定量PCR基本原理及方法
荧光定量 pcr 的基本原理和步骤
荧光定量PCR的基本原理和步骤
荧光定量PCR（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）是一种常用的分子生物学技术，可以用于检测和定量DNA或RNA分子。
其基本原理是在PCR过程中加入荧光探针，通过监测荧光信号的强度来定量PCR产物的数量。
下面是荧光定量PCR的基本步骤：
1. 样品处理：首先需要从待检测样品中提取DNA或RNA，并进行适当的处理，例如反转录、扩增等。
2. 设计引物：根据待检测的目标序列设计特异性引物。
3. PCR反应体系的制备：将引物、荧光探针、dNTPs、PCR缓冲液等混合，制备PCR反应体系。
4. PCR反应：将样品DNA或RNA与PCR反应体系混合，进行PCR反应。
5. 荧光定量：在PCR反应过程中，荧光探针会结合到目标序列上，并通过荧光信号的产生来检测PCR产物的数量。
在荧光定量PCR中，通常采用SYBR Green或TaqMan探针来检测PCR产物的数量。
6. 数据分析：通过对荧光信号的强度进行分析，计算出样品中目标序列的数量，并进行比较和分析。
需要注意的是，在荧光定量PCR中，需要选择合适的荧光探针和荧光信号检测系统，以确保准确和可靠的结果。
此
外，为了避免PCR过程中的污染和误差，需要严格控制PCR 反应条件和操作流程。
定量pcr的方法
定量pcr的方法定量聚合酶链反应（Quantitative Polymerase Chain Reaction，qPCR）是一种在实验室中常用的分子生物学技术，旨在定量测定DNA或RNA分子的相对丰度。
本文将详细介绍定量PCR的原理、操作步骤以及应用领域。
一、定量PCR的原理定量PCR的原理基于聚合酶链反应（PCR）技术，该技术通过复制模板DNA 或RNA分子的特定片段来实现特异性扩增，从而产生大量复制产物。
在定量PCR 中，引入一种特定的荧光探针，该荧光探针与扩增产物结合，并在每个扩增周期的末端释放荧光信号。
荧光信号的数量与初始模板分子量成正比，因此可以通过测量荧光信号的强度来定量PCR产物中的特定DNA或RNA分子序列的相对丰度。
二、定量PCR的操作步骤1. 制备PCR反应体系：将反应缓冲液、模板DNA或RNA、引物、荧光探针、聚合酶、核苷酸和水混合制备反应体系。
反应体系中的核苷酸是用来提供DNA 或RNA的基本成分。
2. 热循环条件设置：选择合适的PCR仪，并设置合适的热循环条件。
热循环的三个步骤包括变性、退火和扩增。
3. 变性步骤：将反应体系加热至高温，通常为94-98，使DNA或RNA解性，即DNA双链分离，RNA变性为单链，使模板分子可供扩增。
4. 退火步骤：降低温度到引物特异性结合的温度，引物会与模板分子特异性结合，这通常在50-65之间进行。
5. 扩增步骤：将退火的反应体系加热至合适的温度，通常为72，此时聚合酶开始合成新的DNA链，延伸引物。
该步骤重复多次，每次扩增会产生两倍数量的DNA或RNA分子。
6. 荧光检测：在PCR反应进行过程中，荧光探针会与扩增产物结合，并在每个扩增周期的末端释放荧光信号。
荧光信号的强度与扩增产品的数量成正比。
7. 数据分析：使用特定的软件来分析荧光信号数据，将其转化为反应物的初始模板浓度。
可以通过比较不同样本的荧光信号强度来定量比较DNA或RNA的相对丰度。
荧光定量pcr的原理方法
荧光定量pcr的原理方法
荧光定量PCR（Fluorescent Quantitative PCR，qPCR）是一种用荧光信号量化检测PCR产物的方法，用于定量分析目标DNA或RNA的含量。
荧光定量PCR的基本原理如下：
1.引物设计：设计特异性引物，使其能够特异性地扩增目标DNA或RNA序列。
2.模板DNA或RNA的提取：从样品中提取目标DNA或RNA。
3.cDNA合成：对于RNA样品，需要首先将RNA反转录成cDNA，作为PCR 的模板。
4.Real-time PCR扩增反应：将模板DNA或cDNA与引物和荧光探针一起加入PCR反应体系中，进行实时PCR扩增。
PCR反应体系中还包括核苷酸，聚合酶和缓冲液等。
5.荧光信号检测：随着PCR的进行，荧光探针被解旋成单链，释放出与之配对的荧光染料。
荧光染料产生荧光信号，信号强度与扩增产物的数量成正比。
6.荧光信号检测系统：荧光信号检测系统实时检测PCR反应体系中的荧光信号，并将其转换成数值。
7.标准曲线绘制：通过使用已知浓度的标准品进行一系列稀释，绘制出标准曲线。
标准曲线将荧光信号强度与目标DNA或RNA的初始浓度之间建立了一个标准关系。
8.样品定量：通过对样品的荧光信号强度进行测量，并使用标准曲线进行插值计算，确定样品中目标DNA或RNA的初始浓度。
荧光定量PCR具有高灵敏度、高特异性、宽动态范围、低检测限和快速分析等优点，广泛应用于分子生物学和疾病诊断等领域。
1、试述荧光定量pcr技术的原理、方法、注意事项及其在临床与科研中的应用
1、试述荧光定量pcr技术的原理、方法、注意事项及其在临床与科研中的应用
荧光定量PCR是一种在PCR反应过程中，通过荧光信号的检测来对PCR产物进行实时定量分析的技术。
1. 原理：
荧光定量PCR利用荧光染料或者荧光探针，标记扩增过程中的每一个循环的产物，这些荧光标记的产物在激发光的作用下会发出荧光。
随着反应的进行，PCR产物不断累积，荧光信号也随之增强。
通过对荧光信号的实时监测，可以推断出样本中起始模板的数量。
2. 方法：
主要方法包括探针法、SYBR Green I染料法和分子信标法等。
探针法使用与目标序列特异性结合的荧光探针来标记PCR产物。
SYBR Green I染料法则是利用染料与双链DNA的结合特性，将染料添加到反应体系中，随着PCR产物的增加，染料的荧光信号也增强。
3. 注意事项：
荧光定量PCR对样品纯度要求较高，应避免杂质的干扰。
反应体系中的成分和浓度需要精确控制，以确保实验结果的准确性。
荧光定量PCR的结果解读需要参考标准曲线，以确定未知样本中的目标序列数量。
4. 在临床与科研中的应用：
在临床应用中，荧光定量PCR被广泛用于病原体检测、基因突变分析、遗传病诊断以及癌症研究等。
例如，用于检测病毒如HIV、HBV等的载量，或者检测癌症相关基因的表达水平。
在科研领域，荧光定量PCR可用于基因表达分析、基因组学和表观遗传学研究中。
例如，比较不同组织或细胞类型的基因表达差异，或者研究表观遗传修饰对基因表达的影响。
总的来说，荧光定量PCR技术是一种高灵敏度、高特异性的核酸定量分析方法，对于临床诊断和科学研究具有重要意义。
定量PCR 简介
定量PCR简介聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）是微量核酸扩增的有效工具，由于其灵敏、特异、快速等优点，在医学上已广泛应用与病毒、细菌病原体及遗传病、肿瘤的早期诊断。
随着PCR技术的发展，特别是病毒或肿瘤的治疗监测、疾病的诊断、机体基因表达调控方面，不仅需要检测其存在是否；而且还需要得知扩增前标本中的模板的数量，因而必须对PCR进行定量检测，即定量PCR技术，本文将对定量PCR的定量原理、技术类型以及相关进展方面综述如下：一、定量PCR的基本原理：在PCR实验条件下（Mg++、缓冲液、Taq酶、dNTP、引物、模板），经变性→退火→延伸的一个循环，引物在退火阶段与相应的模板结合，在延伸阶段进行复制，此时产物为：Yn=Yn-1×(1+Ev) ,Yn:n个PCR循环后PCR产物的分子数；Yn-1:为n-1个热循环后PCR产物的分子数；Ev:为扩增效率,0≤Ev≤1；若n个热循环中其Ev是一致的话，经n个循环后的扩增产物的分子数（Y）和反应物中原始分子数（X）之间关系，可描述为：Y=x×(1+ Ev)n。
1. 终点法定量原理：在最佳实验、循环次数n一定、Ev相同的前提下，根据扩增产物的量可以计数出反应物中原始分子数，若核酸提取效率相同（与标准品），进而计算出标本中靶分子的准确含量，即：lnx=lnY-n×ln(1+Ev)=lnY - b (b为常数)2. 实时检测法定量原理：在最佳实验、相同Ev以及相同扩增产物的情况下，反应物中原始分子数（X）与其所需要的扩增循环次数（n）成反比，若核酸提取效率相同（与标准品），进而计算出标本中靶分子的准确含量，即：LgX=LgY–n×Lg(1+Ev)=b - n×a (a、b为常数)3. 扩增效率（Ev）的影响因素：以上所述的定量原理均假定反应体系中扩增效率是不变，但是，实际上，Ev在不同的扩增管之间和同一扩增管的不同循环次数之间是不同，如何控制及解决Ev的变异以及标本制备的可靠性是PCR定量的可靠性所在，也是定量PCR的发展方向，那么，Ev的影响因素有：a. 引物和靶序列的结合能力（G+C%及突变），扩增产物的长度，G+C含量。
PCR定量方法概述
PCR定量方法概述PCR（聚合酶链式反应）是一种广泛应用于分子生物学研究中的技术，可通过扩增特定DNA片段数量来进行定量分析。
PCR定量方法的发展使得我们能够更加准确、快速地测量和定量目标DNA序列或基因表达水平。
本文将概述PCR定量方法的原理、步骤和应用。
一、PCR定量方法的原理PCR定量方法是基于PCR技术的扩增效率与起始模板浓度成正比的原理。
在PCR反应中，模板DNA以指数级倍增，而每个PCR周期后，扩增效率会逐渐降低。
通过确定PCR周期数和目标序列浓度之间的关系，可以利用定标曲线或计算方法来定量目标DNA的起始浓度。
二、PCR定量方法的步骤1. DNA提取：从样本（如细胞、组织或血液）中提取DNA，并纯化得到高质量的模板DNA。
2. 靶序列选择：根据需要定量的目标序列，设计引物和探针，保证其特异性和高效性。
3. PCR反应设置：根据目标序列的长度和特性，确定PCR反应体系中的引物和探针的浓度，优化反应条件（如温度和时间）。
4. 制备标准曲线：通过系列稀释的已知浓度的标准品，构建定标曲线，用于后续定量计算。
5. PCR扩增：将模板DNA与引物和探针加入PCR反应体系中，进行一系列PCR循环，扩增目标序列。
6. 实时监测：利用实时荧光PCR仪或其他检测方法，监测PCR反应过程中探针的荧光信号强度。
7. 数据分析：根据定标曲线和荧光信号强度，计算出目标DNA的起始浓度。
三、PCR定量方法的应用1. 基因表达分析：通过比较不同样品中目标基因的表达水平，研究基因在生理和病理过程中的变化。
2. 病原体检测：定量PCR可用于检测和定量病原体DNA，用于快速诊断与预后评估。
3. 肿瘤检测：通过定量PCR检测肿瘤标志物，提供肿瘤早期诊断和治疗效果监测。
4. 遗传病筛查：利用PCR定量方法可以检测和定量与遗传病相关的突变或多态性位点。
5. GMO检测：定量PCR可用于识别和量化转基因生物的成分和含量。
6. 受精能力评估：通过检测精子和卵子中特定基因的数量，评估生殖健康和受精能力。
1定量PCR基本原理
1定量PCR基本原理定量PCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction）是一种用于检测和测量DNA或RNA分子数量的分子生物学技术。
它是常用的基因表达和检测技术。
以下是定量PCR的基本原理。
定量PCR的基本原理可以分为三个主要步骤：扩增反应、检测荧光信号和标准曲线计算。
第一步是扩增反应。
PCR反应通常在一个热循环中进行，每个循环包括三个步骤：变性、退火和延伸。
变性步骤通过高温将DNA双链分离成两条单链。
然后，在退火步骤中，引物通过与目标DNA序列特异性碱基配对，使其结合到模板DNA上。
最后，在延伸步骤中，DNA聚合酶将新的DNA链合成为与模板DNA相匹配的互补链。
这个循环过程被重复多次，每个循环使得目标序列的数量翻倍，从而进一步扩增目标DNA序列。
第二步是检测荧光信号。
PCR反应中通常会引入一个特定的探针或染料，其结构包括与目标DNA序列特异性结合的引物，并带有一个发光染料和一个参考染料。
扩增反应进行时，DNA聚合酶会催化探针与模板DNA结合，并释放出发光信号。
发光信号的强度与目标DNA序列的数量成正比。
参考染料发出的信号用于校正可能因扩增反应条件变化而引起的信号差异。
第三步是用标准曲线计算目标序列的数量。
标准曲线是通过基于已知浓度的一系列标准样品构建的。
这些标准样品包含与待测样品相同的目标序列，但其浓度已知。
将标准曲线上的荧光信号强度与标准样品的浓度进行比较，可以建立一个线性关系模型。
然后，通过将待测样品的荧光信号强度与标准曲线进行比较，可以计算出待测样品中目标序列的初始浓度。
定量PCR的结果可以用于不同的应用，如基因表达研究、病原体检测、遗传病诊断等。
通过定量PCR，可以准确测量目标序列的数量，并比较不同样品之间的差异。
总结一下，定量PCR通过扩增反应、检测荧光信号和标准曲线计算三个主要步骤来定量测量DNA或RNA分子的数量。
这种技术在许多生物学研究和医学诊断中发挥着重要作用。
定量PCR基本原理及方法-PPT精品文档
成反比，由此计算出标本中靶分子的准确含量，即：
LgX=LgY–n×Lg(1+Ev)=b - n×a (a、b为常数)
Ampliflour Probe，LUX
定量分析
基因型分析
利用扩增信号的种类来分型 —— Taqman
根据熔解曲线的不同来分型 —— FRET, Molecular Beacon LC Green
利用扩增信号的种类来分型 双Taqman探针法检测野生型和突变型
在基因型分析中，可采用两种不同的Taqman探针（分别针对野生型和突变型)，即一个突 变型探针以一种荧光素（Flr）标记，而野生型探针则用不同的荧光物（Tet）标记。如果只有 一种信号被扩增出来，则样本为对应的基因型（野生型或突变型）的纯合子；如二者都被有效 地扩增出来，则样本为杂合型。
后来用与双链DNA有更强结合力的SYBR Green I取代EB
荧光定量PCR的定量原理
PCR的理论方程： Y=x×(1+ Ev)n Real-time Chemistries
Y：扩增物数量； X ：起始模板数量；Ev：扩增效率；n：扩增循环数
1. 终点法定量原理
前提：在最佳实验、循环次数n一定、Ev相同
定量PCR基本原理及方法
基因有限公司 黄妤
内 容
一． 荧光定量PCR基本原理 二． 荧光定量PCR标记方法 三． 荧光定量PCR不同方法学的应用
一．荧光定量PCR基本原理
1定量PCR基本原理
1定量PCR基本原理定量PCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction）是一种利用DNA复制技术进行定量测定DNA数量的方法。
它是PCR技术的一种改进，在遗传学、疾病诊断、药物研发等领域有广泛应用。
以下是定量PCR的基本原理的详细介绍：1.反应体系组成：定量PCR所需的反应体系包括DNA模板、引物、荧光探针、聚合酶、缓冲液、dNTPs和MgCl2等组分。
DNA模板是待测DNA的起始材料，引物是用于扩增特定DNA片段的寡核苷酸引物，荧光探针则会结合到PCR产物上生成荧光信号用于检测和计量。
2.PCR扩增步骤：定量PCR扩增过程包括三个主要步骤：变性、退火和延伸。
首先，将反应体系加热至95°C，使DNA双链解开变性为两条单链。
然后，将温度降低至特定的温度，使引物能够与DNA靶序列结合。
引物结合后，聚合酶开始在两条单链DNA上合成新的DNA链。
这一过程称为延伸。
随着循环的进行，PCR产物的数量呈指数增加。
3.荧光信号检测：定量PCR中使用特定的荧光探针来检测扩增产物的数量。
这些荧光探针一般由两个部分组成：探针序列和荧光染料。
探针序列与待测DNA的靶序列互补配对，而荧光染料则位于探针的末端。
在PCR过程中，引物扩增到接近探针的位置时，3'末端荧光染料会与5'末端的荧光信号发生共振能量转移（FRET），从而发出荧光信号。
通过测量这些信号的强度，可以推断PCR产物的数量。
4.标准曲线和计量：为了进行定量测定，标准曲线是必不可少的。
标准曲线是一系列已知浓度的标准品所构建的，通过对标准品进行PCR扩增并测量荧光信号的强度，可以建立起PCR产物浓度与荧光强度之间的关系。
通过测量待测样品的荧光强度，并根据标准曲线进行插值计算，可以得出待测样品中特定DNA序列的浓度。
5.分析和解释结果：定量PCR的结果可以通过多种途径进行分析。
一种常见的方法是计算待测样品和标准样品之间的CT值差，通过该差值来比较两者的浓度。
定量PCR基本原理及方法
✓ Ct值与起始模板的关系
logN=log N0 +nlogE n=Ct 每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。利用已知起始拷贝数 的标准品作出标准曲线，根据未知样品的Ct值，即可计算出该样品的起始拷贝数。
Y轴—Ct值
6
X—起始拷贝数的对数
✓ 绝对定量——未知浓度的样品与标准曲线相比较
Excitation
R
3’
11
3’
3’
5’
QQQ
Q
5’
分子信标（Molecular Beacon Probe）
R ExcitatEiomnission Q
Excitation
12
荧光共振能量传递（FRET Probe）
Oligo 1: Fluorescein Excitation
Transfer
野生型 突变型 杂合型
21
利用熔解曲线检测基因突变 FRET探针进行熔解曲线分析确定基因型
FRET探针与模板结合时，因共振能量的传递而信号增强，而当在Tm 值时， FRET探针与PCR产物分开，荧光信号减弱。通过实时捕捉到的PCR产物在熔解过程 中荧光信号的变化，得到PCR产物的熔解曲线。因为发生基因突变的PCR产物有特定 的Tm 值，通过测定探针与PCR产物分开时的熔解温度Tm值，就能确定样品的基因型。
8
内掺式染料 SYBR-Green I
Excitation
5’
3’
SG
Emission
SG
SG
3’
SG
5’
SG
9
内掺式染料 SYBR-Green I
Excitation
SG
5’
3’
pcr定量实验方案
PCR定量实验方案实验目的本实验旨在通过聚合酶链式反应（PCR）定量检测目标DNA的数量。
通过PCR 定量实验，可以快速、准确地确定目标DNA的含量，为后续实验提供数据支持。
实验原理PCR定量实验基于聚合酶链式反应的基本原理，通过反复复制目标DNA序列，使其数量呈指数增加，并通过荧光信号在PCR循环的各个阶段实时监测目标DNA的增长情况。
荧光信号的强度与目标DNA的初始量成正比，从而可以定量测量目标DNA的数量。
实验步骤1.样本处理：–收集待检测样本，并提取目标DNA。
–使用核酸定量仪检测目标DNA的浓度，并计算出适当的稀释倍数。
–将目标DNA按照所需的浓度稀释，并制备出一系列不同浓度的DNA标准曲线样品。
2.PCR反应体系准备：–准备PCR反应混合液，包括模板DNA、引物、荧光探针、酶和缓冲液等。
–按照所需的PCR反应体系，按比例向反应管中加入相应的试剂，确保反应混合液的配制准确。
3.反应条件设置：–设置PCR反应的温度和时间参数，包括初始变性、循环变性、退火和延伸等步骤。
–根据目标序列的特性和引物设计，调整PCR反应的温度梯度、循环次数等参数，以实现最佳放大效果。
4.PCR反应实施：–将PCR反应混合液分装到反应管中，注意避免产生交叉污染。
–将反应管放入PCR仪中，按照设定的温度和时间参数运行PCR反应。
–实时监测PCR反应过程中荧光信号的强度变化，记录关键点的荧光信号值。
5.数据分析：–将PCR反应过程中记录的荧光信号值绘制成实时荧光曲线图。
–根据所制备的DNA标准曲线样品，通过荧光信号值反推目标DNA的初始量。
–根据目标DNA的初始量和稀释倍数，计算样本中目标DNA 的浓度。
实验注意事项1.实验操作前，准备好PCR反应所需的所有试剂和设备，并保持反应管和工作台的清洁。
2.操作过程中，注意避免产生交叉污染，尤其是在样本处理和PCR反应准备阶段。
3.严格按照PCR反应体系准备说明书中的比例和操作要求进行试剂的配制和混合。
定量PCR基本原理
定量PCR基本原理定量PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种用于测定DNA样品中特定序列的数量的技术。
它是通过扩增目标DNA序列并将其与已知浓度的标准样品进行比较来实现的。
以下是定量PCR的基本原理。
1.反应组分准备：在定量PCR中，需要准备一系列的反应组分，包括DNA模板、引物、酶和缓冲液。
引物是专门设计用于扩增目标序列的短片段DNA，它们会在PCR反应中与DNA模板结合并使其扩增。
酶是一种聚合酶，用于将单链DNA合成为双链DNA。
缓冲液用于提供适当的pH和离子浓度，以维持PCR反应的稳定性。
2.PCR反应步骤：定量PCR通常包括三个主要的温度周期：变性、退火和扩增。
-变性：在初始变性步骤中，PCR反应体系中的DNA双链会被加热至95-98°C，使其解离为两条单链DNA。
这个步骤一般持续数秒至数分钟。
-退火：在退火步骤中，PCR反应体系中的温度会降低至45-68°C，这样引物就可以与DNA模板结合起来。
引物将寻找目标DNA序列中的互补序列，并结合在其上。
这个步骤一般持续数秒至数分钟。
-扩增：在扩增步骤中，PCR反应体系中的温度会升高至64-72°C。
聚合酶会结合到DNA模板上，并在引物指导下合成新的DNA链。
这个步骤一般持续数分钟至数小时。
3. 反应过程监测：定量PCR通常通过监测反应过程中累积的产物数量来确定目标序列的浓度。
有多种检测方法可供选择，包括荧光探针、SYBR Green染料和分子质量测定。
-荧光探针：荧光探针是由一个荧光染料和一个荧光猝灭器构成的DNA探针。
当荧光探针与目标序列结合时，它会在PCR反应中被降解并释放出荧光信号。
通过监测荧光信号的强度，可以确定目标序列的浓度。
- SYBR Green染料：SYBR Green是一种荧光染料，它可以结合到所有双链DNA上。
当SYBR Green与扩增产物结合时，它会发出荧光信号。
定量pcr原理
定量pcr原理定量PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种利用DNA聚合酶链式反应技术量化检测目标DNA数量的方法。
该方法基于DNA的反链合成原理，通过多次反复复制目标DNA序列，将其扩增到可检测范围。
定量PCR主要包括准备试剂、反应体系的构建、PCR扩增条件的优化和PCR产物的检测四个步骤。
首先，准备试剂包括模板DNA、引物（前向引物和反向引物）、DNA聚合酶、dNTP（即四种脱氧核苷酸）、缓冲液和MgCl2等。
其次，构建反应体系。
通过将模板DNA、引物、DNA聚合酶、dNTP、缓冲液和MgCl2混合，得到PCR反应液。
引物是特异性序列，可与目标DNA的两个端点互补结合，成为PCR反应的开始和结束点。
然后，优化PCR扩增条件。
这涉及到温度条件和PCR循环数的调整。
PCR反应通常包括三个步骤：变性、退火和延伸。
在变性步骤中，PCR反应液在高温下使目标DNA双链解离为两条单链；在退火步骤中，引物与目标DNA的单链以互补碱基配对的方式结合；在延伸步骤中，DNA聚合酶将dNTP加入到引物的5'端扩增产物的3'端，从而合成一个新的DNA链。
最后，检测PCR产物。
这可以通过凝胶电泳、荧光定量PCR或实时定量PCR等方法进行。
实时定量PCR是一种通过荧光信号实时监测PCR反应进程的方法，可以准确地测量PCR产物的数量。
根据荧光信号的增加，可以定量计算出起始DNA 模板的数量。
总的来说，定量PCR是一种可靠且高敏感的方法，可以准确地测量目标DNA的数量。
它在医学诊断、基因表达研究、遗传学分析等领域具有广泛的应用价值。
定量PCR基本原理
定量PCR基本原理基本原理:定量PCR通过引入一种用于测量PCR反应进程的探针或染料来获取结果。
这些探针或染料具有与目标序列相互作用的特性。
当目标序列被放大并到达一定浓度时，探针或染料与之结合，产生荧光信号。
这个荧光信号的强度与目标序列的数量成正比。
下面是定量PCR的主要步骤:1.反应物准备：反应物主要包括样本DNA或RNA、引物和探针(如果使用)等。
引物是位于目标序列两侧的短DNA寡核苷酸片段，用于定向放大DNA。
探针是一种染料与荧光标记分子结合的DNA片段，用于鉴别和定量检测目标序列。
2.反应体系的配置：根据反应物的需求，将引物、探针、双链DNA模板、dNTPs、酶和缓冲液等组合在一起，形成反应混合物。
3.PCR反应：将反应混合物置于PCR仪中，进行多轮的反应循环。
每一个反应循环包括三个步骤：变性、退火和延伸。
-变性：在高温条件下，双链DNA被解开成两条单链DNA。
-退火：在较低温度下，引物与目标序列的互补部分结合。
-延伸：在适当酶的作用下，引物延伸成为与目标序列相互补的DNA 链。
4.目标序列的定量测量：反应循环完成后，可以通过测量荧光信号的强度来定量PCR反应中的目标序列。
对于使用探针的定量PCR，荧光信号强度与目标序列的拷贝数呈正相关。
探针通常在引物的5'端带有一种荧光染料，并在3'端带有另一种荧光染料。
当探针与目标序列结合时，这两种染料距离变近，导致荧光共振能量转移(FRET)。
这种能量转移的效应会导致双荧光染料之间的荧光信号发生变化，从而提供了目标序列的相对丰度的定量信息。
需要注意的是，为了准确测量目标序列的拷贝数，还需要使用内参基因或标准曲线。
内参基因是一个稳定的基因，它在样本中的拷贝数相对稳定，可以作为PCR反应的参考。
标准曲线是一系列含有已知拷贝数的DNA 标准品，它们在PCR反应中被共同放大，用来建立目标序列拷贝数和荧光信号强度之间的关系。
综上所述，定量PCR是一种基于PCR技术的分子生物学方法，通过测量荧光信号的强度来定量PCR反应中的目标序列。
定量pcr的原理和应用
定量PCR的原理和应用一、定量PCR的概述定量PCR（Quantitative PCR，简称qPCR）是一种用于精确测定DNA或RNA 在样本中的相对或绝对数量的技术。
相比传统的定性PCR，定量PCR能提供更加准确和可靠的分子生物学定量分析结果。
本文将介绍定量PCR的原理、方法和应用。
二、定量PCR的原理定量PCR基于传统PCR技术，通过测量PCR产物的实时累积情况来确定起始模板的数量。
其主要原理包括：1.设计引物和探针：定量PCR需要使用特异性引物和荧光探针来扩增和检测目标序列，引物的设计应考虑碱基配对的特异性和温度互补性。
2.实时检测：在PCR反应过程中，荧光探针与目标序列发生特异性结合，形成荧光信号。
通过实时监测PCR产物的荧光信号强度，可以确定目标序列的起始数量。
3.标准曲线法：定量PCR通常需要构建标准曲线来确定目标序列的起始数量。
标准曲线是由一系列已知起始数量的标准品制备而成，根据标准曲线上的荧光信号强度和已知起始数量的关系，可以推断出未知样本中目标序列的起始数量。
三、定量PCR的步骤定量PCR通常包括以下步骤：1.样本处理：将待测样本中的DNA或RNA提取和纯化，以获得高质量的核酸模板。
2.引物和探针设计：根据目标序列的特异性和相关基因信息，设计引物和荧光探针。
3.PCR反应体系的配置：根据实验需求和PCR仪器要求，配置PCR反应混合液，包括引物、荧光探针、DNA模板和PCR反应缓冲液等。
4.PCR反应条件的设置：确定PCR反应的温度和时间参数，包括退火温度、延伸时间和扩增周期数等。
5.实时荧光监测：将PCR反应体系加载到实时荧光PCR仪中，监测PCR反应过程中荧光信号的强度变化。
6.数据分析：利用实时荧光PCR仪软件对荧光信号数据进行分析，绘制标准曲线和计算目标序列的起始数量。
四、定量PCR的应用定量PCR在生物学研究和临床诊断中具有广泛的应用。
以下是定量PCR的主要应用领域：1.基因表达分析：通过定量PCR可以测定不同组织或细胞中特定基因的表达水平，揭示基因在生物学过程中的功能和调控机制。
定量PCR技术
定量PCR技术目前，用常规PCR技术判断疾病相关基因或病原微生物特异基因存在与否的定性方法已远远不能满足广大医务工作者的需要。
为了获得与疾病诊断、治疗及愈后评估有关的更多更详尽的基因水平的信息，实现对核酸信息的量化分析及比较，定量PCR （QPCR）技术迅速兴起，而且由于其具有特异、快速、敏感、准确定量的优点，已经成为目前分子生物学技术研究的热点之一，不仅在基础医学中得以应用，而且应用于临床医学及其它领域的研究中[113-118]。
一、定量PCR的含意定量PCR旨在评估样本中靶基因的分子数。
用PCR对靶基因定量，是根据一定循环次数后，PCR产物的量来推断样品中原始模板的量。
这种定量可以是绝对的，也可以是相对的。
但由于目前技术上的原因，很难获得样品中某一基因的绝对数量，而往往是通过设置内参标或外参标来作相对的定量。
二、定量PCR的可行性定量PCR是以PCR扩增为基础的，而PCR扩增是有规律可循的。
定量一般是在PC R扩增的指数期进行的。
对于一个给定的待扩增基因片段，其在样品中的起始含量越大，则指数扩增过程越短，当扩增速率趋于稳定后，则无论原来样品中起始模板含量多少，扩增片段的含量通常是一样的。
一般应预先对待测基因片段进行扩增动力学分析以了解其指数增长阶段。
如果用N0代表PCR反应体中的原始模板数，n为扩增次数，N为扩增产物量，那么理想的扩增结果应该是N=N0×2n。
但实际上DNA的每一次复制都不完全，即每一次扩增中，模板不是呈2倍增长。
如果用E代表扩增效率（指每次循环中参与复制的模板与总模板的比率），那么N= N0（1+E）n。
而且E在整个P CR扩增过程中不是固定不变的。
研究表明[30]，当N0在 1-105拷贝之间,循环次数n≤2 0次时，E相对稳定，原始模板以相对固定的指数形式增加，适合定量分析；随着循环次数n的增加（>20次），E值逐渐减少，N呈非固定的指数形式增加，最后进入平台期。
定量PCR技术基本原理和方法以及PCR产物的检测与定量-2
定量PCR技术基本原理和方法以及PCR产物的检测与定量-21、非竞争内标定量PCR从细胞类标本中提取靶基因（核酸）时，同时会提取大量与靶基因无关的DNA或RNA；可以把这些靶基因无关DNA或 RNA作为内标与靶基因同步扩增，即在同样的反应条件下，在一个反应试管内同步扩增来自同一标本的一段靶基因序列和另一段无关的内标序列，不享受同一引物和引物结合位点，内标序列扩增可校正诸如DNA含量、标本内PCR聚合酶抑制物，不同反应管间扩增效率的差异，通过比较两种序列和内标序列的扩增产物即可对靶基因相对定量该方法目前主要用于检测靶基因在体内的含量前后变化，用于疾病的治疗检测。
这种方法应注意靶序列和内标序列的扩增效率差异和初始模板 DNA含量比例关系和循环次数所导致的“平台效应”对结果的影响。
该法的主要优点是简便（不需构建内标品操作），可以消除反应管之间差异和一定程度上消除标本间变异。
2、竞争定量PCR（competitive quantitative PCR）竞争定量PCR是先构建一个与靶基因相同的扩增效率和引物结合位点仅探针结合位点不同的内标，在同一反应管内，靶基因和内标物和引物（primer）竞争性结合，进行同步扩增，由于竞争作用，当一种模板量逐渐增加时，另一种模板的扩增产物相对逐渐减少，但两种扩增产物的比值和两种初始状态时模板分子数的比值是一致的。
根据标准品的准确含量制作标准曲线，从而进行准确核酸定量。
由于内标品构建中特别要求是Ev与靶基因扩增效率一致，如果靶基因序列和内标相同，那么扩增过程中两者的实际扩增效率就接近一致，就可以对靶基因进行绝对定量，即确定样品中靶基因准确分子数，否则只能相对定量，即确定样本间靶基因分子数的差异，总体上说，加入内标物，消除 PCR扩增过程中于反应管和反应管间以及标本之间存在差异。
因此，内标法是目前PCR定量方法中最准确的方法，但构建内标物是建立本方法的关键。
构建内标物的基本原则是内标物具有靶基因的相同扩增条件和相同扩增效率。
定量pcr技术的原理
定量pcr技术的原理
定量PCR技术是一种用于确定DNA数量的方法。
其原理基于聚合酶链反应（PCR），同时结合了荧光探针技术。
定量PCR的关键步骤包括：DNA模板的反应体系制备、荧光
探针设计、扩增曲线分析等。
首先，DNA模板的反应体系制备是定量PCR的基础。
该反应
体系通常包括目标DNA序列、DNA引物、聚合酶、反应缓冲液以及二苯基酚等反应成分。
其中，DNA引物是专门设计的，能够与所需检测的DNA序列互补结合并进行扩增。
聚合酶则
在PCR反应中起到催化DNA模板扩增的作用。
其次，荧光探针设计是定量PCR的关键步骤之一。
荧光探针
通常包括一个荧光染料和一个荧光猝灭剂。
在PCR反应过程中，如果目标DNA序列存在，荧光探针会与目标序列互补结合，并被引物延伸酶切割，导致荧光染料与猝灭剂分离而产生荧光信号。
荧光信号的强度与目标DNA序列的数量成正比。
最后，扩增曲线分析是定量PCR的关键步骤之一。
在PCR过
程中，荧光信号的强度会随着每个PCR循环的进行而增加。
通过测量特定循环数后的荧光信号强度，可以建立标准曲线来确定目标DNA序列的初始数量。
标准曲线中会设置一系列已
知浓度的目标DNA样品作为参照，通过比对测试样品的荧光
信号，可以推算出测试样品中目标DNA序列的初始数量。
综上所述，定量PCR技术利用聚合酶链反应和荧光探针技术，
通过测量PCR反应产生的荧光信号强度，能够准确测定目标DNA序列的数量。
这种技术在生物学研究、分子诊断和环境监测等领域具有广泛的应用。
定量PCR的测定原理和方法
定量PCR的测定原理和方法尽管PCR目前在临床上的应用存在争议，由于试剂，设备以及人员素质等原因其结果也不尽如人意，但作为分子生物学基本技术之一，究其技术本身是成熟的。
多年以来PCR技术只作为一种高灵敏的定性技术而被应用，既制约了PCR质量控制的建立，又大大制约了PCR技术的应用，近年来定量PCR的出现为PCR的应用开拓了广阔的前景。
原理：经典PCR一般分为扩增和检测两个阶段,常用溴乙锭染色,凝胶电泳为定性检测手段。
由于定性实际上就是定量的一种粗约表现，因此只要对检测手段进行改进就可以实现精确定量。
荧光标记技术是分子生物学最常用的标记技术，荧光染料或荧光标记物与扩增产物结合后，被激发的荧光强度和扩增产物成正比。
而根据扩增原理，扩增是呈指数增长，因此在反应体系和反应条件完全一样下，样本含量应与扩增产物的对数成正比，故在一定的条件下荧光强度和样本含量成正比。
方法1：非特异性染料结合法利用某些荧光素能和双链DNA结合，结合后的产物具有强的荧光效应（如上图）。
当扩增结束后，随温度的降低，DNA复性成为双链荧光素与之结合，经激发产生荧光，测定荧光强度，通过内标或外标法求出因数，可以准确定量。
优点：简单易行，成本较低。
缺点：荧光素的结合非特异，荧光素和引物二聚体等有结合，在低样本浓度时影响大，不能进行突变分析和双色分析。
方法2：杂交探针标记法用荧光素标记在探针上，由探针与靶基因特异性结合成双链而产生荧光效应。
上图所示是杂交探针标记法的一种，用两种荧光素标记两对探针。
其中一种标记于3`端，一种标记于5`端，同时这两种荧光素其中一种所发荧光恰好是另一种的激发光。
当其分散在液体中时，因为距离大，当一种产生的荧光不足以激发另一种的荧光，当与靶基因特异结合后，两者距离很小，故激发出另一种荧光。
优点：减少了非特异性误差，可以进行双色分析和突变分析。
优点：定量PCR可以得出准确的定量结果，改变了PCR只用作微量物定性测定的历史，并可进行动态检测和病程疗效分析。
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FRET 定量分析，熔解曲线分析，基因型分析
Ampliflour Probe，LUX 定量分析
➢ 基因型分析
利用扩增信号的种类来分型 —— Taqman 根据熔解曲线的不同来分型 —— FRET, Molecular Beacon
➢ 荧光定量PCR的定量原理
RePaCl-Rti的m理e论C方he程m：isYt=rxie×s(1+ Ev)n
Y：扩增物数量； X ：起始模板数量；Ev：扩增效率；n：扩增循环数
1. 终点法定量原理 前提：在最佳实验、循环次数n一定、Ev相同 原理：根据扩增产物的量计数反应物中原始分子数，即： lnx=lnY-n×ln(1+Ev)=lnY - b (b为常数)
R
3’
3’
3’
5’
QQQ
Q
5’
分子信标（Molecular Beacon Probe）
R ExcitatEiomnission Q
Excitation
荧光共振能量传递（FRET Probe）
Oligo 1: Fluorescein Excitation
Transfer
Oligo 2: LC Red 640 Emission
2. 实时检测法定量原理 前提：在最佳实验、相同Ev以、扩增产物量相同 原理：反应物中原始分子数（X）与其所需要的扩增循环次数（n）成反比， 由此计算出标本中靶分子的准确含量，即： LgX=LgY–n×Lg(1+Ev)=b - n×a (a、b为常数)
✓ n: 扩增循环数的确定
PCR efficiency =[10(-1/slope)]-1 Where slope=1/m
LC Green
利用扩增信号的种类来分型
双Taqman探针法检测野生型和突变型
在基因型分析中，可采用两种不同的Taqman探针（分别针对野生型和突变型)，即一个突 变型探针以一种荧光素（Flr）标记，而野生型探针则用不同的荧光物（Tet）标记。如果只有 一种信号被扩增出来，则样本为对应的基因型（野生型或突变型）的纯合子；如二者都被有效 地扩增出来，则样本为杂合型。
三．荧光定量PCR不同方法学的应用
➢ 研究目的 ➢ 标记方法
➢ 研究目的
定量分析（基因拷贝数的绝对定量，基因表达调控的相对定量） Sybr-Green (LC Green), Taqman, Molecular Beacon, etc
熔解曲线分析 Sybr-Green, LC Green, Molecular Beacon, FRET
73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 8d7eg. 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 deg.
AnAnnenaelainligngata6t 06℃3℃
➢ 标记方法
Taqman 定量分析，基因型分析
Sybr-Green 定量分析，熔解曲线分析，基因型分析 (LC Green)
基因型分析（SNP、突变型分析） Taqman, Molecular Beacon, FRET, LC Green
绝对定量
某 科 研 用 户 使 用 Rotor-Gene 3000 进 行 基 因 表 达 检 测 结 果
（自备标准品，检测样品做复管）
相对定量
某科研用户使用Rotor-Gene 3000进行基因表达相对定量分析，下图为用 ∆∆Ct法得出的分析结果 。（自备标准品，检测样品做3次重复复管）
内掺式染料 SYBR-Green I
Excitation
5’
3’
SG
Emission
SG
SG
3’
SG
5’
SG
内掺式染料 SYBR-Green I
Excitation
SG
5’
3’
SG SG SG
Emission
3’ 5’
SG
双标记探针（Taqman Probe）
5’
5’
3’
Excitation Excitation
HouseKeeper Gene
Gene of Intቤተ መጻሕፍቲ ባይዱrest
熔解曲线分析 利用溶解曲线进行实验条件的优化（RG3000）
dF/dT dF/dT
.35 1.2
1.1
Bin A
.3
Bin A
1
.9
Bin B
.25
.8
.7 .2
.6
.15 .5
.4 .1 .3
.2 .05
.1
0 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100
✓ Ct值与起始模板的关系
logN=log N0 +nlogE n=Ct 每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。利用已知起始拷贝数 的标准品作出标准曲线，根据未知样品的Ct值，即可计算出该样品的起始拷贝数。
Y轴—Ct值
X—起始拷贝数的对数
✓ 绝对定量——未知浓度的样品与标准曲线相比较
Slope -3.322
100%efficienc y
阈值（threshold）的设定
阈值：PCR扩增信号进入相对稳定的 对数增长期时的荧光值。
Ct值——n：扩增循环数
PCR循环在到达Ct值所在的循环数时 ，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期 ），此时微小误差尚未放大，因此Ct值 的重现性极好，即同一模板不同时间扩 增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct 值是恒定的。
标准曲线 • 由系列稀释的已知浓度的样品做标准曲线 • 计算待测样品的初始模板浓度
log N0 =-Ct logE+logN
二．荧光定量 PCR 标记方法
内掺式染料 序列特异性探针
引物特异性探针
SYBR Green I, LC Green Taqman Molecular Beacons FRET Amplifluor (Intergen) LUX
定量PCR基本原理及方法
基因有限公司 黄妤
内容
一． 荧光定量PCR基本原理 二． 荧光定量PCR标记方法 三． 荧光定量PCR不同方法学的应用
一．荧光定量PCR基本原理
➢ 定量PCR技术的产生 EB 1992年由Higuchi等人第一次报告：使用 加入PCR反应体系，经改装
的带有冷CCD的PCR仪检测样品的荧光强度 核酸 ↔ 染料荧光 后来用与双链DNA有更强结合力的SYBR Green I取代EB