5.缓冲液离子强度对电泳速度的影响

缓冲液离子强度对电泳速度的影响

目标：⒈阐述电泳的基本原理及注意事项。

⒉初步掌握电泳技术（以血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳为例）。

⒊观察并比较不同缓冲液离子强度对电泳速度的影响。

实验用品：电泳仪，电泳槽，醋酸纤维薄膜（2×8cm），点样器（X胶片），滤纸，无齿小镊子，pH8.6（I0.06和0.03）的巴比妥缓冲液等。

试剂：1、I0.06pH8.6的巴比妥缓冲液：

巴比妥钠12.76g

巴比妥 1.66g

蒸馏水1000ml

2、I0.03pH8.6的巴比妥缓冲液：

巴比妥钠 6.38

巴比妥0.83

蒸馏水1000ml

或用I0.06pH8.6的巴比妥缓冲液加蒸馏水稀释一倍即成。

3、氨基黑10B染色液：

氨基黑10B0.5g

冰醋酸10ml

乙醇50ml

蒸馏水40ml

4、漂洗液：

乙醇45ml

冰醋酸 5.0ml

蒸馏水50ml

实验原理：

由于血清中各种蛋白质等电点（pI）不同，所以在同一PH8.6缓冲液中电离程度不同，因而带电荷的多少不同。再则不同蛋白质其分子大小、形状等差异，把它放入同一电场中其电泳的迁移率（是指带电颗粒在单位电场强度下的电泳速度）不同而分离。蛋白质分子大而带电荷少的移动速度慢，如此将血清蛋白从正极到负极依次分为A、α1、α2、β、γ五个区带，经染色、漂洗、脱色，然后计算各蛋白质区带的迁移率，得出电泳缓冲液离子强度对电泳速度是如何影响的。

操作步骤：

1.一般电泳装置：示教

2.电泳操作：

①酸纤维薄膜的准备：在距一端1.5cm处用铅笔画一条细线，然后浸泡于I0.06PH8.6的巴比

妥缓冲液或I0.03PH8.6的巴比妥缓冲液中约20min。

②取出，用滤纸吸走多余的缓冲液。

③用点样器蘸取血样点于薄膜上。

④将点好样的薄膜置于电泳槽上，点样面朝下，点样端置电场中的负极。

⑤电泳：电压110~160V、时间35~40分钟。

⑥染色：氨基黑10B或丽春红S染液染色2~3分钟。

⑦漂洗：3~4次，背景变白，图象清晰。

结果观察与分析：

1.比较用I=0.03和I=0.06的缓冲液进行电泳时的结果，观察图形，判断用哪种离子强度好。

2.利用所记录的电泳电压（V），支持物有效长度（CM），电泳时间（S）和清蛋白移动距离（CM），分别计算用离子强度0.03和0.06的清蛋白迁移率，判断离子强度对电泳速度的影响。

※迁移率（μ）是指带电颗粒在单位电场强度下的电泳速度（V）。

即：μ=V/E，∵V=d/t （cm/S）（t—时间d—移动距离cm）

E=U/L(V/cm) (U—电压L—支持物有效长度)

∴μ=V/E=（d/t）/(U/L)=dL/Ut (cm2/vs)

结论：