分子生物学常用技术及其应用

生物技术正在改变人们的生活和观念
随着基因组计划的接近完成及后基因组计划的 开展，借助计算机处理复杂信息的强大能力，21世 纪的生物技术将会有更大发展，有些领域甚至可能 有重大突破。
第一节 自然界的基因转移和重组
一、接合 二、转化 三、转导 四、转座
质粒DNA从一个细胞转移至另一细胞 通过自动获取或人为地供给外源 DNA，使细胞获得新的遗传表型
第十二章
分子生物学常用技术 及其应用
序言
21世纪是生命科学的世纪！
生物技术是当今发展最快、最活跃、 对社会 与经济的发展有巨大推动力的高科技领域。其 中基因工程和发酵工程是生物技术的核心。
世界各国政府高度重视生物技术
我国政府将其列为信息通讯、航天、新能源、 新材料等高科技领域的第二位。可见其战略地位。
病毒把某一细胞的DNA带至另一细胞， 使后者获得新的遗传表型
DNA片段从染色体的某处移位到另一处。
四、基因重组(recombinant) 不同DNA分子间发生的共价连接 重组的类型： 1. 位点特异性重组 (site-specific recombination) 2. 同源重组 （homologous recombination）
Alu I
5′
3′
5′ 3′
3′ 5′
*************A —OH —P G
P — CT************* OH— GA*************
*************TC 3′ 5′
限制性内切酶用途：
1.基因重组过程中切割DNA以获取目的基 因片段，切割载体形成切口，使目的 基因能插入载体中。
5′ 3′
P— A A T T C********* OH— G********* 3′ 5′
3′ *********G —OH *********C T T A A — P 3′ 5′
DNA连接酶
EcoR I
5′ **********GAATTC********** **********CTTAAG********** 3′
EcoR I
3′
3′ 3′ 5′
5′
A A T T C********* OH—G*********
作用模式图： 2. 产生3′突出粘性末端
5′ 3′ 5′
3′ 5′
3′
5′
**********CTGCAG************** **********GACGTC**************
Pst I
2.限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphysms, RFLP)分析：遗传病的诊断，法医 DNA指纹分析等。 3.构建DNA的物理图谱，基因定位，DNA的 同源性分析等等。
(二)DNA连接酶(DNA ligase) ——基因工程的缝纫针
催化两条双链DNA分子的互补粘性末 端或平末端的5′磷酸基团与3′羟基形成磷 酸酯键。
1. 同源重组（homologous recombination）
机制
A B a b
同源区
A
B a b A B a b
B
A
b
a
B
a
b
A
功能 1. 在减数分裂过程中，同源染色体之间 进行交换，形成生物个（群）体的多样性。 2. 是DNA损伤修复的重要机制之一。
2. 位点特异性的基因重组 由整合酶催化，重组仅在特定的基 因片段和位点上进行。
功能： 将两条双链DNA片段连接起来， 实现 DNA的体外重组。
DNA连接酶催化平末端连接要比粘性末 端 效率低得多。
也可将双链DNA分子内部的单个切 口(无核苷酸空缺)连接起来。还可作用 于RNA，但效率很低。
如需连接单链DNA或RNA，则需用 RNA连接酶。
DNA连接酶
作用模式图：
5′
1. 连接粘性末端
是免疫球蛋白多样性的分子机制。
第二节
基因工程的工具 ——工具酶和载体
一、 常用的工具酶
(一)限制性内切酶(restriction endonuclease) ---切——基因工程的手术刀 没有限制性内切酶的发现和应用，就 很难有今天分子生物学与基因工程的快 速发展。
识别双链DNA中特异序列，该序列的特征为 4-6个核苷酸的回文结构，并在识别序列内或附 近特异切割DNA，产生粘性末端或平末端。
功能： 根据需要在特定的位点精确切割 双链DNA分子
作用模式图： 1. 产生5′突出粘性末端(sticky end)
5′ 3′ 5′ 3′ 3′ 5′ 5′
P **********GAATTC******** **********CTTAAG********
*********G —OH *********C T T A A — P
3′
3′
5′
3′
5′
*********C T G C A —OH *********G — P
OH— A C G T C***********
P — G***********
作用模式图：
3. 产生平末端(blunt end)
5′ 3′
*************AGCT************* *************TCGA************* 5′பைடு நூலகம்3′
3′
5′
作用模式图： 2. 连接平末端
5′ 3′ ************TC —OH ************AG — P 3′ 5′ 5′ 3′ P — CT************* OH— GA************* 3′ 5′
DNA连接酶
Alu I
5′ 3′ *************AGCT************** *************TCGA**************
3′ 5′
(三) 反转录酶(Reverse Transcriptase)
1. RNA指导的DNA聚合酶活性： 功能： 以RNA为模板，以带3′-OH末端的 DNA片段为引物， 沿5′至3′方向合成 DNA链。 3′AAAAAAUCUGUCCUA……5′ 5′TTTTTTT—OH 3′ dNTP 反转录酶 Mg2+ 3′AAAAAAUCUGUCCUA……5′ 5′TTTTTTT AGACAGGAT……3′
功能： 2. DNA指导的DNA聚合酶活性；核糖核 酸酶H活性；DNA解旋酶活性等。 用途： 1. 反转录酶的最主要作用是以mRNA 为模板合成互补DNA(complementary DNA，cDNA)。 2. 以单链DNA或RNA为模板制备探针。