乳酸链球菌素的研究进展

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乳酸链球菌素（Ｎｉｓｉｎ）是世界上公认安全的防腐剂，是一种由微生物代谢所产生的具有很强杀菌作用的天然代谢产物。

乳酸链球菌素本身具有许多优良性质：首先，容易被人体消化道中的一些蛋白酶和胰蛋白酶所降解，不会在体内蓄积而引起不良反应，并且对食品的色、香、味等无不良影响［１－２］。

使用它还可以降低杀菌温度，减少热处理时间，因此能改进食品的营养价值、风味、结构、颜色等性状，同时还可节省能耗。

Ｎｉｓｉｎ本身具有热稳定性，并耐酸、耐低温贮藏，Ｎｉｓｉｎ作为一种理想的天然防腐剂获得越来越广泛的应用。

１乳酸链球菌素的研究现状１．１乳酸链球菌素的分子结构
乳酸链球菌素（Ｎｉｓｉｎ）的分子式为Ｃ１４３Ｈ２２８Ｎ４２Ｏ３７Ｓ７，含有３４个氨基酸残基，分子量为３５１０Ｄａ。

Ｎｉｓｉｎ在天然状态下主要有两种形式，分别为ＮｉｓｉｎＡ和ＮｉｓｉｎＺ［３］，它
们之间的差别在于氨基酸顺序中第２７位氨基酸不同，在ＮｉｓｉｎＡ中是组氨酸，在ＮｉｓｉｎＺ中是天冬氨酸，在其基因结构上的第１４８位脱氧核苷酸不同是造成差别的根本原因。

一般而言，在同样浓度下，ＮｉｓｉｎＺ的溶解度和抑菌能力比ＮｉｓｉｎＡ要强。

１．２乳酸链球菌素的性质１．２．１
物理和化学性质
Ｎｉｓｉｎ的溶解性、稳定性都
与溶液的ｐＨ值密切相关。

Ｎｉｓｉｎ的溶解度随ｐＨ值的下降而提高，ｐＨ值２．５时溶解度为１２％，ｐＨ值为５．０时下降到４％，在中性及碱性条件下几乎不溶解［４］。

实验结果表明，Ｎｉｓｉｎ在酸性条件下极为稳定，ｐＨ２．０条件下可耐受高温处理（１２１℃，１５ｍｉｎ），而无活力损失，而在中性或碱性条件下即发生失活。

１．２．２
生物学特性
当α－胰蛋白酶、胰酶制剂和枯
草杆菌肽作用Ｎｉｓｉｎ后，会使其失去活性，但羧肽酶Ａ、羧肽酶Ｅ、肠肽酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶对Ｎｉｓｉｎ无作用。

Ｈｕｒｓｔ报道，Ｎｉｓｉｎ对α－凝乳蛋白酶、胰酶、
李红，赵春燕＊
（沈阳农业大学，沈阳１１０１６１）
摘要：乳酸链球菌素是某些乳链球菌产生的一种多肽物质，是一种高效、无毒副作用的天然生物防腐剂。

综述了乳酸链球菌素的研究开发与生产应用进展。

关键词：乳酸链球菌素；防腐剂；研究进展中图分类号：ＴＳ２０１．３
文献标识码：Ａ
文章编号：１００５－９９８９（２００６）０１－００７５－０４
Ｒｅｓｅａｒｃｈａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｎｉｓｉｎ
ＬＩＨｏｎｇ，ＺＨＡＯＣｈｕｎ－ｙａｎ
（ＳｈｅｎｙａｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ１１０１６１）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＮｉｓｉｎｉｓａｎａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌｍｕｌｔｉｐｅｐｔｉｄｅｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙｃｅｒｔａｉｎｓｔｒａｉｎｏｆＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ．Ｉｔｉｓａｈｉｇｈ－ｅｆｆｉ－ｃｉｅｎｃｙａｎｄｎｏｐｏｉｓｏｎｏｕｓｅｆｆｅｃｔｎａｔｕｒａｌｂｉｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ．Ｔｈｉｓｐａｐｅｒｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｄｅｓｃｒｉｂｅｄｒｅｓｅａｒｃｈｅｘｐｌｏｉｔａ－ｔｉｏｎａｎｄｐｒｏｇｒｅｓｓａｂｏｕｔｐｒｏｄｕｃｅａｎｄａｐｐｌｉｅｓｏｆｎｉｓｉｎ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｎｉｓｉｎ；ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ；ｒｅｓｅａｒｃｈａｎｄｐｒｏｇｒｅｓｓ
乳酸链球菌素的研究进展
收稿日期：２００５－０７－３０
＊通讯作者
基金项目：沈阳农业大学青年教师科技基金（２００３）项目。

作者简介：李红（１９７９－），女，辽宁铁岭人，硕士研究生，研究方向为微生物资源。

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消化酶、唾液酶等很敏感，但对粗制凝乳酶、脂酶、淀粉酶不敏感，在酸性条件下，１００℃、１０ｍｉｎ对链酶蛋白酶不敏感［５］。

１．３乳酸链球菌素的抑菌谱
Ｎｉｓｉｎ能抑制大部分革兰阳性菌及其芽孢的生长和繁殖，如葡萄球菌属、链球菌属以及梭状芽孢杆菌属和芽孢杆菌属的细菌，特别是对金黄色葡萄球菌、溶血链球菌、肉毒杆菌作用明显［６］。

在一定条件下，如冷冻、加热、降低ｐＨ值、ＥＤＴＡ处理等，乳酸链球菌素亦可抑制一些革兰阴性菌，如沙门氏菌、大肠杆菌、假单胞菌等的生长。

１．４乳酸链球菌素的抑菌机理
Ｎｉｓｉｎ的抑菌机理是近年来的研究热点之一，并不断取得突破。

其抑菌作用主要是杀菌，而非抑菌或溶菌。

Ｎｉｓｉｎ对营养细胞的作用主要是在细胞膜上，它可以抑制细菌细胞壁中肽聚糖等的生物合成，使细胞膜和磷脂化合物的合成受阻，导致细胞内物质外泄，引起细胞裂解［７］。

１．５Ｎｉｓｉｎ合成的遗传学研究
编码Ｎｉｓｉｎ的遗传密码的确切位置有两种理论，一种认为它与质粒连锁，另一种则认为是在染色体上。

支持前一种观点的主要证据有：１９４７年，Ｋｏｚａｋ研究产Ｎｉｓｉｎ菌株的突变现象时发现，若先以原黄素或溴乙啶诱变并进行高温处理，再以ＮＴＧ进行诱变，未检测到回复突变株。

并据此推测Ｎｉｓｉｎ基因可能位于质粒上。

进一步研究发现，Ｎｉｓｉｎ的产生与一个１７．５ＭＤａ的质粒有关。

１９９１年，Ｋａｌｅｔｔａ和Ｅｎｔｉａｎ从乳酸链球菌素６Ｆ３的质粒中成功克隆到了编码Ｎｉｓｉｎ的结构基因。

但是，另一些研究者认为Ｎｉｓｉｎ基因位于染色体上，并有实验证明一些产Ｎｉｓｉｎ的菌株并不存在质粒［８］。

对Ｎｉｓｉｎ基因定位的研究最近取得的一些突破性进展，一些研究者根据对染色体的缺失与杂交实验提出Ｎｉｓｉｎ结构基因与染色体上的一个可接合转移的转座子有关。

Ｈｏｒｎ等人则提出Ｎｉｓｉｎ基因存在于一个７０ｋｂ大小的转座子Ｔｎ５３０１中，同时另一些研究者的工作也证实了这个转座子的存在，且发现Ｎｉｓｉｎ基因座是不稳定的。

这些发现可能提示我们Ｎｉｓｉｎ基因位于一个可转座于质粒和染色体上的转座子中，在不同的菌株中，Ｎｉｓｉｎ基因的位置不一定相同［９］。

１９８８年，Ｎｉｓｉｎ基因首次被克隆出来。

不同于大部分的多肽类抗生素，Ｎｉｓｉｎ前体蛋白是由核糖体合成，经过一系列包括脱水、硫环形成等复杂的翻译后加工过程，最终形成有活性的成熟Ｎｉｓｉｎ分子［１０］。

对Ｎｉｓｉｎ遗传学研究的深入，将使我们有可能定向改变
Ｎｉｓｉｎ的溶解度、稳定性、抑菌范围等，对于Ｎｉｓｉｎ的应用前景有着重大而深远的意义。

２Ｎｉｓｉｎ生产与应用研究进展２．１Ｎｉｓｉｎ产生菌的筛选
目前主要是利用Ｎｉｓｉｎ产生菌中ｎｉｐ＋ｎｉｓｒｓｕｃ＋紧密连锁的原理，在添加乳链菌肽、蔗糖及溴甲酚紫的选择培养基上，从牛奶样品中定向筛选Ｎｉｓｉｎ产生菌［１１］。

也有通过检测在ＢＣＰ－ＣａＣＯ３培养基中溶钙圈大小而间接选择Ｎｉｓｉｎ生产菌方法的报道。

２．２Ｎｉｓｉｎ的发酵生产
在Ｎｉｓｉｎ的生产中，主要是以乳链球菌和乳酸乳球菌作为生产菌，通过诱变方法获得高产菌株，并通过改变培养基配方以进一步提高产量。

其中，对培养基配方的研究进行的较为活跃。

一方面，可以扩大Ｎｉｓｉｎ应用，另一方面，对营养与产量关系的研究有助于了解Ｎｉｓｉｎ生物合成的途径和调控方式［１２］。

２．３发酵产物的提取工艺
２．３．１有机溶剂法利用正丙醇作为主要的溶剂，因此也称正丙醇法。

它利用正丙醇、丙酮、乙酸等有机溶剂沉淀Ｎｉｓｉｎ，利用ＫＨ２ＰＯ４等进行盐析［１３］，反复沉淀、溶解的过程，是一种经典方法，但其缺点是回收率低，回收产物活性低。

１９６０年Ｈａｗｌｅｙ等用一种简单的方法提取Ｎｉｓｉｎ。

该法是先向发酵液中加入０．１％Ｔｗｅｅｎ－８０，然后从发酵液底部鼓气使产生大量的气泡，Ｎｉｓｉｎ本身具有表面活性剂的性质，因而伴随泡沫被鼓出，收集并破碎泡沫后，用丙酮沉淀，最后将沉淀干燥测活，比活仅为１．４×１０６ＩＵ／ｇ。

与正丙醇法相比鼓气吹泡法较容易形成规模化生产，操作简单，试剂消耗量少，但产品纯度低，回收率也不理想。

２．３．２吸附法随着对乳链菌肽分子性质的研究，科研工作者发现产Ｎｉｓｉｎ的乳酸菌对Ｎｉｓｉｎ具有一定的吸附作用［１４］。

１９７１年Ｂａｉｌｅｙ等利用Ｎｉｓｉｎ与菌体吸附特性先回收菌体，然后再获取Ｎｉｓｉｎ提取液，再将其经过柱层析纯化Ｎｉｓｉｎ。

１９９２年Ｙａｎｇ等对菌体吸附法的吸附及解吸附条件作了进一步研究［１５］，发现如果对吸附及解吸附选择合适的ｐＨ，无需破碎菌体就可大量提取回收Ｎｉｓｉｎ。

其结果是最佳吸附ｐＨ为６．５，而解吸附最佳ｐＨ为２．５。

１９９６年Ｊａｓｏｎ等通过对Ｎｉｓｉｎ与菌体吸附的深入研究，大胆地提出了一种设想，就是利用菌体对Ｎｉｓｉｎ在高ｐＨ吸附、低ｐＨ解吸附的特性，构建一种固定化细胞柱，将含Ｎｉｓｉｎ的粗品通过固定化细胞，Ｎｉｓｉｎ就被吸附从而达到分离浓缩的目的。

另一种吸附法是应用一些吸附剂在合适条件下
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使其与Ｎｉｓｉｎ吸附以达到提取纯化的目的。

吸附剂包括硅酸、二氧化钛、硅化合物（硅酸钙、二氧化硅、硅藻土等）。

２．３．３
柱层析法
现在应用于分离纯化Ｎｉｓｉｎ的介质
较多，并且均可达到纯化的目的，但是由于所选前处理的方法不同，使得需要过柱的数目也不同［１６］。

１９９５年我国山东大学刘稳等应用中空纤维超滤、非极性大孔网状吸附树脂ＸＡＤ－２层析、ＣＭ－ＳｅｐｈａｄｅｘＣ－２５层析和ＳｅｐｈａｄｅｘＣ－５０分子筛层析等步骤纯化Ｎｉｓｉｎ，分析其纯度不低于９５％，比活为２．６×１０７ＩＵ／ｇ，总回收率为２０．６％。

１９９５年Ｒｏｄ－ｒｉｇｕｅｚ等采用Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ介质纯化Ｎｉｓｉｎ，该法的预处理是用（ＮＨ４）２ＳＯ４沉淀浓缩Ｎｉｓｉｎ，然后依次通过Ｓｐ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ柱层析、Ｏｃｔｙｌ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣｌ－４Ｂ柱层析及ＰｅｐＲｐｃＨＲ５／５Ｃ２／Ｃ１８反向柱层析等步骤纯化Ｎｉｓｉｎ［１７］。

１９９６年陈秀珠等应用正丙醇提取法将Ｎｉｓｉｎ浓缩后再用ＣＭ－ＳｅｐｈａｄｅｘＣ－２５层析一步纯化了Ｎｉｓｉｎ，其比活为３．９９×１０７ＩＵ／ｇ，回收率４１．７％。

１９９７年Ｓｕａｒｅｚ等又将一种传统的层析方法—免疫亲和层析应用分离纯化Ｎｉｓｉｎ并且获得了成功［１８］。

该法是用ＡＤ１０杂交瘤细胞制备Ｎｉｓｉｎ的单克隆抗体，并将其通过Ｎ－羟基琥珀酸亚胺葡聚糖柱，在一定条件下抗体与葡聚糖偶联，然后将Ｎｉｓｉｎ发酵液除菌后进行柱层析。

最终活性回收率可达７２．７％，应用ＲｅＲｐｃＨＲ５／５Ｃ２／Ｃ１８反向柱层析鉴定其纯度与Ｎｉｓｉｎ标准品接近。

这种利用抗体－抗原特异吸附性所设计的免疫亲和层析法纯化Ｎｉｓｉｎ不仅操作过程简单，而且速度快，特异性好，重复性强。

但其缺点是Ｎｉｓｉｎ的单克隆抗体较难获得。

２．４发酵产物的效价检测
Ｎｉｓｉｎ可以抑制Ｇ＋菌的生长，可用微球菌作检测菌，测量其抑菌圈直径。

Ｎｉｓｉｎ在中性溶液中的溶解度远小于其在酸性溶液中的溶解度，这样使得它在琼脂平板中扩散受影响。

虽有一些方法，如用还原酶活性抑制剂、测定牛奶中酸产物的量、或测定ＯＤ值（比浊法）等可以作为衡量Ｎｉｓｉｎ量的标准。

但扩散仍是一个十分重要的技术，特别是当琼脂中加入了１％的Ｔｗｅｅｎ－２０后，有利于扩散，且Ｔｗｅｅｎ－２０的效果比Ｔｗｅｅｎ－８０好。

在０．５～１０ＩＵ／ｍＬ的范围内，浓度的对数和抑菌圈直径呈直线关系［１９］。

依之可作出标准曲线，再将待测样品与之比较，即可求出效价。

测定食品中的效价要去除对照的影响。

近年来，检测培养基又有一些改进，如加入Ｎａ２ＨＰＯ４可消除降低ｐＨ造成的假抑菌圈现象，提高检测灵敏度。

另外，还有一些如反相平板、测ＯＤ２１０吸收等一些用于相关目的的方法的报道。

总之，检测系统的发展趋势是简化检测方法和提高检测灵敏度。

２．５乳酸链球菌素的应用
２．５．１乳酸链球菌素在食品工业中的应用Ｎｉｓｉｎ是由牛乳和乳酪中自然存在的乳酸链球菌发酵产生的，由于牛乳等乳制品在过去几个世纪一直被人和动物直接摄取，可以说明它具有无毒的特点，它在人体的消化道内很快被酶分解，其急性毒性、亚急性毒性及慢性毒性实验均已证明，Ｎｉｓｉｎ对动物无任何毒副作用［２０］。

目前Ｎｉｓｉｎ已广泛用于乳制品、肉制品、蔬菜制品、罐装食品、植物蛋白等食品的防腐保鲜中。

２．５．２乳酸链球菌素在医药工业中的应用乳酸菌素能有效地抑制某些病原菌的生长，为其在医药工业中的应用奠定了基础。

近年来乳酸菌素的医药价值已开始引起人们的关注。

Ｎｉｓｉｎ在微生物之间不存在交叉抗性，因此有抗生素的治疗作用。

它不同于其它抗生素，细菌不会对其产生抗性，比抗生素对细菌更有效，且用量也要小得多。

本世纪初人们已经知道利用乳酸菌杀死肠道内的有害微生物，改变肠道微环境，并推出了治疗便秘、痢疾和伤寒的商品菌株Ｍｕｔａｆｌｏｒ。

研究发现，Ｎｉｓｉｎ可用于治疗胃和十二指肠溃疡、口腔溃疡、皮肤病、结核病及由链球菌、葡萄球菌引起的牛乳腺炎。

目前研究者正在研究Ｎｉｓｉｎ是如何精确地与细菌结合并杀死细菌，以便能制造出对人体安全的药物。

３乳酸链球菌素的发展前景
随着人们生活水平的提高，健康食品、绿色食品的概念越来越被人们接受，对高效、无毒的天然防腐剂的研究和应用也越来越引起人们的重视。

Ｎｉｓｉｎ作为一种高效、无毒的天然食品添加剂符合未来食品防腐剂的要求，不仅有较好的防腐抑菌作用，而且能减弱热处理强度，降低加工成本，改善食品风味、外观和营养价值。

目前人们在Ｎｉｓｉｎ的合成、作用机理以及应用方面做了一些工作，也取得一定的成绩，但仍然还有许多未知数，包括微生物是否死亡、残存、适应环境以及它的机体内发生了什么生理分子反应机制而导致了这些现象。

宏观的生物学能参数，微观生物学能参数以及分子在应激反应中的反应仍是有待研究的课题。

我国乳酸菌资源丰富，但对乳酸菌素的研究起步较晚，需要大力进行乳酸菌素的基础研究和开发应用研究，为乳酸菌素的生产应用奠定基础。

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中国国家工商行政管理总局局长王众孚２００５年１２月１５日说，２００６年的食品安全专项整治中，要继续把奶制品作为重点产品，严肃查处销售不合格液态奶以及掺杂使假等违法行为。

王众孚在２００５年１２月１５日召开的全国工商行政管理工作会议上说，２００６年还将采取三大措施，保障食品安全。

———以城市社区、农村和城乡结合部为重点，开展重点区域执法检查，重点解决无照经营和制售假冒伪劣食品问题。

———
以商场、超市、集贸市场和批发市场为重点开展检查，重点解决经营者进货验证验票、不合格食品退市等问题，引导和监督经营者切实对消费者和食品安全负责。

———以五一、十一、中秋、元旦、春节为重点，开展节日食品市场专项执法检查，重点解决销售有毒有害和不合格节日食品问题，确保节日消费安全。

（张侃）
不合格奶制品将成为中国明年食品安全查处重点
根据本刊的编排计划和配合食品行业各专业学科的行动安排，《食品科技》准备在２００６年１０月编辑出版食品配料论文集，内容包含国家关于食品配料与添加剂方面的最新要求、食品配料及添加剂产业发展趋势、食品配料新资源、食品配料加工新工艺、新技术、新装备、营养强化、配料与添加剂的安全使用，国外相关技术的介绍、相关企业的介绍与宣传等。

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