步的分析，可使用PCR、测序等技术，以检测免疫共沉淀的蛋白质与目标DNA的相互作用。
这些步骤旨在允许研究人员从细胞或组织中获得特定蛋白质与DNA的结合信息，并进一步了解基因调控、表观遗传学等相关的生物学过程。
实际操作时，具体的步骤和条件可能会因实验目的和样本类型而有所不同。
因此，在进行染色体免疫共沉淀实验时，建议参考相关文献和实验室经验，以确保实验的准确性和
可重复性。
免疫共沉淀实验方法
免疫共沉淀实验方法免疫共沉淀实验方法是一种常用的蛋白质相互作用研究方法，通过利用抗体与目标蛋白之间的特异性结合来寻找与目标蛋白相互作用的蛋白质。
下面将详细介绍免疫共沉淀实验方法的步骤和注意事项。
步骤一：制备样品首先需要制备含有目标蛋白的样品，可以是细胞提取物、组织提取物或纯化的蛋白。
样品需要在低温下保存，并在实验前加入适量的蛋白酶抑制剂和磷酸酯酶抑制剂以保持蛋白的完整性。
步骤二：制备抗体制备抗体需要选择与目标蛋白特异性结合的抗体，可以是单克隆抗体或多克隆抗体。
抗体需要在低温下保存，并在实验前进行免疫球蛋白纯化和浓度调整。
步骤三：免疫共沉淀实验1. 将制备好的样品加入到含有抗体的蛋白A/G琼脂糖中，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置2小时或过夜。
2. 将混合物加入到预先平衡好的蛋白A/G琼脂糖中，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置2小时或过夜。
3. 将琼脂糖用离心管离心，去除上清液，加入洗涤缓冲液，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置10分钟。
4. 重复步骤3，洗涤3次。
5. 加入洗涤缓冲液，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置10分钟。
6. 将琼脂糖用离心管离心，去除上清液，加入洗涤缓冲液，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置10分钟。
7. 将琼脂糖用离心管离心，去除上清液，加入洗涤缓冲液，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置10分钟。
8. 将琼脂糖用离心管离心，去除上清液，加入洗涤缓冲液，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置10分钟。
9. 将琼脂糖用离心管离心，去除上清液，加入洗涤缓冲液，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置10分钟。
10. 将琼脂糖用离心管离心，去除上清液，加入洗涤缓冲液，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置10分钟。
11. 将琼脂糖用离心管离心，去除上清液，加入洗涤缓冲液，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置10分钟。
12. 将琼脂糖用离心管离心，去除上清液，加入洗涤缓冲液，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置10分钟。
13. 将琼脂糖用离心管离心，去除上清液，加入洗涤缓冲液，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置10分钟。
免疫共沉淀
表示，做免疫共沉淀时候，上样做 WB 前与你的蛋白样品共孵育的是 IRF3 抗体，即你上样的是 IRF3.WB，a 体孵育是一抗是 Flag。 第三、四行：与第二行一样。 第五行：说的清楚，是 WB 做全细胞裂解产物里的 Flag 蛋白。
IP 的目的是用一种抗体（比如 A 的抗体）去把裂解液里的相应的蛋白 A，沉淀下来，上样跑电泳等。紧接着的 的一抗（蛋白 B 的一抗）相连，即有无相互作用（认为如果 2 者相连就有相互作用）。
免疫共沉淀的详细步骤及方法
免疫共沉淀的详细步骤及方法1.实验准备在进行免疫共沉淀实验前，需要准备实验所需的材料和试剂。
这些材料和试剂包括：抗体，控制抗体，细胞提取液，蛋白质提取缓冲液，蛋白质裂解缓冲液，洗涤缓冲液，沉淀缓冲液，蛋白质样品等。
2.细胞提取及蛋白质提取收集待测细胞，用适当的缓冲液洗涤细胞，并用蛋白质提取缓冲液提取细胞内的蛋白质。
可利用机械或化学方法破裂细胞膜，释放细胞内的蛋白质。
3.预清洗和前处理将蛋白质提取物进行预清洗，以去除非特异性结合物和杂质蛋白质。
预清洗通常包括四次的离心洗涤步骤，使用洗涤缓冲液。
4.抗体交联将抗体与蛋白质提取物进行交联。
将目标抗体或控制抗体与预清洗后的蛋白质提取物特异性结合，并通过化学或免疫学方法交联两者。
5.免疫沉淀实验将交联后的样品经过免疫沉淀实验。
将抗体/蛋白质复合物与蛋白质A/G琼脂糖珠或其他免疫沉淀剂结合，使复合物与琼脂糖珠发生特异性结合。
6.洗涤和收集将免疫沉淀后的琼脂糖珠用洗涤缓冲液进行洗涤，去除非特异性结合物质。
洗涤次数通常为3-5次，每次洗涤约10分钟。
7.热处理和蛋白质裂解将洗涤后的琼脂糖珠在蛋白质裂解缓冲液中进行热处理。
将琼脂糖珠加入含有蛋白酶抑制剂和变性剂的裂解缓冲液中，使蛋白质从琼脂糖珠上释放出来。
8. SDS-和Western Blot分析使用SDS-技术对裂解后的蛋白质进行分离，然后进行Western Blot 分析。
Western Blot分析是通过将蛋白质转移到膜上，并使用特定的抗体进行探测，来检测特定蛋白质。
9.数据分析根据Western Blot结果来分析免疫共沉淀实验结果。
可以通过探测特定蛋白质的存在与否，以及与其他蛋白质的互作情况来推断蛋白质间的相互作用或复合物的形成。
总结免疫共沉淀是一种广泛应用于研究蛋白质结构和功能的实验技术。
其详细步骤包括：细胞提取和蛋白质提取，预清洗和前处理，抗体交联，免疫沉淀实验，洗涤和收集，热处理和蛋白质裂解，SDS-和Western Blot 分析，以及数据分析。
免疫共沉淀操作步骤
免疫共沉淀操作步骤免疫共沉淀（immunoprecipitation）是一种常用的实验技术，用于检测特定蛋白与其他分子的相互作用。
本文将介绍免疫共沉淀的操作步骤，包括前期准备、取样、免疫共沉淀、洗涤、洗脱和分析结果等。
一、前期准备1. 准备所需试剂：PBS缓冲液（含0.1%的Tween-20）、蛋白质抽提缓冲液（含有适当的蛋白酶抑制剂）、抗体（单克隆或多克隆抗体）、控制组织或细胞苗、蛋白质A/G磁珠等。
2.对样品进行处理：收集样品，如细胞或组织，并用蛋白质抽提缓冲液裂解细胞膜或组织。
3. 确定抗原-抗体反应的条件：进行Western blot或其他实验，确定抗体和目标蛋白的最佳工作浓度和最佳条件。
二、取样1.将裂解的细胞或组织样品通过离心等手段去除细胞碎片和残留的细胞核。
2.将上清液收集到新的离心管中，并测定样品的总蛋白浓度，以便后续计算抗体的用量。
3.根据总蛋白浓度将样品分成相等的小样本，并放入不同的离心管中。
三、免疫共沉淀1.将试验管中的抗体与适量的蛋白质A/G磁珠混合，孵育一段时间，使抗体与磁珠形成固定复合物。
2.将磁珠与固定复合物加入到每个含有样品的离心管中，混匀并在冰上孵育一段时间。
3.离心管置于磁珠磁架上，使磁珠在离心管底部附着，将上清液小心地转移至新的离心管中，以减少非特异性结合的背景。
4.用PBS缓冲液洗涤磁珠至少3次，以去除非特异性结合的蛋白质。
5.转移沉淀到新的离心管中，并用PBS缓冲液洗涤磁珠至少3次，以去除残留的非特异性结合蛋白质。
四、洗涤1.将磁珠与背景低的洗涤缓冲液混合，孵育一段时间，混匀后在冰上孵育。
2.将磁珠与洗涤缓冲液加入到每个含有沉淀的离心管中，混匀并在冰上孵育一段时间。
3.离心管置于磁珠磁架上，使磁珠在离心管底部附着，将上清液小心地转移至新的离心管中。
4.用洗涤缓冲液洗涤磁珠至少3次，以去除非特异性结合的蛋白质。
五、洗脱1.将洗涤缓冲液去除，加入适量的脱附缓冲液，孵育一段时间，混匀并在冰上孵育。
免疫共沉淀技术
免疫共沉淀技术
免疫共沉淀技术（Immunoprecipitation，简称IP）是一种采用免疫原理分离指定蛋白质或蛋白质复合物的实验技术。
它是一种特殊性抗体与抗原结合形成免疫复合物，并使之在生物液体中形成沉淀簇，再通过一定的方法将其分离出来的技术。
免疫共沉淀技术主要应用于蛋白质组学研究，常用来分析蛋白质的相互联系、互作以及组装状况。
它具有灵敏度高、特异性强、分离效率高等优点，是全基因组项目和蛋白质研究的重要技术手段。
免疫共沉淀技术的实施，主要包括以下四个步骤：第一步：细胞破碎及抗原提取，将细胞以大量的生物溶剂混匀，可以使细胞内的抗原被完全释放出来；第二步：抗体共沉淀，将体外生产的抗体与抗原结合，形成抗原抗体共沉淀复合物；第三步：沉淀物离心分离，通过离心技术将抗原抗体共沉淀复合物从反应液中分离出来；第四步：洗涤纯化，对抗原抗体共沉淀复合物进行洗涤，消除其他物质的干扰，使其纯化。
免疫共沉淀技术的实施，需要专业的实验室设备，以及经验丰富的技术人员，才能保证实验质量。
因此，实施免疫共沉淀技术时，应当选择有资质的实验机构，以提高实验质量和效果。
免疫共沉淀步骤-磁珠
一、细胞裂解1、转染后24-48 h收获细胞，用冷的PBS（4°C）洗细胞三次，最后一次吸干PBS；2、加入适量（500μl）预冷的细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解30min；3、用预冷的细胞刮将细胞从培养瓶上刮下，将裂解液收集到1.5mlEP管中，4°C、最大转速（14000rpm）离心30 min后取上清；4、取少量（20μl）裂解液以备western blotting分析；二、准备磁珠5、将Dynabeads完全重悬；6、吸取50μl（1.5mg）Dynabeads到一个EP管中；（准备两份，一份结合抗体，一份去除非特异性蛋白）7、将EP管放在磁力架上，将Dynabeads从溶液中分离出来，吸去上清；8、再用预冷的lysis buffer 500μl洗三次，每次都用磁力架将Dynabeads分离出来，最后将EP管从磁力架上取下来；三、结合抗体9、取10μl的Antibody（Ab），加入到准备好Dynabeads的EP管中；10、4°C旋转、孵育5h；11、将EP管放在磁力架上，把Dynabeads-Ab复合物从溶液中分离出来，吸去上清；12、用冷的lysis buffer 1000μl洗三次，最后一次尽量吸尽上清，再加入25μl 的lysis buffer和0.2μl的10%叠氮化钠；四、免疫共沉淀13、在裂解好的细胞样品500μl（步骤3）中加入Dynabeads（步骤6）25μl中，4°C旋转2h（去除非特异性蛋白）；14、将EP管放在磁力架上，收集上清；15、将上清加入预处理的Dynabeads-Ab复合物中，轻轻重悬Dynabeads-Abs复合物；16、4°C旋转、孵育2h，让Ag与Dynabeads-Abs复合物结合；17、将EP管置于磁力架上，转移上清到一个新的EP管中，以备需要时进一步分析；18、用1000μl的lysis buffer洗Dynabeads-Ab-Ag复合物三次，每次清洗后在磁力架上分离，移去上清，再温柔地重悬复合物；（Avoid co-elution of proteins bound to the tube wall）四、洗脱目标蛋白19、将EP管放在磁力架上，吸去上清；20、加入20μl的2×SDS 上样缓冲液，轻轻重悬Dynabeads-Ab-Ag复合物；21、50°C加热10min；22、将EP管放在磁力架上，取上清作为样品，SDS-PAGE电泳。
免疫共沉淀(CO-IP)实验方法与操作步骤
免疫共沉淀(CO-IP)实验方法与操作步骤CO-IP是用于检测或探究蛋白与蛋白之间相互作用的实验，属于IP实验的扩展，在样品溶液中，捕获和纯化通过天然相互作用及靶标结合的其他大分子蛋白，基于抗原抗体的特异性免疫结合，以饵蛋白为诱饵蛋白，通过饵蛋白抗体捕获，磁珠吸附结合，进而将饵蛋白结合的互作蛋白捕获得到，纯化定量定性分析。
实验操作步骤：1.样本准备组织和细胞是最常见的样本类型。
组织用液氮研磨，研磨时少量多次加入液氮，研磨时用研磨杵按住组织旋转研碎，需戴护目镜或是头盔。
细胞直接消化或刮下离心，预冷1XPBS清洗1-2次，消化是影响细胞膜表面蛋白构象，尤其是层黏连蛋白和粘附蛋白改变，导致细胞贴壁不牢，进而脱落，对细胞内蛋白影响几乎没有，细胞刮下来也行，虽然存在物理机械损伤，但损伤相基本可忽略。
2.细胞裂解使用弱裂解液，不要直接用WB裂解蛋白的裂解液，做免疫共沉淀，要保留细胞内天然构建结合，强裂解液会使蛋白变性，弱性裂解液在于表面活性剂，比如NP-40、Triton X-100。
3. 磁珠清洗及抗体孵育磁珠用之前摇一摇，按照使用量吸取，不要用小枪头，用1ml大枪头，且是无菌无酶，加入适量抗体与buffer，混入磁珠即可。
4. 磁珠-抗体-裂解液孵育此为核心步骤，磁珠与抗体孵育完成后，buffer清洗3次，加裂解液。
清洗是为去除未结合至磁珠表面的游离抗体，防止游离未结合的抗体结合到饵蛋白，降低结合总量。
磁珠-抗体复合物清洗完，加裂解液孵育，注意要颠转孵育，不能静置，磁珠是固体，溶液沉降，颠转孵育，不但能使磁珠不沉降，而且使磁珠-抗体与蛋白结合更充分全面。
放置4℃，颠转过夜。
5.清洗纯化磁珠-抗体-蛋白复合物关键步骤，需清洗6次，清洗少了会导致假阳性，清洗次数过多结合蛋白损失大，清洗时要用两种buffer，一种低盐，一种高盐，尽量去除未结合的蛋白，防止假阳性出现。
6.检测检测分为三种，根据实验目的区分。
一是银染：按照input组、目的组、IgG 组、beads组跑胶银染，查看蛋白差异性；二是WB检测：根据预测结合的靶蛋白，进行WB检测，看有无条带，确认是否结合（要做内参）；三是MS（质谱）检测：质谱检测是根据产物蛋白，进行酶解消化成多肽，再测定多肽，获取序列，比对蛋白数据库，查看潜在结合蛋白有哪些，探讨结合蛋白。
免疫共沉淀实验流程及步骤
免疫共沉淀实验流程及步骤
1) 制备细胞裂解液：收集4x107细胞，用PBS洗涤后，加入1 ml RIPA buffer(含蛋白酶抑制剂)，充分混匀，冰上裂解30 min;4℃，12000 rpm离心10 min，收集上清液。
2) 免疫共沉淀：在细胞裂解液中加入50 μl 50% Protein A/G Beads，4℃翻转混合孵育1 h进行预清除，离心后取0.5 ml上清液，加入3 μg诱饵蛋白X抗体，另取0.5 ml上清液加入等量同源的IgG 抗体作为对照，4℃摇晃结合过夜;第二天每管加入50 μl 50% ProteinA/G Beads，4℃摇晃结合3 h;用RIPA Buffer洗涤5次，每次5 min。
3) Western Blot分析或MS质谱分析：沉淀中加入25 μl 2×SDS loading Buffer，煮沸10 min后离心取上清，用靶蛋白Y的抗体进行Western Blot分析，以检测目标蛋白是否存在相互作用;或进行MS质谱分析，以找到更多与诱饵蛋白X在体内存在相互作用的蛋白。
免疫共沉淀实验步骤
Co-ImmunoprecipitationPart I: prepare sample预冷PBS，Lysis Buffer，细胞刮子，离心机1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS（斜放控干）；2. 加入预冷的lysis Buffer(加PMSF,Proteinase cocktail，用量视细胞数而定)，冰上裂解10 min。
3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4℃4. MSC: 4℃，12000rpm 离心15min，取上清。
Cancer cells：超声裂解（操作见附件），4℃，12000rpm 离心15min，取上清。
5. PBS 洗两遍Protein A agarose珠子（先静置，3000rpm，1min），用PBS配制成50%浓度（减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠）。
6. Sample预处理：每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠（50%），4℃12 rpm 转盘，10min（去除非特异性杂蛋白，降低背景）。
7. 4℃静置，3000rpm，1min，取上清，去除Protein A珠子8. (Bradford 法)做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月）9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如10 μg/μl）10. 加入一定体积antibody（eg：IgG，Kindlin2）到beads中，4℃，12 rpm 转盘，2h。
11. 加入sample到beads，4℃，12 rpm 转盘，过夜。
12. 4℃静置，3000rpm，5min，弃上清，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，用预冷的PBS洗3遍，1ml/遍，最后一遍用lysis buffer.。
免疫共沉淀详细步骤
免疫共沉淀详细步骤1.准备样品：首先，准备含有目标蛋白质的细胞提取物或纯化的蛋白质样品。
样品的制备通常包括细胞培养、细胞裂解和蛋白质提取等步骤。
2.预处理样品：根据实验需要，对样品进行预处理。
例如，可以使用蛋白酶抑制剂或磷酸酶抑制剂来避免蛋白质的降解或被磷酸化。
此外，也可以通过交联反应来固定蛋白质与其相互作用的分子，以增加免疫共沉淀的稳定性。
3.选择适当的抗体：根据目标蛋白质的特异性，选择适当的单克隆或多克隆抗体。
这些抗体可以是经过商业购买的，也可以是实验室自行制备的。
4.免疫沉淀：将适当的抗体与蛋白质样品混合，形成免疫复合物。
为了增加抗原与抗体的结合效率，可以在混合物中添加增强抗体结合的缓冲剂，如牛血清白蛋白（BSA），牛血清或鱼籽酸-Na等。
将混合物孵育在4°C下，允许抗体与抗原结合。
5.加入固相支持：免疫复合物通常不稳定，为了将其固定，需要将其与固相支持材料结合。
常用的固相支持材料包括蛋白A/G琼脂糖或抗体包被的琼脂糖小珠。
将适当量的支持材料添加到混合物中，并在4°C下搅拌孵育一段时间，以允许免疫复合物与支持材料结合。
6.沉淀：将混合物通过离心使免疫复合物沉淀到底物质上，将上清液去除。
7.洗涤：用洗涤缓冲液多次清洗底物质来除去非特异性的结合物质，以提高纯度。
洗涤缓冲液的成分可以根据实验样品的特点和所用抗体的特性来调整。
8.洗涤后处理：根据实验需要，可以加入洗涤后处理剂，如酶解抑制剂、的士速根-Na、蛋白酶抑制剂等。
9.构建免疫复合物：为了从固相支持上解离免疫复合物，可以使用低pH或高盐浓度的洗涤缓冲液。
免疫复合物被解离后，可以用于进一步的分析，如免疫印迹、质谱分析等。
10. 分析：通过适当的方法对免疫复合物进行分析。
常用的分析方法包括SDS-、Western blot、质谱分析等。
免疫共沉淀方法在蛋白质相互作用研究中具有重要的应用价值。
在实验过程中，需要注意的是选择适当的抗体和固相支持材料，以及适当的控制实验条件，如反应时间和温度等。
免疫共沉淀实验原理及详细步骤
免疫共沉淀实验原理及详细步骤免疫共沉淀是一种常用的实验方法，用于确定蛋白质与其他分子（例如核酸，蛋白质和脂类等）之间的相互作用关系。
该方法利用抗体与目标蛋白结合的特异性，将其与蛋白质一起纯化或检测。
下面将详细介绍免疫共沉淀的实验原理及步骤。
实验原理：在免疫共沉淀实验中，首先需要利用对目标蛋白高度特异性的抗体经抗原抵结的方式将目标蛋白与抗体结合。
然后将这种特异性抗体抵结的蛋白（复合体）与抗体相结合的固相支架接触，利用固相支架上特异抗体识别结合复合体，并通过洗脱和沉淀步骤将目标蛋白纯化或检测。
实验步骤：1.目标蛋白和抗原抵结：首先需要纯化目标蛋白或从合适的细胞系或动物模型中提取目标蛋白。
将目标蛋白与对其高度特异性的抗体一起孵育，使抗体能够特异性地与目标蛋白结合。
2.制备固相支架：在实验管中加入含有特异抗体的磁珠或琼脂糖等固相支架。
特异抗体可以是直接专一抗体，也可以是经过交联的间接专一抗体。
3.孵育复合体与固相支架：将目标蛋白与抗原抵结后的复合物加入到含有固相支架的实验管中，并进行充分的振荡孵育，使复合物能够与固相支架上的抗体结合。
4.洗脱非特异结合物质：通过连续洗涤步骤，将非特异性结合的杂质分子从固相支架上洗脱。
一般可以使用高盐浓度或化学物质（例如尿素或磺酸盐）来打破非特异结合以保留特异性结合复合体。
5.纯化或检测目标蛋白：通过洗脱步骤，从固相支架上将目标蛋白的特异性抵结复合物分离出来。
这些分离物可以用于进一步的纯化、分析或检测。
6.质谱分析或其他分析方法：将纯化后的目标蛋白样品进行质谱分析，确定目标蛋白自身和与其相互作用的分子。
总结：免疫共沉淀实验是一种利用抗体与目标蛋白之间的相互作用来纯化或检测蛋白质的方法。
这种方法可用于确定蛋白质与其他分子之间的相互作用关系，从而揭示生物学过程中的重要调节机制。
免疫共沉淀实验步骤繁多，需要注意实验操作的细节，但也是一个非常有价值和实用的技术。
免疫共沉淀步骤
免疫共沉淀1、收集细胞样品，水平转子1000rpm离心2min，去上清，将细胞沉淀放在液氮里速冻，后置于冰上；2、每管加入200ul的IP裂解液，涡旋仪上震荡30s；3、取20ul上清加入到新的EP管中，然后加入loading buffer，95度加热5min，作为input；4、再向步骤4中的样品管里加入320ul的IP裂解液，震荡1min；5、13000rpm 4度离心10min；6、将上清转移到加入anti-FLAG beads的EP管中，4度摇晃孵育3h；7、13000rpm 4度离心10s，去上清；8、加入500ul IP buffer 洗涤5次；9、加入500ul 50mM Tris-HCl PH7.5洗涤1次，将triton除净；10、每管加入蛋白loading buffer，94度加热10min；11、13000rpm 4度离心2min；12、将样品进行western检测分析。
IP裂解液配方(50 ml)1 M HEPEs (PH7.5) 10 mM 0.5 ml5 M NaCl100 mM 1 ml0.5 M EDTA 1 mM 0.1 ml50% 甘油10% 10 ml10% Triton 1% 5 ml 1片蛋白酶抑制剂dH2O 补水至50 ml 于摇晃器上摇晃混匀，分装成2ml小管，-20度保存。
IP洗涤液配方(50 ml)试剂终浓度用量1 M HEPEs (PH7.5) 10 mM 0.5 ml5 M NaCl100 mM 1 ml0.5 M EDTA 1 mM 0.1 ml50% 甘油10% 10 ml 10% Triton 1% 5 mldH2O 补水至50 ml 于摇晃器上摇晃混匀，4度保存。
免疫共沉淀技术实验步骤
免疫共沉淀技术实验步骤免疫共沉淀实验大致流程为:收集蛋白样品—诱饵蛋白抗体沉淀诱饵蛋白—SDS-PAGE 分离蛋白—WB 检测是否存在靶蛋白。
实验步骤详解：一、细胞总裂解液的制备①转染后24h收集细胞，1400r X 3min，4°C离心，弃去上层培养基②冰上静置裂解细胞，加入预冷的非变性裂解液NETN(20mMpH8.0Tris HCl,100mMNaCl,1 mMEDTA,0.5% Nonidet P-40)吹打混匀，冰上静置10-15min。
注意NETN用时要现加蛋白酶抑制剂，通常是Leupeptin和Aprotinin这两种(终浓度为1ug/ml)③12000 x 5-10min, 4°C离心④将离心后的上清液转移至新的EP管内，每管转移的量保持一致，注意不要吸到底部沉淀，全程冰上操作二、免疫共沉淀①留取20ul左右细胞裂解的上清液加2 x loading buffer煮5min，作为input组②提前将琼脂糖凝珠(S beads)均分至新的EP管内，要使用剪去了尖头的枪头吸取beads，且保证每管里的beads量一致，小心吸去上清液，加入A蛋白的抗体和细胞裂解后的上清液。
1mg蛋白裂解液加入25ul悬浮液包括 1:1的 S beads与2ug A蛋白抗体③4°C摇床孵化2-4h(期间可以配制SDS-PAGE胶，准备下一步Western blotting)④Binding结束，1400r x 1min, 4°C离心⑤真空泵或移液枪吸去上清，注意不要吸到沉淀，加入800ul NETN，上下颠倒混匀，保证底部的沉淀悬浮起来⑥离心，重复4)5)，洗beads三次⑦最后一次弃去上清，用点样枪头将残液吸净，加15ul 2xloading buffer煮5min，作为Co-IP组点样，剩下的沉淀再次加入10ul 2 x loading buffer煮一次，作为IP组点样。
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精心整理
免疫共沉淀详细步骤
实验原理
当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互白质Y beads ）蛋1.RIPABuffer 配制：
基础成分：
Tris-HCl （缓冲液成分，防止蛋白变性）
NaCl （盐份，防止非特异蛋白聚集）
NP-40（非离子去污剂，提取蛋白；用H2O配制成10%储存液）
去氧胆酸钠（离子去污剂，提取蛋白；用H2O配制成10%储存液；避光保存）
注意：准备激酶（致活酶）实验时，不要加去氧胆酸钠，因为离子型去污剂能够使酶变性，导致活性丧失。
RIPA蛋白酶抑制剂
EDTA
RIPA
激活的
NaF（
2.
配制
1)
直到全部溶解，用HCl调节PH值到7.4
2)加10ml10%的NP-40
3)加2.5ml10%的去氧胆酸钠，搅拌，直到溶液澄清
4)加1ml100mM的EDTA，用量筒定容到100ml，2-8℃保存
5)理论上，蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入（抑蛋白酶肽，亮抑酶肽，胃蛋白酶抑制剂各100μl；PMSF，Na3VO4，NaF各500μl），但是PMSF在水溶液中很不稳定，30分钟就会降解一半，所以PMSF应该在使用前现加，其他抑制剂成分可以在水溶液中稳定5天。
各种成分在工作液中的终浓度：
预冷PBS，RIPABuffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机
1.用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS；
2.加入预冷的RIPABuffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶，
0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)；
3.用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4℃，缓慢晃动15min（EP管插冰上，置水平摇床上）；
4.4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中；
5.准备ProteinAagarose，用PBS洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠；
6.每1ml总蛋白中加入100μlProteinA琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10min（EP管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景；
7.4
倍以上，；
9.用
10.
11.42h
12.
IgG，兔抗鸡
RIPAbuffer洗3遍，800μl/遍，RIPAbuffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以使用PBS；
14.用60μl2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定（60μl足够上三道）；
15.将上样样品煮5min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5min变性。
实验流程为：
1.转染后24-48h可收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解30min，细胞裂解液于4°C，最大转速离心30min后取上清；
2.
解液，
3.取；
4.4°C
5.
SDS
1)1ml 冰冷的
2)
15min
3)收集上清（约30ml）并加入30μg的适当抗体，4℃摇动免疫沉淀物1h。
4)加入0.9ml的蛋白质A-Sepharose悬液，4℃摇动免疫沉淀物30min。
5)用含900mmol/LNaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物，再重复洗5次。
最后，用NETN洗一次。
6)吸出混合物的液体部分。
加入800μl的1×SDS胶加样缓冲液到球珠中，煮沸4min。
7)将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE梯度胶中，在10mA的恒定电流下电泳过夜。
8)通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带。
9)从胶上切下目标带，将其放到微量离心管中，用1ml50%乙腈洗两次，每次3min。
10)用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质，再将肽电洗脱。
1)确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生；
2)要确保抗体的特异性，即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀；
3)确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。