分子生物学常用技术及其应用
常用分子生物学技术的原理及其应用
分子生物学技术是生物学领域中的重要工具,广泛应用于基础研究、医学诊断、药物研发等领域。
以下是常用的分子生物学技术及其原理和应用:1. PCR技术:PCR(聚合酶链式反应)是一种体外扩增DNA的方法,基本原理是通过DNA聚合酶酶在体外模拟DNA的复制过程,从而快速扩增目标DNA片段。
PCR技术在基因克隆、基因检测、DNA指纹分析等领域有着广泛的应用。
2. 基因克隆技术:基因克隆是将感兴趣的DNA片段插入到载体DNA 中,构建重组DNA分子的过程。
通过基因克隆技术可以获得大量目的基因的DNA序列,用于研究基因功能、表达调控等方面。
3. 蛋白质表达与纯化技术:蛋白质表达技术是将外源基因导入宿主细胞中,使其表达目的蛋白质的过程。
通过蛋白质表达与纯化技术,可以获得大量纯净的蛋白质样品,用于研究蛋白质结构、功能等。
4. 基因编辑技术:基因编辑技术包括CRISPR-Cas9系统、TALENs和ZFNs等,可以实现对基因组特定区域的精准编辑。
基因编辑技术在疾病治疗、植物育种等领域有着巨大的潜力。
5. RNA干扰技术:RNA干扰是一种通过RNA介导的基因沉默机制,可使目标基因的mRNA水平下降,从而抑制基因表达。
RNA干扰技术在基因功能研究、疾病治疗等方面具有重要应用价值。
6. 蛋白质亲和纯化技术:蛋白质亲和纯化技术利用蛋白质与其结合物质之间的特异性相互作用,实现对目标蛋白质的选择性富集和纯化。
该技术在药物筛选、蛋白质相互作用研究等领域有着广泛应用。
7. 基因芯片技术:基因芯片是一种高通量的生物芯片技术,可同时检测上千个基因的表达水平。
基因芯片技术广泛应用于基因表达谱分析、疾病诊断、药物研发等领域。
8. 蛋白质组学技术:蛋白质组学技术主要包括蛋白质质谱分析、蛋白质组芯片等,用于研究蛋白质在生物体内的表达水平、翻译后修饰等。
蛋白质组学技术在疾病诊断、药物靶点鉴定等方面有着重要应用。
以上是常用的分子生物学技术及其原理和应用。
常用分子生物学技术的原理及其应用
常用分子生物学技术的原理及其应用概述分子生物学技术是现代生物学研究中应用广泛的一系列技术方法。
这些技术能够帮助科学家从分子水平上理解生物学系统的结构和功能,并促进相关研究的进展。
本文将介绍几种常用的分子生物学技术,并详细探讨它们的原理和应用。
1. 聚合酶链式反应(PCR)•原理:聚合酶链式反应(PCR)是一种体外合成DNA的方法,通过循环性反应使DNA的数量迅速扩增。
该技术主要包括三个步骤:变性、退火和延伸。
在变性步骤中,DNA双链被加热使其解旋成两条单链。
在退火步骤中,引物与模板DNA序列互补碱基配对。
在延伸步骤中,热稳定DNA聚合酶将新的DNA链延伸。
•应用:PCR技术在生物学研究和临床诊断中有着广泛的应用。
它可以用于基因克隆、基因突变分析、DNA测序、DNA指纹鉴定等。
此外,PCR还常用于检测病原体、肿瘤标记物以及遗传性疾病的诊断。
2. 凝胶电泳•原理:凝胶电泳是一种分离DNA和蛋白质的常见方法。
该技术基于物质在电场中的迁移速度不同,利用电势差将分子分离开来。
DNA片段在凝胶中迁移速度与其大小有关,大片段迁移较慢,小片段迁移较快。
•应用:凝胶电泳广泛应用于DNA分析、蛋白质分析以及核酸杂交等实验中。
在分子生物学研究中,凝胶电泳可用于确认PCR扩增产物的大小,并进行DNA片段的分离和纯化。
此外,它还可以检测基因突变、遗传关系等。
3. 蛋白质电泳•原理:蛋白质电泳是一种分离和分析蛋白质的技术。
该技术基于蛋白质的大小、电荷和形状差异,利用电势差将蛋白质分离开来。
在电泳过程中,蛋白质样品被加载到聚丙烯酰胺凝胶中,并通过电场迁移。
•应用:蛋白质电泳在生物学研究和临床诊断中具有重要作用。
它可以用于鉴定蛋白质在细胞中的表达水平、研究蛋白质结构和功能以及检测特定蛋白质的存在与否。
此外,蛋白质电泳还用于分离和纯化重组蛋白质。
4. 核酸杂交•原理:核酸杂交是一种通过互补碱基配对而发生的分子相互作用。
通过标记的探针DNA或RNA与靶序列相互结合形成稳定的双链或三链结构,从而可进行检测和定位。
细胞分子生物学研究中常用的技术和方法
细胞分子生物学研究中常用的技术和方法细胞分子生物学是指研究细胞内发生的生物分子互作及其调控的学科。
随着生命科学技术的不断发展和完善,许多技术和方法得以应用于细胞分子生物学的研究中。
本文将从多个方面介绍细胞分子生物学研究中常用的技术和方法。
一、基因克隆技术基因克隆技术是一种常用的细胞分子生物学研究方法。
它可以通过将感兴趣的DNA序列插入载体DNA上,构建含有特定目的基因的重组DNA,最终将重组DNA引入宿主细胞中来研究某一基因的生物学功能。
基因克隆技术的核心是重组DNA技术,其中最常用的重组DNA方法包括限制性内切酶切割、DNA连接、转化及放大等步骤。
特别是在近年来的分子克隆技术中,基因编辑技术的应用使得基因克隆技术更加得到精细化和精确化。
二、蛋白质结构分析技术蛋白质是生物体中极其重要的分子之一,其结构对蛋白质的生物学功能有着至关重要的作用。
蛋白质的功能在很大程度上取决于其三维结构,因此蛋白质结构的研究是细胞分子生物学的重要研究领域。
蛋白质结构分析技术包括X射线晶体学、核磁共振、电子显微镜等。
其中,X射线晶体学是目前分析蛋白质最为常用的方法之一,其原理是利用X射线的衍射来确认蛋白质的三维结构。
三、荧光素酶标记技术酶标记技术是研究酶在细胞中的分布和功能的重要方法,其中荧光素酶标记技术则成为近年来应用最广泛的方法之一。
荧光素酶由日本学者O. Shimomura于1962年首次发现,可以发出明亮的荧光,被广泛应用于生物学研究中。
目前,荧光素酶标记技术被用来研究蛋白质的定位和运动等生物学过程,其原理是将荧光素酶标记的免疫球蛋白等物质与荧光素底物结合,从而通过荧光显微镜来研究生物分子的动态变化。
四、蛋白质互作筛选技术蛋白质在细胞中的互作是细胞分子生物学研究的重要问题之一。
蛋白质互作筛选技术则可以用来鉴定蛋白质之间的相互作用关系。
目前常见的蛋白质互作筛选技术包括酵母双杂交法、共免疫共沉淀、荧光共聚焦显微镜等。
常用分子生物学技术的原理及应用
常用分子生物学技术的原理及应用一、PCR技术1.PCR(Polymerase Chain Reaction)技术是一种常用的分子生物学技术,主要用于扩增DNA片段。
2.PCR技术的原理是通过添加DNA模板、引物和DNA聚合酶,以及一系列特定的温度循环,迅速扩增目标DNA序列。
3.PCR技术的应用广泛,如基因克隆、基因突变分析、疾病诊断等。
二、蛋白质电泳技术1.蛋白质电泳技术是用于分离和定量蛋白质的常用方法。
2.蛋白质电泳技术包括SDS-PAGE和蛋白质西方印迹等。
3.SDS-PAGE是一种蛋白质分子量分析方法,通过凝胶电泳分离蛋白质。
4.蛋白质西方印迹则用于检测特定蛋白质的表达,并通过特异性抗体与该蛋白质结合,产生特定的信号。
三、原位杂交技术1.原位杂交技术是研究基因表达和基因组结构的重要工具。
2.原位杂交技术通过结合特异性探针和标记物,用于检测目标序列在组织或细胞中的分布。
3.原位杂交技术有多种类型,如荧光原位杂交(FISH)和非放射性原位杂交等。
4.原位杂交技术在遗传学研究、疾病诊断和生物学研究中得到广泛应用。
四、基因克隆技术1.基因克隆技术是将特定DNA片段插入到载体DNA中的技术。
2.基因克隆技术的关键步骤包括:DNA片段的切割、载体DNA的选择和连接、转化等。
3.基因克隆技术在基因工程、重组蛋白质的表达以及基因功能研究等方面具有重要应用。
五、DNA测序技术1.DNA测序技术是用于确定DNA序列的方法。
2.DNA测序技术包括Sanger测序和高通量测序等。
3.Sanger测序是一种经典的测序方法,逐个位置确定DNA序列。
4.高通量测序技术通过并行测序大量的DNA片段,实现快速高效的DNA测序,并被广泛应用于基因组学研究、药物研发等领域。
六、蛋白质质谱技术1.蛋白质质谱技术是分析蛋白质结构和功能的重要方法。
2.蛋白质质谱技术包括质谱仪的使用和蛋白质样品的制备等。
3.蛋白质质谱技术能够快速鉴定蛋白质样品中的蛋白质组分,并定量分析特定蛋白质的表达水平。
分子生物学 常用分子生物学技术的原理及应用
(三)基因突变
利用PCR技术可以随意设计引物在体外对目的 基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。
T G C
(四)DNA序列测定
将PCR技术引入DNA序列测定,使测序工 作大为简化,也提高了测序的速度;
待测DNA片段既可克隆到特定的载体后进 行序列测定,也可直接测定。
(五)基因突变分析
PCR与其他技术的结合可以大大提高基 因突变检测的敏感性 。
▪ 分子杂交: 不同来源的单链核苷酸链根据碱基互补原则形成
杂种双链的过程。
▪ 分子杂交的目的: 检测DNA和RNA
▪ 探针: 分子杂交中和待测核苷酸链碱基互补的被标记的
核苷酸链。
待测DNA或RNA
探针
碱基对间氢键
增色效应: DNA变性伴随260nm吸收值增高
减色效应: DNA复性伴随260nm吸收值降低
Taq
5’
Taq
5’
R
R
R Taq
R
Taq
R
l
R
3’
Extension Step
1. Strand Displacement
3’
5’
2. Cleavage
3’
5’ 3. Polymerization
3’
Complete
4. Detection
5’ 3’
PCR衍生技术
▪ 反向PCR ▪ 逆转录PCR ▪ 原位PCR ▪ 重组PCR ▪ 不对称PCR ▪ 多重PCR
酵母双杂交系统的建立基于对真核生物转录激 活因子结构与功能的认识
真核生物转录激活因子
DNA结合结构域 转录激活结构域
BD
AD
组件式:结构可互相分开 功能互相独立 空间较近时表现活性 中间序列对活性无影响
分子生物学常用技术(简化版)
Northern blot
类似于 Southern 印迹杂交的方法,用于 RNA 检测
in situ hybridization
原位杂交:特定 mRNA 的组织细胞分布
FISH Fluorescence in situ hybridization (FISH):特定基因的染色体定位
反 Northern 杂交与 DNA 芯片
DNA解旋解链
DNA的体内复制
ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC
5’
3’
TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’
5’
GGAUCG
5’
AUCGCG
5’
引物酶
引物酶
RNA引物
RNA引物
DNA解旋解链
引物合成
DNA的体内复制
ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC
核酸:测序、印迹、杂交、体外扩增技术 蛋白质:电泳与印迹、组学技术、相互作用
基本技术:
基因工程技术 转基因生物与基因敲除技术
综合技术:
基因诊断 基因治疗
应用技术:
第一节:核酸分子杂交
Molecular hybridization: 利用已知核酸序列 (探针/probe) 检测与其互补的未知核酸序列 用途: 确认核酸序列间同源性 对特定核酸序列进行定量 自核酸混合体中辨认特定核酸序列
1.什么是耐热 DNA 聚合酶
早期 PCR 曾使用 DNA 聚合酶 I
在高温时发生变性,每一循环都需要重新添加酶 延伸反应温度为 37℃,非特异性太多
目前常用 Taq DNA 聚合酶
纯化自嗜热水生菌 (Thermus aquaticus) 可耐受 95℃ 高温,最适反应温度为 72℃ 左右
生物化学第12章-分子生物学常用技术
第十二章分子生物学常用技术及应用【授课时间】3学时【目的要求】1.掌握基因工程与重组DNA技术相关概念,核酸分子杂交、探针、PCR、DNA 芯片技术、基因诊断和基因治疗的概念。
2.熟悉重组DNA技术、PCR的基本原理及基本反应步骤。
3.了解基因工程在医学中的应用,PCR 的主要用途。
4.了解DNA芯片技术的原理与方法,基因诊断与基因治疗的应用。
【教学内容】1.一般介绍:基因工程2.一般介绍:核酸分子杂交技术3.一般介绍:聚合酶链反应4.一般介绍:DNA芯片技术5.一般介绍:基因诊断与基因治疗【授课学时】3学时第十二章分子生物学常用技术及应用第一节基因工程第二节核酸分子杂交技术第三节聚合酶链反应第四节 DNA芯片技术第五节基因诊断与基因治疗第一节基因工程噬菌体(bacteriophage,phage)是感染细菌的一类病毒,因其寄生在细菌中并能溶解细菌细胞,所以称为噬菌体。
用于感染大肠杆菌的λ噬菌体改造成的载体应用最为广泛。
(一)目的基因的制备目的基因是指所要研究或应用的基因,也就是需要克隆或.基因组DNA文库cDNA文库.聚合酶链式反应(polymerase chain reaction.化学合成(二)目的基因与载体的连接将目的基因或序列插入载体,主要通过DNA(二)Northern 印迹杂交Northern 印迹杂交是指将待测RNA 样品经电泳分离后转移到固相支持物上,然后与标记的核酸探针进行杂交,检测的方法。
其基本原理和基本过程与印迹杂交主要用于检测各种基因转录产物的大小、转录的量及其变化。
(三)斑点及狭缝印迹杂交分子杂交实验①②③目录三、探针的标记(一)探针的特征探针的特点:①要加以标记、带有示踪物,便于杂交后检测,②应是单链,若为双链用前需先行变性为单链;③具有高度特异性,只与靶核酸序列杂交;④标记的探针应具有高灵敏度、稳定、标记方法简便、安全。
(二)探针的种类及制备探针第四节 DNA芯片技术第五节基因诊断与基因治疗。
分子生物学常用技术
分子生物学常用技术分子生物学是现代生物学研究的一个重要领域,通过对细胞分子结构和功能的研究,为生命科学的进一步发展提供了重要的思路和手段。
分子生物学常用技术是在研究这一领域中必不可少的工具,下面我将从不同角度介绍这些技术。
一、DNA 提取技术DNA 提取是分子生物学中的基本技术之一,通常用于从生物样品中提取纯净的 DNA。
提取后的 DNA 可以用于 PCR 扩增、基因测序、构建谱系树和基因克隆等研究。
常用的 DNA 提取方法包括:SDS 法、酚-氯仿法、纯物直提法、磁珠提取法等。
二、PCR 扩增技术PCR 扩增技术是一种高效、快速、精确的 DNA 复制技术,它可以将少量模板 DNA 扩增到数百万份,是分子生物学领域中最常用的技术之一。
PCR 扩增实验包括:反应体系的准备、扩增程序的设置、扩增产物的分离、测序和定量分析等步骤。
三、蛋白质电泳技术蛋白质电泳技术是一种将蛋白质分离、纯化、鉴定和定量的常用技术。
常见的蛋白质电泳实验包括:SDS-PAGE,氨基酸序列鉴定,二维凝胶电泳(2-DE)等。
蛋白质电泳技术可用于研究生物体内蛋白质的分布、结构、功能和相互作用关系。
四、基因编辑技术基因编辑技术是一种新兴的分子生物学技术,可用于修改细胞或生物体的基因组序列。
最常用的基因编辑技术是 CRISPR-Cas9 技术,它基于靶向特定 DNA 序列的小RNA和 Cas9 蛋白的结合,从而在特定的位置切割 DNA 分子,实现基因组修饰。
基因编辑技术在农业、医药、生物研究等领域具有广泛的应用前景。
五、RNAi 技术RNAi 技术是一种利用 RNA 干扰(RNA interference)机制抑制基因表达的技术。
RNAi 技术可以通过向细胞中导入或合成RNA 分子,干扰靶向基因的 mRNA 转录和翻译,从而抑制靶向基因的表达。
使用 RNAi 技术可研究基因功能、探索新型药物和开发生物技术等领域。
六、基因测序技术基因测序技术是一种将 DNA 或 RNA 分子序列确定下来的技术。
常用分子生物学技术的原理及其应用
常用分子生物学技术的原理及其应用常用分子生物学技术是一系列用于分析和操作分子生物学层面的实验技术。
这些技术基于对核酸(DNA和RNA)和蛋白质的结构和功能的研究,以及对基因表达和调控机制的理解。
在本文中,我将介绍常用分子生物学技术的原理和应用。
1.聚合酶链式反应(PCR):PCR是一种能够从极少量的DNA样本中扩增特定DNA序列的技术。
它基于DNA的两条链之间的互补配对,使用DNA聚合酶酶和引物来在离子和温度周期变化的条件下进行。
PCR技术广泛应用于分子生物学和生物医学研究中,包括基因克隆、基因突变分析、DNA指纹鉴定以及病原体的检测等。
2.聚丙烯酰胺凝胶电泳:凝胶电泳是一种分离和分析DNA,RNA和蛋白质的常用技术。
其中,聚丙烯酰胺(或琼脂糖)是一种高分子量聚合物,能够形成孔隙凝胶。
在电场的作用下,DNA,RNA或蛋白质在凝胶中迁移,根据大小和电荷的差异进行分离。
凝胶电泳广泛用于DNA和RNA的分离和纯化,以及蛋白质的分析和鉴定。
3.DNA测序:DNA测序是确定DNA序列的技术。
它通过测量DNA片段中的碱基顺序来分析DNA的序列信息。
目前有多种DNA测序技术,包括链终止测序(Sanger测序)和高通量测序(如Illumina测序和Ion Torrent测序)。
DNA测序在基因组学、遗传学和基因诊断中起着重要的作用。
4.基因克隆技术:基因克隆是指将目标基因从其源DNA中扩增,并将其插入到载体DNA 中,然后转化到宿主细胞中。
利用基因工程技术,克隆的基因可以在宿主细胞中被表达。
这种技术被广泛应用于重组蛋白质的定制表达、转基因生物的制备以及基因治疗的研究中。
5. 蛋白质电泳和Western blot:蛋白质电泳是一种分离和分析蛋白质的技术。
与DNA电泳类似,蛋白质电泳通过在聚丙烯酰胺凝胶中迁移蛋白质来分离不同大小和电荷的蛋白质。
Western blot是一种检测目标蛋白质的特异性抗体的技术,通过将蛋白质转移到膜上,然后使用特异性抗体与目标蛋白质结合来检测和定量蛋白质。
分子生物学技术
分子生物学技术分子生物学技术是一门研究生物分子的结构、功能和相互作用的科学领域。
它通过一系列研究方法和实验技术,揭示生物体内分子的组成,研究其在生物规律中的作用,为生物科学的发展和应用提供了有力的支持。
本文将介绍几种常见的分子生物学技术及其在科学研究和应用中的重要性。
第一种技术是聚合酶链式反应(PCR)。
PCR是一种能够快速、准确地复制DNA片段的技术。
通过PCR,可以从微量的DNA模板扩增出大量的DNA片段,为后续的实验提供足够的样本。
PCR的过程包括三个步骤:变性、退火和延伸。
在变性过程中,DNA双链被加热分离为两条单链;在退火过程中,引物与目标DNA序列互补结合;在延伸过程中,DNA聚合酶通过合成新的DNA链。
PCR技术在基因克隆、基因检测和基因定量等领域得到广泛应用。
第二种技术是DNA测序。
DNA测序是确定DNA序列的方法。
通过对DNA分子进行测序,可以了解其中所包含的信息,以及基因在细胞中的功能。
测序的过程中,通常使用Sanger方法,也就是反复进行DNA聚合酶链式延伸反应,结果是生成一系列不同长度的DNA片段。
这些片段会被分离、检测和记录,得到DNA序列。
DNA测序技术对于遗传病的诊断和治疗、疾病基因的研究以及进化生物学的研究等有着重要意义。
第三种技术是凝胶电泳。
凝胶电泳是一种常用的分离和分析DNA、RNA、蛋白质等生物大分子的方法。
凝胶电泳通过电场的作用,使带电粒子在凝胶基质中迁移,根据它们的大小和电荷进行分离。
凝胶电泳可实现DNA分子的分离和纯化,以及分析DNA片段的大小、形状和数量等信息。
凝胶电泳技术在基因分型、基因突变检测、DNA指纹鉴定等领域被广泛应用。
第四种技术是基因克隆。
基因克隆是指将DNA片段插入到载体DNA中,并通过细胞转化等方法使其复制。
基因克隆技术在分子生物学研究和基因工程中具有重要的应用价值。
通过基因克隆,可以扩大DNA 片段的数量,并将其引入到其他生物系统中进行研究。
常用分子生物学技术的原理及应用
根据中心法则,可以RNA为模板,在逆转录酶作用下形成cDNA,于是建立了RT-PCR的方法。 根据mRNA的3’端有poly(A)的特点,在进行反转录时,就以poly(A)为模板设计了引物。并且纯化mRNA的方法,也是根据poly(A)的原理设计的。 根据最后的翻译蛋白质去向的不同,建立不同的蛋白质提取方法,如在线粒体,在细胞核、在细胞浆、分泌到血液中。
由宿主控制的限制与修饰作用使得细菌避免噬菌体感染,如果噬菌体DNA没有被修饰过,进入宿主就会被限制性酶切断。如果被修饰过,其侵染细菌的效率就提高。
限制性内切酶及由宿主控制的限制与修饰作用
分子克隆 (Molecular Cloning)
1.Vectors
Vectors: A DNA (a plasmid or a phage DNA) that serves as a carrier in gene cloning experiments.
本章常用技术词汇
一 基因工程与分子克隆
(genetic engineering and molecular cloning)
Research content: genomic library, cDNA library, gene cloning, gene expression, gene regulation, gene knockout 用于基因克隆的工具酶 (enzymes for gene cloning) 在生物技术中常用的各种工具酶系指能用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、反转录等有关的各种酶系统称为工具酶。
非模板链称为有意义链,而模板常称为反义链。
以DNA一条链为模板, 诱导RNA聚合酶活性、RNA聚合酶识别并结合在转录起始位点 以ATP、GTP、CTP和UTP为前体,合成(转录)RNA 当遇到转录终止信号时,转录即停止。
(生物科技行业类)分子生物学常用技术的原理及其应用及人类基因组学
第八章分子生物学常用技术的原理及其应用及人类基因组学测试题一、名词解释1.分子杂交2.Southern blotting3.Northern blotting4.Western blotting5.dot blotting6.DNA芯片技术7.PCR8.功能性克隆9.转基因技术二、填空题1.Southern blotting用于研究、Northern blotting用于研究,Western blotting用于研究。
2.PCR的基本反应步骤包括、和三步。
3. 在PCR反应体系中,除了DNA模板外,还需加入、、和。
4.Sange法测序的基本步骤包括、、和。
5.目前克隆致病相关基因的主要策略有、、。
6.血友病第Ⅷ因子基因的首次克隆成功所采用的克隆策略是,而DMD致病基因的克隆所采用的克隆策略是。
三、选择题A型题1. 经电泳分离后将RNA转移到硝酸纤维素(NC)膜上的技术是:A.Southern blotting B.Northern blottingC.Western blotting D.dot blottingE.in situ hybridization2. 不经电泳分离直接将样品点在NC膜上的技术是A.Southern blotting B.Northern blottingC.Western blotting D.Dot blottingE.in situ hybridization3. 经电泳分离后将蛋白质转移到NC膜上的技术是A.Southern blotting B.Northern blottingC.Western blotting D.dot blottingE.in situ hybridization4. 经电泳后将DNA转移至NC膜上的技术是A.Southern blotting B.Northern blottingC.Western blotting D.Eastern blottingE.in situ hybridization5. PCR的特点不包括A.时间短,只需数小时 B.扩增产物量大C. 只需微量模板 D.用途非常广泛E. 底物必须标记6.用于PCR的DNA聚合酶必须A.耐热 B.耐高压 C. 耐酸 D.耐碱 E. 耐低温7.PCR反应过程中,模板DNA变性所需温度一般是A.95 ︒C B.85 ︒C C.75 ︒C D.65 ︒C E.55 ︒C8.PCR反应过程中,退火温度一般是A.72 ︒C B.85 ︒C C.75 ︒C D.65 ︒C E.55 ︒C 9. PCR反应过程中,引物延伸所需温度一般是A.95 ︒C B. 82 ︒C C.72 ︒C D.62 ︒C E.55 ︒C 10.PCR反应体系不包括A. 模板DNA B.TaqDNA聚合酶C. 上、下游特异性引物A、B D.ddNTPE.含Mg2+的缓冲液11.PCR的循环次数一般为A.5~10次 B.10~15次 C.15~20次D.20~25次 E.25~30次12.PCR反应体系与双脱氧末端终止法测序体系不同的是缺少A.模板 B.引物 C. DNA聚合酶D.ddNTP E.缓冲液13.Sanger法测序不需要A.Klenow小片段 B.引物 C. dNTPD.标记dNTP E.ddNTP14.Sanger法测序的基本步骤不包括A.标记模板 B.模板一引物杂交 C.电泳D.引物的延长与合成阻断 E.放射自显影直读图15.Sanger法测序的四个反应体系中应分别加入不同的A.模板 B.引物 C标记dNTP D.DNA聚合酶 E. ddNTP16.人类基因组计划的主要研究内容不包括A.遗传图分析 B.物理图分析 C.转录图分析D. 序列图分析 E.蛋白质功能分析17.1996年,英国科学家克隆的Dolly羊所采用的技术是A.转基因技术 B.核转移技术 C.基因剔除技术D.肽核酸技术 E. 反义核酸技术18.Maxam—Gilbert法与Sanger法测序的共同点是均需A. 引物 B.Klenow大片段 C. ddNTPD. 化学裂解试剂 E.电泳后放射自显影读图19.Sanger法测序所得直读图像中,由终点至始点所读序列为A.待测DNA5'到3'的碱基序列B.待测DNA3'到5'的碱基序列C.待测DNA互补链3'到5'的碱基序列D.待测DNA互补链5'到3'的碱基序列E.引物5'到3'的碱基序列20.PCR实验的特异性主要取决于:A.DNA聚合酶的种类 B. 反应体系中模板DNA的量C.引物序列的结沟和长度 D.四种dNTP的浓度E. 循环周期的次数21.基因剔除(knock out)的方法主要被用来研究A.基因的结构 B.基因的功能 C. 基因的表达D.基因的调控 E.基因的突变22. 反义核酸作用主要是A.封闭DNA B.封闭RNA C.降解DNAD.降解DNA E.封闭核糖体的功能23.有关Sanger法测序的叙述,不正确的是A.只需标记一种dNTPB. 一般应去除DNA聚合酶I的5'到3'外切酶活性C.与dNTP相比阻断剂应尽可能的多D.反应时间不必太长E. 应采用超薄高压电泳B型题(1—5)A.Northern blotting B.dot blotting C.Western blottingD. Southern blottingE. in situ hybridizanon1..用限制性内切酶酶切后进行电泳分离,再将DNA转移到NC膜上杂交的技术是2.电泳分离后将RNA转移至NC膜上杂交的技术是3.电泳分离后将蛋白质转移至NC膜上,与标记蛋白杂交的技术是4.不经电泳直接将样品点在NC膜上杂交的技术是5. 在组织切片上直接与探针杂交的技术是(6—8)A.95︒C B.85 ︒C C.72︒C D.65︒C E.55︒C6.PCR变性温度一般是7.PCR退火温度一般是8.PCR引物延伸温度一般是(9—12)A.Taq DNA聚合酶 B. 反转录酶 C.K1cnow大片段 D.末端核苷酸转移酶 E.Klenow小片段9.同聚物加尾连接需要10.PCR需要11.Sanger法测序需要12.由mRNA合成cDNA需要X型题1.PCR反应体系中含有A.特异性引物 B.Klenow大片段 C.dNTPD.ddNTP E.35S-α-dATP2. PCR技术的反应步骤包括:A.退火 B. 复性 C. 变性 D.引物延伸E.引物终止3.DNA链末端合成终止法反应体系中含有A.引物 B.dNTP C.ddNTPD.35S-α-dATP E.TaqDNA聚合酶4.DNA链末端合成终止法反应体系中不含有A.模板 B.TaqDNA聚合酶 C.ddNTPD.化学裂解试剂 E.35S-α-dATP5.PCR技术可以用于A.病原微生物的微量检测 B.突变基因的筛选C. 法医学鉴定 D.DNA序列分析E.克隆目的基因6.克隆致病相关基因的策略包括A.定位克隆 B.非定位候选克隆 C.功能克隆D.定位候选克隆 E.随机克隆四、问答题1.何谓PCR?简述其基本原理、反应体系和主要步骤。
分子生物学实验技术
分子生物学实验技术分子生物学是现代生物学的重要分支之一,其在疾病预防、治疗和生物科技等方面有广泛应用。
本文将介绍分子生物学实验中常用的技术,并讨论其原理和应用。
一、基本实验技术1. DNA/RNA提取技术DNA/RNA提取是分子生物学实验中的基础技术之一。
DNA/RNA提取的目的是从细胞或组织中提取高质量的DNA或RNA,为其后续检测和研究做好准备。
现在市场上有多种DNA/RNA提取试剂盒,供实验室使用。
通常,提取DNA首先将组织/细胞裂解,然后进行蛋白质沉淀、DNA沉淀、洗涤和重溶等步骤。
而提取RNA则需要防止RNA酶的污染并保护RNA的完整性。
RNA提取常见的方法是直接裂解和三步酚-氯仿法等。
2. PCR技术PCR(聚合酶链式反应)技术是一种常用的分子生物学技术,用于扩增DNA片段。
PCR反应是在一个热循环下进行的,包括退火、结合和扩增阶段。
其中,退火温度用于将引物与靶DNA结合,获得高特异性;扩增阶段用于扩增目标DNA片段,通常在72℃左右进行。
PCR技术广泛应用于疾病的诊断、基因多态性分析、DNA指纹鉴定和基因工程等方面。
对于基因工程,PCR技术在基因克隆、定量PCR、mutagenesis、突变扫描和芯片检测等方面也有重要应用。
3. 转染技术转染技术是指将外源基因或其他化合物转入目标细胞中的技术。
常用的转染方法包括:病毒介导的转染、电穿孔、化学转染及基于脂质体的转染等。
转染技术在基因治疗、模型建立、基因表达分析、药物筛选和基因敲除等方面都有广泛应用。
二、高级实验技术1. 基因测序技术基因测序是分子生物学中应用最广泛的技术之一,用于确定DNA序列。
常用的基因测序技术包括Sanger测序和新一代测序(NGS)技术。
Sanger测序是一种传统的测序技术,通过DNA聚合酶、DNA模板、引物和ddNTPs(二脱氧核苷三磷酸)来扩增和定序DNA。
此外,NGS技术的基本原理是平行测序,利用高通量测序技术对DNA样本进行重复测序,得到高质量的DNA序列。
常用分子生物学实验技术--整理
常⽤分⼦⽣物学实验技术--整理常⽤的分⼦⽣物学实验技术:离⼼技术: 是分离纯化蛋⽩质、酶、核酸(DNA、RNA)、细胞的最常⽤⽅法之⼀。
电泳(electrophoresis):带电粒⼦在电场中向着与其所带电荷相反⽅向电极移动的现象。
可⽤于分离不同分⼦量的⽣物⼤分⼦。
1.蛋⽩质的电泳: ⽤途:蛋⽩质的定量。
2.核酸的电泳: ⽤途:⽤于核酸的分离、鉴定、纯化、回收。
⽐如:我只需要长度300bp左右的分⼦。
那么,电泳后,在切胶过程中,只切300bp处的分⼦即可。
蛋⽩质研究相关的技术: 1. 含量测定: 2. 结构的测定: (1)⼀级结构的测定:搞清楚蛋⽩质肽链的氨基酸排列顺序。
⽅法:Edman降解法、质谱法(MS, 将蛋⽩⽔解,多肽链分成⼩段。
检测肽段) (2)空间结构测定:蛋⽩空间结构分析⽐⼀级结构分析复杂得多。
⽅法:X射线衍射晶体分析法、核磁共振法等。
3. 功能的测定: (1)酵母双杂交(YTH): 假设:欲检测蛋⽩X与蛋⽩Y是否相互作⽤。
检测⽅法: 将蛋⽩X与报告基因转录因⼦的BD融合; 将蛋⽩Y与AD融合; 确认蛋⽩X与蛋⽩Y形成的复合体能否激活报告基因的表达。
如果能激活报告基因的表达,说明:X与Y形成了复合体,则BD和AD靠近,激活了下游报告基因的表达;反之,报告基因不表达。
原理: 真核⽣物的转录因⼦(尤其是酵母转录因⼦GAL4),包括两个彼此分离、但功能必需的结构域:⼀个是与DNA结合的结构域-BD;⼀个是转录激活域-AD。
BD识别转录因⼦效应基因的上游序列并与之结合;AD通过与转录复合体的其他成分作⽤,启动下游的基因转录。
即使BD与AD分开,但如果在空间上较为接近时也能激活转录。
——利⽤转录因⼦的BD、AD这⼀特性,通过检测转录因⼦是否启动了其效应基因的表达,可研究蛋⽩质X与Y是否相互作⽤。
(2)蛋⽩质芯⽚技术:⼀种⾼通量、微型化、⾃动化的蛋⽩质分析技术。
⼀次试验中可同时检测⼏百甚⾄⼏千种⽬标蛋⽩或多肽。
分子生物学技术
分子生物学技术分子生物学技术是研究和应用分子生物学的一系列实验方法和技术。
这些技术广泛应用于基因组学、蛋白质研究、遗传工程、疾病诊断和治疗等领域。
以下是一些常见的分子生物学技术:1. PCR(聚合酶链反应):PCR是一种体外扩增DNA的技术,通过引物与DNA片段的特异性连接,并利用聚合酶酶活来合成新的DNA链,从而扩增目标DNA序列。
2. 胶体电泳:胶体电泳是一种常用的分离和分析DNA、RNA和蛋白质的方法。
该技术通过将目标分子置于电场中,利用其电荷差异、大小差异或空间结构差异而进行分离。
3. 基因克隆:基因克隆是将目标DNA片段插入载体DNA的过程。
常用的载体包括质粒、噬菌体等。
通过基因克隆,可以将目标基因表达在宿主细胞中,从而研究基因功能和产生蛋白质。
4. DNA测序:DNA测序是确定DNA序列的方法。
常用的测序方法包括Sanger测序和高通量测序(如Illumina 测序),通过读取DNA碱基的顺序来确定DNA的序列。
5. 基因组学:基因组学是研究基因组结构、功能和演化的学科。
通过高通量测序技术,可以在较短时间内测序大量基因组DNA,进一步了解生物的遗传信息。
6. 蛋白质表达和纯化:蛋白质表达和纯化是研究蛋白质结构和功能的关键步骤。
通过基因工程技术,将目标基因转入表达宿主中,使其表达目标蛋白质,并通过柱层析等技术纯化目标蛋白质。
7. RNA干扰(RN):RNA干扰是一种通过转染或合成小RNA来沉默目标基因的技术。
RN可用于研究基因功能、筛选潜在药物靶点等。
8. 基因编辑:基因编辑是利用CRISPR-Cas9等基因编辑工具来对基因组进行定点修饰的技术。
基因编辑技术可以用于研究基因功能、治疗遗传病等。
这些技术使得分子生物学研究更加精确、高效和全面,为生命科学的发展和应用提供了基础。
常用分子生物学技术的原理及应用
常用分子生物学技术的原理及应用1.聚合酶链反应(PCR):PCR是一种在体外快速合成特定DNA片段的技术。
它的原理是基于DNA的逐步复制。
PCR需要DNA模板、DNA聚合酶、引物和dNTPs等反应物。
通过多个循环的高温退火、DNA扩增和DNA合成过程,可以在短时间内扩增指定的DNA片段。
应用:PCR在许多领域得到广泛应用。
它可用于基因组学、遗传学、医学诊断、病毒学等领域。
例如,PCR可以用于检测基因突变、诊断遗传疾病、鉴定病原体等。
2.DNA测序:DNA测序是一种确定DNA序列的技术。
目前主要有Sanger测序和高通量测序两种方法。
(1)Sanger测序原理:Sanger测序是一种经典的测序方法,基于DNA的DDN反应。
它利用碱基的链终止效应,使DNA合成过程在产生溶胶碱基的情况下中断,从而得到不同长度的DNA片段。
通过电泳分离并测定不同长度的DNA片段,可以确定DNA序列。
(2)高通量测序原理:高通量测序技术,如Illumina测序、Ion Torrent测序和Pacific Biosciences测序等,通过以平行方式同时测序多个DNA片段,大大提高了测序效率和数据产量。
应用:DNA测序技术在基因组学、癌症研究、生物进化等方面具有广泛应用。
它可以用于发现新基因、研究遗传变异、揭示物种演化等。
3.基因克隆:基因克隆是将DNA片段插入载体(如质粒)中并转化到细胞中,从而实现特定基因的复制和表达。
基因克隆包括DNA片段的剪接、连接、转化和筛选等步骤。
应用:基因克隆技术是分子生物学研究的基础。
它可以用于制备重组蛋白、构建转基因植物和动物、研究基因功能等。
4.蛋白质表达:蛋白质表达是将基因转录为mRNA,再通过翻译作用合成蛋白质的过程。
蛋白质表达技术包括原核和真核表达系统。
(1)原核表达系统:原核表达系统常用的有大肠杆菌表达系统和酵母表达系统。
这些系统可以用于高效表达蛋白质,并且易于操作。
(2)真核表达系统:真核表达系统是利用真核细胞如CHO、HEK293等表达蛋白质。
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P— A A T T C********* OH— —OH *********C T T A A — P 3′ 5′
DNA连接酶
EcoR I
5′ **********GAATTC********** **********CTTAAG********** 3′
EcoR I
3′
3′ 3′ 5′
5′
A A T T C********* OH—G*********
作用模式图: 2. 产生3′突出粘性末端
5′ 3′ 5′
3′ 5′
3′
5′
**********CTGCAG************** **********GACGTC**************
Pst I
Alu I
5′
3′
5′ 3′
3′ 5′
*************A —OH —P G
P — CT************* OH— GA*************
*************TC 3′ 5′
限制性内切酶用途:
1.基因重组过程中切割DNA以获取目的基 因片段,切割载体形成切口,使目的 基因能插入载体中。
3′
3′
5′
3′
5′
*********C T G C A —OH *********G — P
OH— A C G T C***********
P — G***********
作用模式图:
3. 产生平末端(blunt end)
5′ 3′
*************AGCT************* *************TCGA************* 5′ 3′
病毒把某一细胞的DNA带至另一细胞, 使后者获得新的遗传表型
DNA片段从染色体的某处移位到另一处。
四、基因重组(recombinant) 不同DNA分子间发生的共价连接 重组的类型: 1. 位点特异性重组 (site-specific recombination) 2. 同源重组 (homologous recombination)
第十二章
分子生物学常用技术 及其应用
序言
21世纪是生命科学的世纪!
生物技术是当今发展最快、最活跃、 对社会 与经济的发展有巨大推动力的高科技领域。其 中基因工程和发酵工程是生物技术的核心。
世界各国政府高度重视生物技术
我国政府将其列为信息通讯、航天、新能源、 新材料等高科技领域的第二位。可见其战略地位。
2.限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphysms, RFLP)分析:遗传病的诊断,法医 DNA指纹分析等。 3.构建DNA的物理图谱,基因定位,DNA的 同源性分析等等。
(二)DNA连接酶(DNA ligase) ——基因工程的缝纫针
催化两条双链DNA分子的互补粘性末 端或平末端的5′磷酸基团与3′羟基形成磷 酸酯键。
功能: 2. DNA指导的DNA聚合酶活性;核糖核 酸酶H活性;DNA解旋酶活性等。 用途: 1. 反转录酶的最主要作用是以mRNA 为模板合成互补DNA(complementary DNA,cDNA)。 2. 以单链DNA或RNA为模板制备探针。
是免疫球蛋白多样性的分子机制。
第二节
基因工程的工具 ——工具酶和载体
一、 常用的工具酶
(一)限制性内切酶(restriction endonuclease) ---切——基因工程的手术刀 没有限制性内切酶的发现和应用,就 很难有今天分子生物学与基因工程的快 速发展。
识别双链DNA中特异序列,该序列的特征为 4-6个核苷酸的回文结构,并在识别序列内或附 近特异切割DNA,产生粘性末端或平末端。
功能: 根据需要在特定的位点精确切割 双链DNA分子
作用模式图: 1. 产生5′突出粘性末端(sticky end)
5′ 3′ 5′ 3′ 3′ 5′ 5′
P **********GAATTC******** **********CTTAAG********
*********G —OH *********C T T A A — P
1. 同源重组(homologous recombination)
机制
A B a b
同源区
A
B a b A B a b
B
A
b
a
B
a
b
A
功能 1. 在减数分裂过程中,同源染色体之间 进行交换,形成生物个(群)体的多样性。 2. 是DNA损伤修复的重要机制之一。
2. 位点特异性的基因重组 由整合酶催化,重组仅在特定的基 因片段和位点上进行。
3′
5′
作用模式图: 2. 连接平末端
5′ 3′ ************TC —OH ************AG — P 3′ 5′ 5′ 3′ P — CT************* OH— GA************* 3′ 5′
DNA连接酶
Alu I
5′ 3′ *************AGCT************** *************TCGA**************
3′ 5′
(三) 反转录酶(Reverse Transcriptase)
1. RNA指导的DNA聚合酶活性: 功能: 以RNA为模板,以带3′-OH末端的 DNA片段为引物, 沿5′至3′方向合成 DNA链。 3′AAAAAAUCUGUCCUA……5′ 5′TTTTTTT—OH 3′ dNTP 反转录酶 Mg2+ 3′AAAAAAUCUGUCCUA……5′ 5′TTTTTTT AGACAGGAT……3′
生物技术正在改变人们的生活和观念
随着基因组计划的接近完成及后基因组计划的 开展,借助计算机处理复杂信息的强大能力,21世 纪的生物技术将会有更大发展,有些领域甚至可能 有重大突破。
第一节 自然界的基因转移和重组
一、接合 二、转化 三、转导 四、转座
质粒DNA从一个细胞转移至另一细胞 通过自动获取或人为地供给外源 DNA,使细胞获得新的遗传表型
功能: 将两条双链DNA片段连接起来, 实现 DNA的体外重组。
DNA连接酶催化平末端连接要比粘性末 端 效率低得多。
也可将双链DNA分子内部的单个切 口(无核苷酸空缺)连接起来。还可作用 于RNA,但效率很低。
如需连接单链DNA或RNA,则需用 RNA连接酶。
DNA连接酶
作用模式图:
5′
1. 连接粘性末端