定量PCR基本原理及方法

R
3’
3’
3’
5’
QQQ
Q
5’
分子信标（Molecular Beacon Probe）
R ExcitatEiomnission Q
Excitation
荧光共振能量传递（FRET Probe）
Oligo 1: Fluorescein Excitation
Transfer
Oligo 2: LC Red 640 Emission
Slope -3.322
100%efficienc y
阈值（threshold）的设定
阈值：PCR扩增信号进入相对稳定的 对数增长期时的荧光值。
Ct值——n：扩增循环数
PCR循环在到达Ct值所在的循环数时 ，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期 ），此时微小误差尚未放大，因此Ct值 的重现性极好，即同一模板不同时间扩 增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct 值是恒定的。
基因型分析（SNP、突变型分析） Taqman, Molecular Beacon, FRET, LC Green
绝对定量
某 科 研 用 户 使 用 Rotor-Gene 3000 进 行 基 因 表 达 检 测 结 果
（自备标准品，检测样品做复管）
相对定量
某科研用户使用Rotor-Gene 3000进行基因表达相对定量分析，下图为用 ∆∆Ctwenku.baidu.com得出的分析结果 。（自备标准品，检测样品做3次重复复管）
73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 8d7eg. 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 deg.
AnAnnenaelainligngata6t 06℃3℃
➢ 标记方法
Taqman 定量分析，基因型分析
Sybr-Green 定量分析，熔解曲线分析，基因型分析 (LC Green)
三．荧光定量PCR不同方法学的应用
➢ 研究目的 ➢ 标记方法
➢ 研究目的
定量分析（基因拷贝数的绝对定量，基因表达调控的相对定量） Sybr-Green (LC Green), Taqman, Molecular Beacon, etc
熔解曲线分析 Sybr-Green, LC Green, Molecular Beacon, FRET
Molecular Beacon 定量分析，熔解曲线分析，基因型分析
FRET 定量分析，熔解曲线分析，基因型分析
Ampliflour Probe，LUX 定量分析
➢ 基因型分析
利用扩增信号的种类来分型 —— Taqman 根据熔解曲线的不同来分型 —— FRET, Molecular Beacon
内掺式染料 SYBR-Green I
Excitation
5’
3’
SG
Emission
SG
SG
3’
SG
5’
SG
内掺式染料 SYBR-Green I
Excitation
SG
5’
3’
SG SG SG
Emission
3’ 5’
SG
双标记探针（Taqman Probe）
5’
5’
3’
Excitation Excitation
定量PCR基本原理及方法
基因有限公司 黄妤
内容
一． 荧光定量PCR基本原理 二． 荧光定量PCR标记方法 三． 荧光定量PCR不同方法学的应用
一．荧光定量PCR基本原理
➢ 定量PCR技术的产生 EB 1992年由Higuchi等人第一次报告：使用 加入PCR反应体系，经改装
的带有冷CCD的PCR仪检测样品的荧光强度 核酸 ↔ 染料荧光 后来用与双链DNA有更强结合力的SYBR Green I取代EB
➢ 荧光定量PCR的定量原理
RePaCl-Rti的m理e论C方he程m：isYt=rxie×s(1+ Ev)n
Y：扩增物数量； X ：起始模板数量；Ev：扩增效率；n：扩增循环数
1. 终点法定量原理 前提：在最佳实验、循环次数n一定、Ev相同 原理：根据扩增产物的量计数反应物中原始分子数，即： lnx=lnY-n×ln(1+Ev)=lnY - b (b为常数)
标准曲线 • 由系列稀释的已知浓度的样品做标准曲线 • 计算待测样品的初始模板浓度
log N0 =-Ct logE+logN
二．荧光定量 PCR 标记方法
内掺式染料 序列特异性探针
引物特异性探针
SYBR Green I, LC Green Taqman Molecular Beacons FRET Amplifluor (Intergen) LUX
2. 实时检测法定量原理 前提：在最佳实验、相同Ev以、扩增产物量相同 原理：反应物中原始分子数（X）与其所需要的扩增循环次数（n）成反比， 由此计算出标本中靶分子的准确含量，即： LgX=LgY–n×Lg(1+Ev)=b - n×a (a、b为常数)
✓ n: 扩增循环数的确定
PCR efficiency =[10(-1/slope)]-1 Where slope=1/m
✓ Ct值与起始模板的关系
logN=log N0 +nlogE n=Ct 每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。利用已知起始拷贝数 的标准品作出标准曲线，根据未知样品的Ct值，即可计算出该样品的起始拷贝数。
Y轴—Ct值
X—起始拷贝数的对数
✓ 绝对定量——未知浓度的样品与标准曲线相比较
HouseKeeper Gene
Gene of Interest
熔解曲线分析 利用溶解曲线进行实验条件的优化（RG3000）
dF/dT dF/dT
.35 1.2
1.1
Bin A
.3
Bin A
1
.9
Bin B
.25
.8
.7 .2
.6
.15 .5
.4 .1 .3
.2 .05
.1
0 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100
LC Green
利用扩增信号的种类来分型
双Taqman探针法检测野生型和突变型
在基因型分析中，可采用两种不同的Taqman探针（分别针对野生型和突变型)，即一个突 变型探针以一种荧光素（Flr）标记，而野生型探针则用不同的荧光物（Tet）标记。如果只有 一种信号被扩增出来，则样本为对应的基因型（野生型或突变型）的纯合子；如二者都被有效 地扩增出来，则样本为杂合型。