蛋白表达纯化 PPT
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蛋白质一般的纯化流程(共15张PPT)
持膜內外電位差平衡h移在冰浴中加入烘乾並磨碎的ammoniumsulfate至飽和度為60取50ml待Байду номын сангаас化之蛋白質攪拌15分鐘後以9000xg離心15min取出沉澱物並標示鹽析濃度上清液重複上述步驟作ammoniumsulfate至飽和度100分別取出其沉澱物準備透析沉澱物以buffer溶解將溶液置于透析管中在001mph7的phosphatebuffer中進行4透析隔夜
蛋白質一般的純化流程
純化流程
Cell or organ lysis salting out 、 dialysis
protein concentration of quantitation enzyme activity test
Purification(純化)
Chromatography
(gel filtration、ion exchanger、affinity chromatography etc. HPLC)
取出沉澱物，並標示鹽析濃度
上清液重複上述步驟， 作ammonium sulfate
至飽和度100%
分別取出其沉澱物準備透析
透析
沉澱物以buffer溶解
將溶液置於透析管中
在0.01M 、pH=7的phosphate buffer中
進行4℃透析隔夜
溶解：溶質均勻分佈在水溶液中
鹽析（Salting Out)
利用鹽類與水的交互作用大於水與蛋白質 的交互作用將蛋白質沈降出來
Ammonium Sulfate
Ammonium Sulfate Fraction Ammonium Sulfate % Saturation (p. 31)
透析膜透析
• 透析管：Sectra / Por memebrance
蛋白質一般的純化流程
純化流程
Cell or organ lysis salting out 、 dialysis
protein concentration of quantitation enzyme activity test
Purification(純化)
Chromatography
(gel filtration、ion exchanger、affinity chromatography etc. HPLC)
取出沉澱物，並標示鹽析濃度
上清液重複上述步驟， 作ammonium sulfate
至飽和度100%
分別取出其沉澱物準備透析
透析
沉澱物以buffer溶解
將溶液置於透析管中
在0.01M 、pH=7的phosphate buffer中
進行4℃透析隔夜
溶解：溶質均勻分佈在水溶液中
鹽析（Salting Out)
利用鹽類與水的交互作用大於水與蛋白質 的交互作用將蛋白質沈降出來
Ammonium Sulfate
Ammonium Sulfate Fraction Ammonium Sulfate % Saturation (p. 31)
透析膜透析
• 透析管：Sectra / Por memebrance
重组蛋白质表达、复性与纯化.ppt
为什么要 • HA-tag (YPYDVPDYA)
• Flag-tag (DYKDDDDK)
加 tag ? • Myc-tag (EQKLISEEDL)
有前景的特殊用途的tag
• Biotinylation-tag
100多AA的结构域, 在大肠杆菌中被识别为生 物素化的位点. Promega的PinPointTM Xa-1; Invitrogen的pET104-DEST. • 未命名 DVEAWLGAR, 被用来和streptoavidin结合 (个人通讯)
在大肠杆菌中表达 重组蛋白质
• 如果目的蛋白质有二硫键并需要 正确的立体结构, 尽可能进行可 溶性表达;
• 如果目的蛋白质没有二硫键或只 用来制备抗血清, 采用包含体表达 比较好;
• 如果目的多肽的分子量小于 10 kDa, 一定要进行融合表达
大肠杆菌表达载体分类
按蛋白质类型分
• 单纯表达: pJLA系列, 用NcoI/NdeI导入AUG的载体 • 融合表达: 融合各种tag, GST, CBD, MAL, GFP, etc • 分泌表达: pel/ompT分泌肽
• 质粒不稳定，尚无商品化的表达 载体
其他
•乳酸菌 (Lactic acid bacteria) •沙门氏菌 (Salmonella typhimurium) •苏云金杆菌
(Bacillus thuringiensis)
真核细胞表达体系
酵母细胞 昆虫细胞 植物细胞/组织 哺乳动物细胞/组织
酵母细胞
两种主要的分子伴侣
Type I: chaperones which are functionally responsible for the correct folding, assembly and transport of newly synthesized peptide– HSP family,GroELS,ect.
• Flag-tag (DYKDDDDK)
加 tag ? • Myc-tag (EQKLISEEDL)
有前景的特殊用途的tag
• Biotinylation-tag
100多AA的结构域, 在大肠杆菌中被识别为生 物素化的位点. Promega的PinPointTM Xa-1; Invitrogen的pET104-DEST. • 未命名 DVEAWLGAR, 被用来和streptoavidin结合 (个人通讯)
在大肠杆菌中表达 重组蛋白质
• 如果目的蛋白质有二硫键并需要 正确的立体结构, 尽可能进行可 溶性表达;
• 如果目的蛋白质没有二硫键或只 用来制备抗血清, 采用包含体表达 比较好;
• 如果目的多肽的分子量小于 10 kDa, 一定要进行融合表达
大肠杆菌表达载体分类
按蛋白质类型分
• 单纯表达: pJLA系列, 用NcoI/NdeI导入AUG的载体 • 融合表达: 融合各种tag, GST, CBD, MAL, GFP, etc • 分泌表达: pel/ompT分泌肽
• 质粒不稳定，尚无商品化的表达 载体
其他
•乳酸菌 (Lactic acid bacteria) •沙门氏菌 (Salmonella typhimurium) •苏云金杆菌
(Bacillus thuringiensis)
真核细胞表达体系
酵母细胞 昆虫细胞 植物细胞/组织 哺乳动物细胞/组织
酵母细胞
两种主要的分子伴侣
Type I: chaperones which are functionally responsible for the correct folding, assembly and transport of newly synthesized peptide– HSP family,GroELS,ect.
蛋白质的表达纯化
同时，通过蛋白质的表达和纯化，还可以进行药物作用机制的研究。例如，通过 亲和层析等技术，可以纯化出与药物结合的靶蛋白，进而分析药物的作用机制和 作用位点。这有助于深入理解药物的作用原理，为新药设计和开发提供重要依据 。
06
蛋白质的表达与纯化的挑战与 展望
高表达量和高纯度蛋白质的获得
表达量
优化基因克隆、宿主菌选择和培养条件，以提高蛋白质的表达量。
操作条件
操作过程中需要注意pH值、离子强度等参数的调节，以适 应不同蛋白质的分离需求。
亲和色谱法
1 2
原理
亲和色谱法利用生物分子之间的特异性亲和力进 行分离，如抗原-抗体、酶-底物等。
常用亲和剂
常用的亲和剂包括酶的抑制剂、免疫球蛋白、生 物素等。
3
操作条件
操作过程中需要注意亲和剂的再生和循环使用， 以提高分离效率。
生物学活性检测
通过生物学实验检测蛋白质的生物学活性，如酶活性、配体结合能 力等。
04
蛋白质的表达与纯化的影响因 素
基因的拷贝数和启动子强度
基因拷贝数
基因的拷贝数越多，蛋白质的表 达量越高。但过高的拷贝数可能 导致细胞死亡或蛋白质表达抑制 。
启动子强度
启动子是RNA聚合酶识别和结合 位点，启动子强度决定了蛋白质 的表达水平。选择合适的启动子 是蛋白质表达的关键。
蛋白质的表达纯化
目 录
• 蛋白质表达系统 • 蛋白质纯化方法 • 蛋白质的表达与纯化流程 • 蛋白质的表达与纯化的影响因素 • 蛋白质的表达与纯化的应用 • 蛋白质的表达与纯化的挑战与展望
01
蛋白质表达系统
原核表达系统
01
02
03
表达量高
原核表达系统如大肠杆菌 表达系统能够高效表达外 源基因，产生大量的重组 蛋白质。
06
蛋白质的表达与纯化的挑战与 展望
高表达量和高纯度蛋白质的获得
表达量
优化基因克隆、宿主菌选择和培养条件，以提高蛋白质的表达量。
操作条件
操作过程中需要注意pH值、离子强度等参数的调节，以适 应不同蛋白质的分离需求。
亲和色谱法
1 2
原理
亲和色谱法利用生物分子之间的特异性亲和力进 行分离，如抗原-抗体、酶-底物等。
常用亲和剂
常用的亲和剂包括酶的抑制剂、免疫球蛋白、生 物素等。
3
操作条件
操作过程中需要注意亲和剂的再生和循环使用， 以提高分离效率。
生物学活性检测
通过生物学实验检测蛋白质的生物学活性，如酶活性、配体结合能 力等。
04
蛋白质的表达与纯化的影响因 素
基因的拷贝数和启动子强度
基因拷贝数
基因的拷贝数越多，蛋白质的表 达量越高。但过高的拷贝数可能 导致细胞死亡或蛋白质表达抑制 。
启动子强度
启动子是RNA聚合酶识别和结合 位点，启动子强度决定了蛋白质 的表达水平。选择合适的启动子 是蛋白质表达的关键。
蛋白质的表达纯化
目 录
• 蛋白质表达系统 • 蛋白质纯化方法 • 蛋白质的表达与纯化流程 • 蛋白质的表达与纯化的影响因素 • 蛋白质的表达与纯化的应用 • 蛋白质的表达与纯化的挑战与展望
01
蛋白质表达系统
原核表达系统
01
02
03
表达量高
原核表达系统如大肠杆菌 表达系统能够高效表达外 源基因，产生大量的重组 蛋白质。
蛋白表达和纯化课件
Part 1: 蛋白表达、纯化
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
蛋白表达流程
1. 目的基因cDNA 2. 表达宿主 3. 载体 4. 设计引物 5. 连接转化 6. 诱导表达 7. 蛋白纯化 8. 鉴定保存
gene
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E. coli
rapid (30 min) low
high refolding may be
required no
no no no no no low
Yeast
rapid (90 min) low
low – high refolding may be required high mannose
yes yes yes yes no low
c: 转录终止子还能增强mRNA分子的稳定性, 大大提高蛋白质产物水平。
d:在构建大肠杆菌表达载体时，通常是添加全部终止密码子 , 阻止核糖体跳跃 (skipping )现象。
e:大肠杆菌格外偏爱使用终止密码子UAA, 当其后连上一个U而形成四联核苷酸 的情况下 , 转译终止效率便会得到进一步加强
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Host
Cell-free
Bacterial
Yeast
Mammalian Insect
Expression System Characteristics 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
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蛋白表达流程
1. 目的基因cDNA 2. 表达宿主 3. 载体 4. 设计引物 5. 连接转化 6. 诱导表达 7. 蛋白纯化 8. 鉴定保存
gene
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E. coli
rapid (30 min) low
high refolding may be
required no
no no no no no low
Yeast
rapid (90 min) low
low – high refolding may be required high mannose
yes yes yes yes no low
c: 转录终止子还能增强mRNA分子的稳定性, 大大提高蛋白质产物水平。
d:在构建大肠杆菌表达载体时，通常是添加全部终止密码子 , 阻止核糖体跳跃 (skipping )现象。
e:大肠杆菌格外偏爱使用终止密码子UAA, 当其后连上一个U而形成四联核苷酸 的情况下 , 转译终止效率便会得到进一步加强
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Host
Cell-free
Bacterial
Yeast
Mammalian Insect
Expression System Characteristics 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
蛋白质的分离纯化与定性定量分析(共95张PPT)
2. 亲和层析是高度浓缩的过程；
3. 可从样品中去除大量杂质； 4. 可在活性物质中去除理化性质几乎完全相同的但已失
活的那些“杂质”。
亲和层析中的三大通用技术
1. 免疫亲和层析：将蛋白质抗体偶联到免疫亲和柱可 用于抗原蛋白的纯化；
2. 凝集素亲和层析：凝集素是一大类能专一性和糖类和糖 复合物结合的蛋白质，固定化凝集素可用于糖蛋白纯化 ；
相对离心力/×g 1 000 4 000
15 000 30 000
100 000
时间/min 5 10
20 30
3～10 h
沉降的组分 真核细胞 叶绿体、细胞碎片、 细胞核 线粒体、细菌 溶酶体、细菌细胞
碎片 核糖体
2. 粗分级分离（rough fractionation）
获得蛋白质提取液后，用一定方法，将蛋白质与其它杂 蛋白分离开来。
亲和层析是基因工程中最常用的纯化技术
❖ 在各种表达载体上都带有各种标签蛋白，如GSTtag、His-tag、V5-tag等，它们不仅可用于鉴定蛋白表
达与否，更可用于与之相连的目标蛋白的纯化；
❖ 通过免疫亲和层析技术，只需一步，即可纯化带 有标签的目标蛋白。
亲和层析的优点
1. 高效与简便：一旦固定化配体制备好后，操作使用非常 方便；
❖ 疏水层析的机制与离子交换层析正好相反，因此两者 是互补的。
反向层析与疏水层析原理相同
❖ 反向层析，或称反相色谱，reverse phase
chromatography，是液相色谱分析中最常用的技术
。
❖ 当反相色谱用于蛋白质分离时，其原理与疏水层 析基本相同，区别在于：
① 疏水层析的配基疏水性较弱（苯基等），所以高盐 吸附，低盐洗脱；
3. 可从样品中去除大量杂质； 4. 可在活性物质中去除理化性质几乎完全相同的但已失
活的那些“杂质”。
亲和层析中的三大通用技术
1. 免疫亲和层析：将蛋白质抗体偶联到免疫亲和柱可 用于抗原蛋白的纯化；
2. 凝集素亲和层析：凝集素是一大类能专一性和糖类和糖 复合物结合的蛋白质，固定化凝集素可用于糖蛋白纯化 ；
相对离心力/×g 1 000 4 000
15 000 30 000
100 000
时间/min 5 10
20 30
3～10 h
沉降的组分 真核细胞 叶绿体、细胞碎片、 细胞核 线粒体、细菌 溶酶体、细菌细胞
碎片 核糖体
2. 粗分级分离（rough fractionation）
获得蛋白质提取液后，用一定方法，将蛋白质与其它杂 蛋白分离开来。
亲和层析是基因工程中最常用的纯化技术
❖ 在各种表达载体上都带有各种标签蛋白，如GSTtag、His-tag、V5-tag等，它们不仅可用于鉴定蛋白表
达与否，更可用于与之相连的目标蛋白的纯化；
❖ 通过免疫亲和层析技术，只需一步，即可纯化带 有标签的目标蛋白。
亲和层析的优点
1. 高效与简便：一旦固定化配体制备好后，操作使用非常 方便；
❖ 疏水层析的机制与离子交换层析正好相反，因此两者 是互补的。
反向层析与疏水层析原理相同
❖ 反向层析，或称反相色谱，reverse phase
chromatography，是液相色谱分析中最常用的技术
。
❖ 当反相色谱用于蛋白质分离时，其原理与疏水层 析基本相同，区别在于：
① 疏水层析的配基疏水性较弱（苯基等），所以高盐 吸附，低盐洗脱；
蛋白质纯化方法PPT课件
连 续 电 泳
.
10
几种常用的层析法
吸附层析 分配层析 离子交换层析 凝胶过滤层析 亲和层析
柱层析
.
11
离子交换层析法
此法是利用离子交换树脂作为柱层析支持物， 将带有不同电荷的蛋白质进行分离的方法。
蛋 白 质 的
离子交换树脂可以分为阳离子交换纤维素,如 羧甲基纤维素(CM纤维素）等，阴离子交换 纤维素,如二乙基氨基乙基纤维素（DEAE纤 维素）等。
蛋
白
质 的 纯 化
在外加电场作用下，带电的蛋白质颗 粒在电场中移动的速度（v）取决于 电场强度(E)，所带的净电荷(q)，蛋
方 白质的分子量、分子形状以及与介质
法 的摩擦系数(f)。
.
1
几种常用的电泳
纸电泳
醋酸纤维薄膜电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE)
(可分为圆盘电泳和垂直平板电泳）
琼脂糖凝胶电泳
可以用适当的配体洗脱液洗脱。
.
16
亲和层析法
常用的配基有抗体、抗原、激素或受体蛋 白、酶的底物和抑制剂等。层析柱载体为琼
蛋 脂糖凝胶等。 白 质 的 纯 化 方 法
.
17
蛋白质纯度等的测定
纯度和分子量的测定：采用电泳 （如聚丙烯酰胺凝胶电泳）、分子 筛层析、高速离心、高效液相色谱 等技术测定。
用已知分子量的蛋白质作为标准，则
可以估算出不同蛋白质的分子量。
.
5
.
6
等电聚焦
将两性电解质(eg:pH3-9，pH5-7)
同蛋白质样品一起加入到已经灌好
蛋 白 质
的凝胶中，在电场下，两性电解质 首先达到它的等电点而平衡，蛋白
的 质样品根据它自身的等电点分别向
蛋白表达及纯化PPT课件
萃取法
液-液萃取法
利用两种不混溶的溶剂，将目标蛋白 质从一种溶剂中转移到另一种溶剂中 。
反胶团萃取法
利用反胶团形成的微环境，选择性分 离和纯化蛋白质。
色谱法
凝胶色谱法
利用凝胶介质对不同大小的蛋白质颗粒的分离作用，将目标蛋白质与其他杂质 分离开。
离子交换色谱法
利用离子交换剂对不同带电状态的蛋白质的吸附作用，将其与其他蛋白质分离 开。
亲和层析
利用基因工程改造的蛋白质分 子上的特定标签与固相载体上 的配体结合进行分离纯化。常 用的亲和层析包括His-tag亲 和层析、GST亲和层析等。
离子交换层析和凝胶过滤 层析
与抗体药物的纯化类似，离子 交换层析和凝胶过滤层析也可 用于重组蛋白药物的进一步纯 化和精制。
蛋白质相互作用研究中的纯化应用
02
蛋白纯化方法
沉淀法
盐析法
通过加入高浓度的盐溶 液，改变蛋白质的溶解
度使其沉淀下来。
有机溶剂沉淀法
利用有机溶剂降低蛋白 质溶解度的原理，使其
沉淀。
聚合物沉淀法
利用聚合物与蛋白质的 相互作用，使蛋白质沉
淀。
低温沉淀法
在低温条件下，通过改 变蛋白质的溶解度使其
沉淀。
离心法
差速离心法
通过逐渐增加离心力，将 不同大小的蛋白质颗粒分 离开。
扩展床吸附技术
将大颗粒的介质填充于柱中，使流动相能够通过吸附作用去 除杂质，提高纯化效果。
集成化与自动化技术
集成化分离系统
将多个分离步骤集成在一个系统中， 实现连续的分离纯化，提高生产效率。
自动化控制技术
通过自动化控制系统，实现分离纯化 的全流程监控和自动调节，减少人为 误差和操作时间。
《蛋白表达纯化》课件
基础研究领域
用于解析蛋白质结构与功能、 探究生物过程和疾病机制等。
02
蛋白表达系统
原核表达系统
操作简便
原核表达系统通常在相对较低的 成本和较短的时间内实现蛋白表 达。
高表达量
原核细胞具有较高的繁殖速度， 因此可以快速获得大量的目标蛋 白。
原核表达系统
• 蛋白翻译后修饰少：原核细胞没有真核细胞复杂的翻译后 修饰机制，因此表达的蛋白通常不需要复杂的纯化步骤。
案例三：融合蛋白的表达与纯化
总结词
融合蛋白表达纯化的优势和应用
详细描述
融合蛋白是指将两个或多个蛋白质序列融合在一起形成的单一蛋白质。这种技术常用于 蛋白质标签、蛋白质相互作用研究、抗体药物等领域。融合蛋白的表达纯化具有一定的 复杂性，但通过选择合适的融合伙伴和优化表达纯化条件，可以获得高纯度和稳定性的
实验试剂的储存与使用
实验试剂应按照规定的要求进行储存， 避免因储存不当导致试剂变质或失效。
使用前应仔细核对试剂的名称、浓度、 使用过程中应控制试剂的用量，避免浪
有效期等信息，确保使用正确的试剂。
费和环境污染。
06
案例分析
案例一：重组蛋白的表达与纯化
总结词
重组蛋白表达纯化的基本流程和技术要点
详细描述
重组蛋白表达纯化是生物技术领域中常见的技术手段，主要涉及基因克隆、载体构建、转化、诱导表 达、纯化等步骤。其中，选择合适的载体和宿主细胞、优化表达条件以及纯化方案的制定是关键。
案例二：膜蛋白的表达与纯化
总结词
膜蛋白表达纯化的特殊技术和挑战
详细描述
膜蛋白是一类特殊的蛋白质，它们嵌入细胞膜中，具有跨膜结构域。膜蛋白的表达和纯化相对于可溶性蛋白具有 一定的难度。常用的表达系统包括细菌、酵母和哺乳动物细胞等。纯化时需考虑保持膜蛋白的天然状态和功能。
蛋白质的分离纯化ppt课件
质 ►每一个蛋白质分子都因为结合了许多
的 纯 化 方 法
的SDS而带有大量的负电荷，而蛋白 质分子原有的电荷则可以忽略。该法 主要利用了蛋白质分子量大小不同而 分离蛋白质。
►用已知分子量的蛋白质作为标准，则
可以估算出不同蛋白质的分子量。
等电聚焦
►将两性电解质(eg:pH3-9，pH5-7)
同蛋白质样品一起加入到已经灌好
►亚基个数的测定：采用SDS聚丙烯 酰胺凝胶电泳方法测定。
也可人工合成。根据网孔不同可制成不同规格。 ► 具备条件：1惰性，2水不溶性，3能高度水化。 ► 常用分子筛：
葡聚糖凝胶（Sephadex）
型号：G200、 G150、 G100、 G75、 G50、 G25、 G15 分离大蛋白质、小蛋白质，除盐
琼脂糖凝胶（瑞典Sepharose、美国Bio-GelA）
塑料离心 管
大分
子
4%
量
由
8%
小
12 蔗糖浓度
%16 %
—————
%20
% 蔗糖密度梯度
（介质还可用：氯化铯、甘油等）
电泳法
► 类型：பைடு நூலகம்、区带电泳 纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、粉末电泳、
细丝电泳、凝胶电泳。 凝胶电泳包括：琼脂糖凝胶、淀粉凝胶、硅
胶凝胶、聚丙烯酰胺凝胶。 聚丙烯酰胺凝胶包括：垂直板电泳、盘状电
2、改变了蛋白质单体分子的构象，不同蛋白 质的SDS复合物的短轴长度都相同，长轴长度随其分 子量的大小成正比变化。
SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳
► 由于不同蛋白质的SDS复合物具有相同的荷质 比，并具有相似的构象，因而有如下公式：
lgM=K1—K2μR
（K1、K2为常数，μR为相对迁移率）
全式金-蛋白表达与纯化的PPT
原理
促进正确折叠
手段
融合催化二硫键形成酶的标签 选择促二硫键形成的细胞（Origami系列菌株）
分泌表达
融合表达 控制表达水平 “假”包涵体 （疏水区域，膜结合等）
细胞周质表达，胞外分泌
融合溶解性高的标签（GST，MBP） 诱导温度 IPTG浓度 特殊裂解缓冲液（去垢剂，盐，核酸酶„„）
1
2
1
2
3 Lane 1：37℃
最高 蛋白种类多，需裂解 ≤50% 菌体，复杂 较少 ≤4% 变化 较大 蛋白种类少，需渗透 压休克，相对容易 纯化简单。但机理不 详，成功先例少 适用于疫苗开发、抗 体制备，前景广阔。
表达定位
菌液 离心 菌体 悬菌，渗透压休克 菌体 悬菌，裂解，离心 沉淀 溶解，离心 沉淀 胞质不溶组分 胞质可溶组分 培养基组分 细胞总蛋白 细胞周质组分
严谨调控
稀有密码子
溶解性
Rosetta系列
Origami系列
稀有密码子 不同生物使用密码子存在偏爱性。某种或某几种tRNA的缺乏，会导致外源目的基 因的mRNA 无法正常在E. coli 里表达，是为“稀有”密码子。
表达条件
• 乳糖操纵子与诱导物
• 常用表达条件的优化
乳糖操纵子与诱导物
• 1980年，Guarante L等构建了以乳糖操纵子为基础的大肠杆菌表达系统
原核表达概述 原核表达原理概述 表达载体 表达菌株 表达条件
原核表达原理概述
目的基因
构建
转化
培养，诱导
表达载体
重组载体 表达菌株
“基因——载体——菌株——培养”
表达载体
• 启动子
• 融合标签
• 常用表达载体系统
常见启动子 • λpL启动子： • trp启动子： 热诱导启动子 化学诱导启动子
促进正确折叠
手段
融合催化二硫键形成酶的标签 选择促二硫键形成的细胞（Origami系列菌株）
分泌表达
融合表达 控制表达水平 “假”包涵体 （疏水区域，膜结合等）
细胞周质表达，胞外分泌
融合溶解性高的标签（GST，MBP） 诱导温度 IPTG浓度 特殊裂解缓冲液（去垢剂，盐，核酸酶„„）
1
2
1
2
3 Lane 1：37℃
最高 蛋白种类多，需裂解 ≤50% 菌体，复杂 较少 ≤4% 变化 较大 蛋白种类少，需渗透 压休克，相对容易 纯化简单。但机理不 详，成功先例少 适用于疫苗开发、抗 体制备，前景广阔。
表达定位
菌液 离心 菌体 悬菌，渗透压休克 菌体 悬菌，裂解，离心 沉淀 溶解，离心 沉淀 胞质不溶组分 胞质可溶组分 培养基组分 细胞总蛋白 细胞周质组分
严谨调控
稀有密码子
溶解性
Rosetta系列
Origami系列
稀有密码子 不同生物使用密码子存在偏爱性。某种或某几种tRNA的缺乏，会导致外源目的基 因的mRNA 无法正常在E. coli 里表达，是为“稀有”密码子。
表达条件
• 乳糖操纵子与诱导物
• 常用表达条件的优化
乳糖操纵子与诱导物
• 1980年，Guarante L等构建了以乳糖操纵子为基础的大肠杆菌表达系统
原核表达概述 原核表达原理概述 表达载体 表达菌株 表达条件
原核表达原理概述
目的基因
构建
转化
培养，诱导
表达载体
重组载体 表达菌株
“基因——载体——菌株——培养”
表达载体
• 启动子
• 融合标签
• 常用表达载体系统
常见启动子 • λpL启动子： • trp启动子： 热诱导启动子 化学诱导启动子
蛋白表达及纯化ppt课件
蛋白表达及纯化
Part 1: 蛋白表达、纯化
蛋白表达流程
1. 目的基因cDNA
2. 表达宿主
3. 载体 4. 设计引物 5. 连接转化 6. 诱导表达 7. 蛋白纯化 8. 鉴定保存
gene
Host
Cellfree Bacteri al
Yeas t
Mammalia n
0.60 0.50 0.40
Protein preparation, extraction, clarification
Cell growth, protein overexpression Cell lysis Removal of cell debris
From: Protein Purification Handbook. Amersham Biosciences. 18-1132-29, Edition AC
转译起始序列
a: mRNA的5末端之独特的结构特征, 是决定mRNA转译起始效率的主 要因素。 b: 在构建外源基因的高效表达载体时 , 需认真选择有效的转录起 始序列。 c: 未鉴定出通用有效的转译起始序列的保守结构 (KOZAK SEQUENCE)
筛选标记: 其编码产物可被快速测定的功能单元。
pET system manual, Novagen, 11th Edition
X蛋白在大肠杆菌中表达条件优化
1：0mmol/L； 2：0.25mmol/L；3：0.5mmol/L； 4：0.75mmol/L；5：1.0mmol/L； 6：1.5mmol/L； 7：2.5mmol/L； 8：3.5mmol/L； 9：5.0mmol/L。 图1.5 X蛋白表达条件：IPTG浓度优化
1：蛋白marker；2~9：分别用IPTG 诱导表达 0、1、 2、3、4、6、8、12 h。
Part 1: 蛋白表达、纯化
蛋白表达流程
1. 目的基因cDNA
2. 表达宿主
3. 载体 4. 设计引物 5. 连接转化 6. 诱导表达 7. 蛋白纯化 8. 鉴定保存
gene
Host
Cellfree Bacteri al
Yeas t
Mammalia n
0.60 0.50 0.40
Protein preparation, extraction, clarification
Cell growth, protein overexpression Cell lysis Removal of cell debris
From: Protein Purification Handbook. Amersham Biosciences. 18-1132-29, Edition AC
转译起始序列
a: mRNA的5末端之独特的结构特征, 是决定mRNA转译起始效率的主 要因素。 b: 在构建外源基因的高效表达载体时 , 需认真选择有效的转录起 始序列。 c: 未鉴定出通用有效的转译起始序列的保守结构 (KOZAK SEQUENCE)
筛选标记: 其编码产物可被快速测定的功能单元。
pET system manual, Novagen, 11th Edition
X蛋白在大肠杆菌中表达条件优化
1：0mmol/L； 2：0.25mmol/L；3：0.5mmol/L； 4：0.75mmol/L；5：1.0mmol/L； 6：1.5mmol/L； 7：2.5mmol/L； 8：3.5mmol/L； 9：5.0mmol/L。 图1.5 X蛋白表达条件：IPTG浓度优化
1：蛋白marker；2~9：分别用IPTG 诱导表达 0、1、 2、3、4、6、8、12 h。
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步骤1. 目标基因全基因合成：
1.从基因库中搜索目标蛋白的cDNA序列。 2.根据选用的表达系统对cDNA进行密码子，mRNA二级结构等的优 化。 3.合成设计好的基因序列，将目标基因亚克隆到合适的复制质粒上。
提取mRNA，逆转录PCR得到cDNA
大家有疑问的，可以询问和交流
可以互相讨论下，但要小声点
NdeI 识别序列： 5' CA^TATG 3' IPTG诱导：lac，T5，T7启动子 热诱导：lamda phage PL和PR启动子
表达载体选择：研究目的，目的蛋白性质和预计纯化方法
重组蛋白质在大肠杆菌中的表达和纯化
步骤1. 目标基因全基因合成 步骤2. 目标基因亚克隆 步骤3. E. coli 表达菌株转化及筛选 步骤4. 目标蛋白表达及纯化
各种色谱的主要影响因素
填料性质 样品浓度 上样体积 洗脱流速 工作缓冲液的pH值，离子浓度
蛋白质纯化常用衔接技术：
1、透析。根据目的蛋白质、多肽的分子量，选取适宜的透析袋 进行透析，可以起到更换缓冲液以及去除一些低分子杂质的目的。 2、超滤。根据目的蛋白质、多肽的分子量，选取适宜截留分子 量的超滤膜进行超滤。 3、脱盐。透析、超滤可用于进行脱盐，Sephadex G25、G50常 用于蛋白质脱盐。
步骤4. 目标蛋白表达及纯化：
1.对时间，温度以及IPTG浓度等表达条件进行优化，诱导表达目标蛋 白。 2. 培养重组细菌，通过亲和，离子交换，疏水及凝胶过滤等层析方法 纯化表达的重组蛋白。 3.通过SDS-PAGE电泳检测每步结果并控制最终产品质量。 4.通过Western-blot验证目标蛋白正确性，根据蛋白质性质检测其活性
步骤2. 目标基因亚克隆：
1.扩增并抽提含有目标基因的载体质粒。 2.将目标基因亚克隆到合适的表达质粒上。 3.测序验证构建质粒的准确性。
步骤3. E. coli 表达菌株转化及筛选：
1.扩增并抽提构建好的表达质粒。 2.将表达质粒转化到高效的E. coli表达菌株中。 3.至少挑选5个阳性克隆于LB培养基中扩增并选择合适的条件， SDS-PAGE 检测蛋白表达情况，筛选出合适菌株。
包含体表达蛋白的纯化：
在E.coli系统表达重组蛋白，表达量高时，常形成包含体，包含体 易于与细胞其他组分分离，但需要注意的是蛋白复性的步骤。一般 采用盐酸胍溶解包含体蛋白后，用稀释的办法进行复性，也可以利 用透析、凝胶过滤色谱等方法进行复性。
蛋白表达纯化
研究目的：
生物学活性 纯度 数量
目的蛋白性质：
序列 相对分子质量 氨基酸组成 等电点 稳定性 亲水性
蛋白质表达系统
1. 大肠杆菌表达系统 2. 酵母表达系统 3. 哺乳动物细胞表达系统
大肠杆菌表达系统
遗传背景清楚，基因工程操作方便，商品化表达载体种类 齐全，表达效率高 基本不分泌，容易形成包涵体，无糖基化等翻译后修饰
真核表达系统
可进行分泌表达，有天然立体结构及翻译后修饰 表达量较低，培养成本较高，操作较复杂
表达系统选择：目的蛋白性质，研究目的
大肠杆菌表达形式
可溶性表达：目的蛋白含有二硫键且需要正确的立体结构 包涵体表达：无活性要求，温度和诱导剂浓度影响 融合表达：小分子蛋白
大肠杆菌表达载体
融合表达：融合各种tag，GST,CBD,GFP等 单纯表达：pJLA系列，用NcoI/NdeI导入AUG的载体
蛋白质纯化常用预处理技术：
1、菌体破碎。超声、冻融、溶菌酶 2、离心沉淀。利用离心沉降力将不溶性颗粒物与溶液分离的技术。 3、过滤。澄清过滤、除菌过滤 4、盐析。常采用硫酸铵、硫酸钠盐析 5、等电点沉淀。根据蛋白质、多肽在等电点时溶解度最小的特点进行。 6、有机溶剂沉淀。采用冷的丙酮、乙醇沉淀蛋白质。例如人血浆蛋白的 乙醇分级沉淀。 7、变性沉淀。根据目的蛋白质、多肽对于温度或者酸碱性的耐受性，在 较高的温度或者较极端的pH条件下处理样品，使杂质去除的方法。
蛋白质纯化常用层析方法
1、凝胶过滤。根据分子大小和形状进行分离的一种方法，分子量较大 的先出峰，分子量小的后出峰。 2、离子交换色谱。蛋白质、多肽均属于两性电解质，在缓冲液pH小于 其等电点时，带净正电荷，而在缓冲液pH大于其等电点时，带净负电 荷。阴离子交换凝胶本身带有正电荷基团，阳离子交换凝胶本身带负 电荷基团。由于静电相互作用而使样品结合到凝胶上，再采用盐浓度 梯度或者更换缓冲液的pH值进行洗脱。对于等电点小于5.0的酸性蛋白 质，推荐使用阴离子交换，对于等电点大于7.0的碱性蛋白质，推荐使 用阳离子交换。 3、疏水作用色谱。利用蛋白质、多肽在高盐存在下，可以结合疏水凝 胶，而在盐浓度降低时又可以解脱的原理实现分离。 4、亲和色谱。利用蛋白质、多肽与配基的特异性相互作用而进行分离。 5、反相色谱。常用于蛋白质、多肽的HPLC分析，以及多肽的精细制 备分离，分辨率极高。