液相色谱定量方法指导原则讲解
高效液相色谱法定性定量分析讲解
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定性分析
常用的液相色谱定性方法有： 1. 利用已知标准样品定性 利用标淮样品对未知化合物定性是最常 用的液相色谱定性方法。由于每一种化合物 在特定的色谱条件下（流动相组成、色谱柱 、桂温等相同），其保留值具有特征性，因 此可以利用保留值进行定性。
2．利用检测器的选择性定性 同一种检测器对不同种类的化合物的响
紫外检测器是液相色谱中使用最广泛的一种检测器 。全波长扫描紫外检测器可以根据被检测化合物的紫外 光谱图提供一些有价值的定性信息。
传统的方法是在色谱图上某组分的色谱出现极大值 即最高浓度时，通过停泵等手段，使组分在检测池中滞 留，然后对检测池中的组分进行全波长扫描，得到该组 分的紫外—可见光谱图；再取可能的标准样品按同样方 法处理。对比两者光谱图即能鉴别出该组分与标准样品 是否相同。对于某些有特殊紫外谱图的化合物，也可以 通过对照标准谱图的方法来识别化合物。
固定相的种类：
1. 硅胶 2. 氧化铝 3. 聚合物 固定相的选择：（+++表示好，++表示一般，+表示差
）
流动相：
一个理想的流动相溶剂应具有低粘度、 与检测其兼容性好、易于得到纯品和低毒性 的特征。
选择流动相要考虑的因素：
1.流动相应不改变填料的任何性质； 2.纯度； 3.必须与检测其匹配； 4.粘度要低； 5.对样品的溶解度要适宜； 6.样品易于回收。
泵应具有的性质： 1. 流量稳定； 2. 流量范围宽； 3. 输出压力高； 4. 液缸容积小； 5. 密封性能好，耐腐蚀。
操作时的注意事项：
1. 防止任何固体微粒进入泵； 2. 流动相不含有任何腐蚀性物质； 3. 工作时要注意溶剂瓶中的溶剂用完； 4. 泵的工作压力不能大于规定的最大压力； 5. 流动相要先进行脱气，防止产生气泡。
液相色谱仪检定规程
液相色谱仪检定规程一、通用技术要求1.1仪器外观仪器上应有仪器的名称、型号、制造厂名、产品系列号、出厂日期等内容的标牌，国产仪器应有制造计量器具许可证MC 标志。
1.2仪器电路系统仪器电源线、信号线等插接紧密，各开关、旋钮、按键等功能正常，指示灯灵敏，显示器清晰。
二、计量性能要求1.1输液系统1.1.1输液管路接口紧密牢固，在规定的压力范围内无泄漏。
1.1.2流量设定值误差S s和流量稳定性误差Sr应符合表1的要求。
1.1.3梯度误差Gc:不超过±3%。
1.2柱温箱1.2.1柱箱温度设定值误差△T s：不超过±2℃。
1.2.2柱温稳定性Tc：不超过1℃。
1.3检测器液相色谱仪检测器的主要技术指标见表2。
表1流量设定值误差S s和流量稳定性误差Sr的要求表2液相色谱仪检测器的主要技术1.4整机性能仪器的整机性能用定性定量测量重复性表示。
1.4.1定性测量重复性（6次测量）RSD6:不超过1.5%。
1.4.2定量测量重复性（6次测量）RSD6: 不超过3.0%。
三、检定方法1、通用技术要求的检查按第1.1、1.2条的要求，目视、手动检查。
2、输液系统的检定a)泵耐压检定将仪器各部分连接好，以100%甲醇为流动相，流量为1mL/min，按说明书启动仪器，压力平稳后保持10 min，用滤纸检查各管路接口处应无湿迹。
卸下色谱柱，堵住泵出口端（压力传感器以下），使压力达到最大允许值的90%，保持5 min无泄漏。
b)泵流量设定值误差Ss、流量稳定性误差Sr的检定按表1的要求设定流量，启动仪器，压力稳定后，在流动相出口处用事先清洗称重过的容量瓶收集流动相，同时用秒表计时，收集表1规定时间流出的流动相，在分析天平上称重，按式（1）、式（2计算）S s和S r。
S s=（F-F s）/F s×100% （1）mSr=(F max-F min)/ Fm×100% （2）3、基线噪声和基线漂移的检定选用C18色谱柱，以100%甲醇为流动相，流量为1.0Ml/min，紫外检测器的波长选在254nm，检测灵敏度调到最灵敏档，记录纸速调至5—10mm/min 。
液相色谱法定量分析与案例分享
液相色谱法定量分析与案例分享
定量分析是在定性分析的基础上，需要纯物质作为标准样品。
液相色谱的定量是相对的定量方法，即：由已知的标准样品推算出被测样品的量。
液相色谱法定量的依据
被测组分的量(W)与响应值(A)（峰高或峰面积）成正比,W=f×A。
定量校正因子(f)：是定量计算公式的比例常数，其物理意义时单位响应值（峰面积）所代表的被测组分的量。
由已知标准样品的量和其响应值可以求得定量校正因子。
测定未知组分的响应值，通过定量校正因子即可求得该组分的量。
定量分析常用术语：
样品（sample）：含有带测物，供色谱分析的溶液。
分为标样和未知样。
标样（standard）：浓度已知的纯品。
未知样（unknow）：浓度待测的混合物。
样品量（sampleweight）：待测样品的原始称样量。
稀释度（dilution）：未知样的稀释倍数。
组分（componance）：欲做定量分析的色谱峰，即含量未知的被测物。
组分的量（amount）：被测物质的含量（或浓度）。
积分（integerity）：由计算机对色谱峰进行的峰面积测量的计算过程。
校正曲线（calibrationcurve）：组分含量对响应值的线性曲线，由已知量的标准物建立，用于测定待测物的未知含量。
常用的定量方法
1外标法
标准曲线法，分为外标法和内标法。
外标法在液相色谱中用的最多。
内标法准确但是麻烦，在标准方法中用的最多。
液相色谱定量基础知识
定量参数
定量方法： 面积归一法、外标法、内标法等
工作曲线的制作： 曲线点数：一点、两点及多点 曲线计算：线性、折线、二次曲线、三次曲线
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影响定量结果的因素
保留时间的重现性（对GPC影响很大） 样品问题（杂质、溶剂、稳定性、配制）
11
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CIS
C2
CIS A3 AIS
C3
CIS
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内标法
试样配制：准确称取一定量的试样Wi，加入一定量内 标物WS 计算式： wi f i Ai
ws f s As f i Ai Ai wi ws f i ' ws f s As As
1) 定量方法：外标法、内标法、面积归一法等
2) 曲线点数：一点或多点Байду номын сангаас3) 曲线拟合：线性、折线、曲线
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积分参数
20 20
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wi f i Ai wi wi f i ' Ai '
wi wi Ai ' wi Ai
15
fi fi '
wi wi Ai ' 1 Ai
15 15
高效液相色谱仪的定性、定量分析(未知样品中苯甲酸含量的测定)
一. 实验目的：
1. 学习高效液相色谱法的测定原理； 2.掌握高效液相色谱仪（HP1100）的定性、定量 分析方法。
二。实验原理： 高效液相色谱法是重要的色谱方法，是在经典液相色谱法 和气相色谱的基础上发展起来的，（经典液相色谱法使用粗粒 多孔固定相，装填在大口径、长玻璃管柱内，流动相仅靠重力 流经色谱柱，溶质在固定相的传质、扩散速度极其缓慢，柱入 口压力低，仅有低的柱效，分析时间长；气相色谱原理类似， 流动相为气体，只能分离小分子量、低沸点的有机化合物，配 合程序升温可分析高沸点的有机化合物。）弥补了经典液相色 谱法和气相色谱的缺点。它使用了多孔微粒固定相，装填在小 口径短的不锈钢柱内，流动相通过高压输液泵进入高压的色谱 柱，溶质在其中的传质、扩散速度大大加快，从而在短时间内 获得高的分离能力。可分析低分子量、低沸点的有机化合物， 更多适用于分析中、高分子量、高沸点及热稳定性差的有机化 合物。
4．进样阀从装载转向进样位，同时按进样按扭，工作站 开始记录并出图11。 5．苯甲酸的色谱峰出完后，按照4-5步骤连续操作四次， 获得从最低浓度到最高浓度的标准试液的五张色谱图，分 别为11，12，13，14，15（15为流动相进样，设浓度为0 mg/ml）。 6．按照4-5步骤取25微升的未知样品，进样，出谱图W1。
四．实验步骤：（ESTD法） 1． 标准储备液的配置：准确量取0.144克苯甲酸钠试剂 ， 用 纯 水 或 去 离 子 水 溶 解 ， 定 容 到 100 毫 升 ， 浓 度 为 1.44mg/ml. 分别取此标准液5 ml，2.5 ml，1 ml, 0.5 ml稀 释为10 ml，则浓度分别为0.72 mg/ml，0.36 mg/ml，0.144 mg/ml，0.072 mg/ml。 2． 打开计算机，开仪器，稳定后，打开桌面的ONLINE 工作站。 设定方法：设置泵的流速为1ml/min，柱温为室温（ 40度左右），停止时间为4min，流动相比例（甲醇：水 =60；40），当流动相通过色谱柱约5-10min，记录仪上基 线稳定后，开始进样。 3． 进样：进样阀放在装载的位置上，用注射器取25微升 浓度最低的标准样（比进样阀上的定量环多5-10微升以上 ），注入进样阀中。
液相色谱定量方法指导原则共42页
3、最大限度地行使权力总是令人反感 ；权力 不易确 定之处 始终存 在着危 险。— —塞·约翰逊 4、权力会奴化一切。——塔西佗
5、虽然权力是一头固执的熊，可是金 子可以 拉着它 的鼻子 走。— —莎士 比
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71、既然我已经踏上这条道路，那么，任何东西都不应妨碍我沿着这条路走下去。——康德 72、家庭成为快乐的种子在外也不致成为障碍物但在旅行之际却是夜间的伴侣。——西塞罗 73、坚持意志伟大的事业需要始终不渝的精神。——伏尔泰 74、路漫漫其修道远，吾将上下而求索。——屈原 75、内外相应，言行相称。——韩非
岛津液相色谱培训-定量基础知识
Nam e
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mAU
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峰面积处理参数
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理论塔板数, N
Rt Area H W1/2 W
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中国/日本药典 : N = 5.54 x ( Rt / W 1/2 )2 美国药典 : N = 16 x ( Rt / W )2
7
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外标法
浓度 C1 A2 C2 面积 A1 A4 A3 A2 A1 A4 C4 C1 C2 C3 浓度 C4
8
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峰面积
标准曲线
A3 C3
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面积归一化 外标法 内标法 标准加入法
6
6
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面积归一化法
液相色谱仪最小检测浓度和定量测量重复性的测量不确定度
液相色谱仪最小检测浓度和定量测量重复性的测量不确定度1 测量方法（依据JJG 705--2002）液相色谱仪依据国家计量检定规程JJG705—2002《液相色谱仪》进行检定，其中紫外-可见光检测器、二极管阵列检测器均需测量最小检测浓度，整机还需检定定性测量重复性及定量测量重复性。
紫外-可见光检测器和二极管阵列检测器浓度的测量方法：选用18C 色谱柱，以100%甲醇为流动相，流量为1.0mL/min ，紫外检测器的波长选在254nm ，检测灵敏度调在最灵敏档，记录纸速调至5—10cm/min （使用工作站的设置好相关参数）。
开机预热，待仪器稳定后记录30min ，由检测器的衰减倍数和测得的基线峰—峰高对应的记录仪标度，按公式d N =KB 计算基线噪声。
保持操作条件，用微量注射器从进样口注入10～20uL 1×10/g mL -7的萘/甲醇溶液，打印的色谱图及相关数据或记录色谱图并测量计算相关数据，由色谱峰高和基线噪声峰—峰高，计算最小检测浓度L c (按20μL 进样量计算)。
整机定性、定量重复性的测量方法：将仪器各部分连接好，选用18C 色谱柱，根据仪器配置的检测器，选择流动相和测量参数：紫外检测器和二极管阵列检测器用100%甲醇为流动相，流量为1.0mL/min,,检测波长为254nm ，灵敏度选择在0.04左右，基线稳定后由进样器注入5--10μL 的4110/g mL -×萘/甲醇标准溶液；连续测量6次，记录色谱峰的保留时间和峰面积，计算相对标准偏差6RSD 。
2 数学模型 2.1 最小检测浓度 2=20d L N cVc H（1） 2.2 定性、定量重复性6=RSD 1X%×100 3 方差和灵敏系数方差 222222222u ()=()()()()u ()()+()()c L d d C c N u N c c u c H u H c V u V （3）灵敏系数 d ()2/(20)C N cV H = ()=2/(20)d C c N V H （9） 4 最小检测浓度的不确定度分析与计算4.1 标准不确定度分量的分析和计算4.1.1 输入量标准溶液浓度定值c 的标准不确定度u(c)的分析和计算输入量c 的标准不确定度u(c)主要来源于标准溶液浓度定值的标准不确定度，采用B 类评定方法进行评定。
液相色谱定量方法指导原则
液相色谱定量方法指导原则液相色谱是一种广泛应用于化学、生物化学、环境科学等领域的重要分析技术。
在液相色谱中，准确的定量分析是确保实验结果可靠性和科学准确性的关键。
为了有效进行液相色谱定量分析，以下是一些引导原则：1.校准曲线的建立和验证：校准曲线用于将峰面积与待定物质的浓度建立关系。
在建立校准曲线时，应使用已知浓度的标准溶液进行多点标定。
在校准曲线的范围内，应验证标准曲线的线性、精密度和准确度。
2.样品制备和处理：样品制备对液相色谱定量分析非常关键。
样品应选择适当的溶剂进行溶解或稀释。
对于复杂的样品基质，可能需要进行样品预处理，如固相萃取、液液萃取等。
3.选择适当的色谱柱：液相色谱柱是液相色谱分析的核心。
对于不同的待测物质，应选择适当的色谱柱类型和分离机理。
关键是考虑分析目标，有机分子、生物分子或无机分子等。
同时，还需要考虑样品基质的性质。
4.优化色谱条件：通过优化色谱条件，可以提高分离和检测的灵敏度，并减少分析时间。
例如，可以调整流速、温度和流动相成分等参数。
优化色谱条件可以使得峰形状尖峰对称，峰分离度好，并提高信号强度。
5.熟悉检测器特性：不同的液相色谱检测器具有不同的特点和适用范围。
常用的检测器包括紫外-可见检测器、荧光检测器和电化学检测器等。
熟悉检测器的特点可以帮助选择合适的检测器，并优化检测条件。
6.质量控制和质量保证：质量控制是确保液相色谱分析结果可靠性和准确性的关键环节。
应使用合适的质量控制标准和方法。
同时要进行合理的质量保证程序，如重复实验、平行实验等。
7.数据处理和结果解释：液相色谱定量分析通常产生大量的数据。
数据处理和结果解释是确保数据准确性和可靠性的重要步骤。
其中包括峰面积的计算、数据标准化、统计分析和结果解释等。
总之，液相色谱定量方法的指导原则是建立可靠的校准曲线，正确进行样品制备和处理，选择适当的色谱柱和优化色谱条件，熟悉检测器特点，进行质量控制和质量保证，并进行准确的数据处理和结果解释。
高效液相色谱定性定量分析方法
1 所选浓度范围使检测器的响应值超出了该检测器 响应值的线性范围；
2 实验数据的精密度太差，过于分散。
无论何种原因，都应重新绘制标准工作曲线 。
诚信
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为/客/户/生/产/满/意/商/品 为/社/会/培/养/有/益/人/才
• 在某些限定条件下，被测组分的浓度与检测器的 响应值成正比的关系。（蒸发光散射检测器浓度 与峰面积不成线性，分别取对数后呈线性。）
• Ci=fiAi • Ci=fiHi
• 实际修饰公式为：y=ax+b
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定量分析方法
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面积归一化法
不能作为准确定量的方法、仅在特殊情况下使用
• •
公式： 特点：
C%
Ai Ai
100%
– 各组分要全部流出、全部被检测，要求所有响 应因子相当
– 进样量不要求严格
– 不需标样
– 无需做校正、简单、快速
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内标法
• 选择适宜的物质作为欲测组分的参比物， 定量加到样品中去，依据欲测组分和参比 物在检测器上的响应值（峰面积或峰高） 之比和参比物加入的量进行定量分析的方 法。
• 内标法与标准曲线法相比，有利于消除色 谱条件不完全重现、进样量不准确等所带 来的误差。
高效液相色谱定性定量分析方法==
吸光度（ Absorbance UV/Vis）检测 • 目前实验室中最流行的选择 ▫ 多数公司约75%的检测器是吸光度检测器（其中50%是多 波长，25%是PDA） • 测量通过溶液后的紫外或可见光光强度的损失 • 吸光度与样品浓度呈线性关系 • 在被测物的最大吸收波长处检测时灵敏度最大
吸光度检测器（ UV/Vis）－ 优点 • 这种检测器简单、可靠 • 多数人熟悉并喜欢这种技术 • 可以作梯度实验并且是非破坏性的 • 大多数有机化合物有一定程度的吸光度 • 一般来说灵敏度还可以
固定滞后体积，改善了梯度性能 梯度百分比 梯度曲线 好的梯度 滞后曲线 保留时间
普通的低压梯度系统 梯度百分比 不好的梯度 滞后曲线
保留时间
液相色谱的色谱柱
色谱柱的连接
Stop_depth长度不合适造成柱前死体积
色谱柱的连接
锥箍锥度不合适造成渗漏
可能提高柱效的方法
除去柱上端固定相变色部分 (约3mm左右)，再补充新的
泵的保养： • • • • • 使用流动相尽量要清洁； 进液处的砂芯过滤头要经常清洗； 流动相交换时要防止沉淀； 避免泵内堵塞或有气泡； 每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交叉污 染；
柱的保养： • • • • • • • • • 柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动； 当柱子和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净； 要注意流动相的脱气； 避免使用高粘度的溶剂作为流动相； 进样样品要提纯； 严格控制进样量； 每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品； 每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱； 若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭；
• 试剂:
分析纯
• 不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水，水质要 求越高放置时间越短。
液相色谱定量方法指导原则讲解
X X A ( h ) X A( h )
' ' i i i i i
7 常用的几种定量测定方法（十四）
标准加入法（二）
b.可以加入一系列浓度，按标准曲线外推法计算 出欲测物在样品中的含量。 • 优点：不需要另外的内标物，不必要进样非常 准确；操作简单；若在前处理过程加入，可补 偿被测组分在处理过程中的损失。 • 缺点：色谱条件要求完全一致，否则会带来分 析误差。
内标标准曲线的绘制 a. 将待测组分的纯物质配成不同浓度的标准溶 液（系列）； b. 取固定量的标准溶液和内标物，混合后进样 分析，测出 Ai 和 As； c. 用 Ai / As 对标准溶液浓度作图，可得一组通 过原点的直线（内标标准曲线）。
7 常用的几种定量测定方法（九） 样品测定与组分定量
a. 称取与绘制标准曲线相同量 的试样和内标物，测出其峰 面积比，由标准曲线即可查 出待测组分的含量。 b. 内标标准曲线法应用在生产 过程控制分析上，不须计算 校正因子，对液体样品也可 量取体积，具有简便快速的 特点。
7 常用的几种定量测定方法（四）
内标法待测组分含量计算式如下（由前可推得）:
f A ms i ' i f s As xi 100% m样品
'
（各符号意义同上） 内标法中常以内标物为基准，即：f 's ＝ 1 ， 也可用峰高代替峰面积，做法同上。
7 常用的几种定量测定方法（五）
内标法注意事项 a. c. 内标物应是试样中不存在的纯物质； 内标物的色谱峰应位于待测组分色谱峰附近 或几个待测组分色谱峰之间。
• 检测器对不同物质的响应值不同，故相同质 量的不同物质通过检测器时，产生的峰面积 不等，因而不能直接应用峰面积计算组分含 量。 • 为此引入“定量校正因子”以校正峰面积， 使之能更真实地反映组分含量。 • 前面已知：mi ＝ fi Ai 即：fi ＝ mi / Ai
液相定量方法
液相定量方法液相定量分析是指在液体状态下进行的化学分析方法，用以确定溶液中特定组分的浓度或含量。
这种方法在化学分析、临床诊断、环境监测、药物分析等领域都有广泛应用。
以下是一些常见的液相定量方法：1. 紫外-可见光谱法（UV-Vis Spectroscopy）：利用物质在紫外和可见光区域对光的吸收特性来进行定量分析。
每种物质都有特定的吸收光谱，通过测量溶液的吸光度，可以依据朗伯-比尔定律（Lambert-Beer Law）计算出溶液中组分的浓度。
2. 红外光谱法（IR Spectroscopy）：通过分析物质在红外光区域的光谱来识别和定量分子中的特定基团。
红外光谱可以提供有关分子结构和化学环境的信息。
3. 原子吸收光谱法（Atomic Absorption Spectroscopy, AAS）：利用原子在特定波长处对光的吸收来定量分析元素。
当样品中的元素原子化后，它们会吸收特定波长的光，吸收的强度与原子的浓度成正比。
4. 原子荧光光谱法（Atomic Fluorescence Spectroscopy, AFS）：类似于AAS，但是检测的是被原子化的物质在特定波长处发射的光。
AFS通常具有更高的灵敏度。
5. 质谱法（Mass Spectrometry, MS）：通过分析物质的质谱图来确定其分子质量和结构。
质谱法可以用于定性和定量分析，但在液相分析中，通常用于检测和鉴定分析物。
6. 高效液相色谱法（High-Performance Liquid Chromatography, HPLC）：HPLC是一种常用的液相分离和定量技术。
它通过色谱柱分离混合物中的组分，然后使用检测器（如紫外检测器、二极管阵列检测器、电化学检测器等）来监测分离后的组分的浓度。
7. 液相色谱-质谱联用（LC-MS）：将液相色谱的分离能力与质谱的检测灵敏性和特异性结合起来，用于复杂样品中微量组分的定性和定量分析。
8. 电化学方法（Electrochemical Methods）：如伏安法、电位滴定法等，通过测量电化学反应的电流或电位变化来定量分析溶液中的物质。
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