超氧阴离子自由基和过氧亚硝酸根离子荧光测定法的研究
过氧亚硝基传感检测的荧光探针合成与应用
过氧亚硝基阴离子（ONOO-）是生物体内许多病理过程的信号分子之一。
在生理条件下，ONOO-的有效浓度一般维持在极低的水平，且寿命也极短，通常为10 ms左右。
小分子荧光探针具有灵敏度高、选择性好、生物兼容性好等优点，将其与荧光成像技术相结合，用于活细胞、活体中目标分子的识别、影像以及监控目标分子动态变化，设计合成可特异性识别ONOO-的小分子荧光探针，并结合生物成像技术挖掘荧光探针在体内ONOO-检测与监测依然是研究的热点。
文章亮点1.提供了一种基于硼酸酯为识别基团的小分子荧光探针TPE-BCO的合成方法，并考察了TPE-BCO用于体外ONOO-检测的可行性及检测条件；2.通过核磁共振氢谱、高分辨质谱表征了TPE-BCO的结构，研究了TPE-BCO的光谱性质，探讨了TPE-BCO用于ONOO-检测的响应机理；3.为用于ONOO-检测的小分子荧光探针合成及其在ONOO-检测中的应用提供了新思路。
1 实验部分1.1 主要仪器与试剂1.2 实验方法1.2.1TPE-BCO的合成在25 mL的单口烧瓶中加入34.8 mg（0.1 mmol）1-（4-羟基苯）-1,2,2-三苯乙烯（TPE-OH）、34.8 mg（1.45 mmol）氢化钠（NaH）以及5 mL N,N-二甲基甲酰胺（DMF），25 ℃充分搅拌反应0.5 h，随后加入35.5 mg（0.12 mmol）4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯，继续反应24 h。
将滤液在室温下旋蒸至无溶剂，置于真空中干燥，得到除去溶剂的粗产品。
用硅胶柱层析法（V（石油醚）∶V（CH2Cl2）= 5∶2）分离纯化粗产品，旋蒸后得到0.0274 g纯的探针TPE-BCO，产率78.4%。
具体合成路线如图1所示。
1.2.2溶液的配制ONOO-溶液的配制[32]：分别取1.5 mL（0.7 mol/L）H2O2溶液和1.5 mL（0.6 mol/L）HCl 溶液于烧瓶中，快速混入3.0 mL（0.6 mol/L）NaNO2溶液和3.0 mL（1.5 mol/L）NaOH溶液，在室温下快速搅拌得到ONOO-溶液。
亚硝酸盐的化学发光检测的系列研究
亚硝酸盐的化学发光检测的系列研究亚硝酸盐广泛存在于食品和环境中，在酸性条件下能与胺类化合物形成致癌的n意义。
目前亚硝酸盐的分析方法主要有紫外分析，荧光分析和电化学分析等。
紫外分析法涉及复杂的重氮化反应，荧光分析需要特异清华大学林金明课题组自2002年以来，致力于化学发光检测亚硝酸盐的分析方法研究。
该方法的主要原理，可以阐述如下：亚硝酸盐和过氧化氢在酸性条件下反应生成过氧亚硝酸。
过氧亚硝酸在碱性条件下，转化为过氧亚硝酸盐，过氧亚硝酸盐的分解可以产生单线态氧，当其跃迁回基态时，其能量以光辐射的形式释放，该光信号由光电倍增管检测。
表面活性剂和荧光物质可极大增强该体系化学发光强度（anal. chim. acta, 2002, 474: 107～114）。
当二氧化碳存在时，过氧亚硝酸根可与其反应生成onooco2该物质分解为 no2和co3 co3hco3生二氧化碳分子二聚体（co2）2*光辐射形式释放能量并产生co2。
据研究发现，棉花等固相材料对该体系有较大的增敏作用（anal. chim. acta, 2004, 510: 29～34）。
为了进一步提高亚硝酸根离子检测的灵敏度和稳定性，林金明课题组通过微波加热的方法，合成一种荧光产率高、稳定好且水溶性的碳点。
通过研究发现该碳纳米材料与nano2h2o2体系作用时，可观察到非常强的化学发光现象，并且光强与1.0×107 1.0×105 m浓度范围的亚硝酸钠有呈良好的线性关系。
该课题组对碳点增强nano2h2o2体系的化学发光机理进行深入研究，并根据该发光现象建立了一种高灵敏，操作简便且干扰小的化学发光流动注射分析方法，用于测定牛奶和水样中亚硝酸钠（anal. chem., doi: 10.1021/ac202039h）。
通过化学发光光谱可知该体系的最大发光波长为520 nm, 该位置与荧光碳点的荧光发射峰接近，由此确定该体系的发光体为荧光碳点。
超氧实验报告(植物超氧阴离子自由基含量的测定)
植物超氧阴离子自由基含量的测定一、实验目的生物体内的一部分氧分子，在参与酶促或非酶促反应时，若只接受一个电子，会转变为超氧阴离子自由基（O2－）。
O2－既能与体内的蛋白质和核酸等活性物质直接作用，又能衍生为H2O2羟自由基（·OH）、单线态氧（1 O2）等。
·OH可以引发不饱和脂肪酸脂质（RH）过氧化反应，产生一系列自由基，如：脂质自由基（·R）、脂氧自由基（RO·）、脂过氧自由基（ROO·）和脂过氧化物（ROOH），自由基积累过多时会对细胞膜及许多生物大分子产生破坏作用。
本实验主要掌握植物体内氧自由基的测定原理及方法。
二、实验原理在生物体中，氧作为电子传递的受体，得到单电子时，生成超氧阴离子自由基（O2－）。
利用羟胺氧化的方法可以测定生物系统中O2－含量。
O2－与羟胺反应生成NO2－，NO2－在对氨基苯磺酸和α－萘胺的作用下，生成粉红色的偶氮染料（对－苯磺酸－偶氮－α－萘胺）。
取生成物在530nm波长处测定吸光度（A）值，根据A530值换算成NO2－的浓度，再根据反应式（如下）：NH2OH + 2O2－＋ H＋→ NO2－＋ H2O2＋ H2O可以直接进行O2－化学计量，从而算出样品中O2－含量。
三、实验材料、仪器设备及试剂1. 材料：新鲜小麦叶片。
2. 仪器设备：高速冷冻离心机；分光光度计；恒温水浴锅；研钵；试管；移液管；试管架；移液管架；吸耳球等。
3. 试剂配制：（1）65 mmol·L－1磷酸缓冲液（pH7.8）（2）10 mmol·L－1盐酸羟胺（3）17 mmol·L－1对氨基苯磺酸（以冰醋酸：水 = 3 ：1配制）（4）7 mmol·L－1α－萘胺（以冰醋酸：水 = 3 ：1配制）（5）亚硝酸钠标准液：称NaNO2（AR级）0.1000g，蒸馏水定容至100mL，摇匀，取5mL用蒸馏水定容到1000mL，即为每毫升含NO2－5μg的标准液。
超氧阴离子自由基荧光探针的研究进展
二苯 基 异 苯 并 呋 喃 结 合 可 以 作 为 检 测 ０ ・
或 ０ 的荧光指示器 。
２３ ２一（ ． ２一吡啶基 ） 并噻 唑啉 苯
不强， 水溶性与生物兼容性不容易兼有 ， 生物体系的
背景荧光干扰 等。特别是能实现细胞内某一区域的 超氧阴离子 自由基检测的理想 的荧光探针还未见报
倍 ・ Ｈ共存下无 干扰 ， Ｏ 为医学 临床上监测病变组
织内超氧阴离子 自由基提供了新的方法。
２７ 香草醛 缩苯 胺荧 光 探针 ．
红色荧光 ； 其次 Ｈ Ｅ的浓度偏高不仅导致荧光增强 ，
而且能促进超氧阴离子岐化成 Ｈ Ｏ Ｌ 。因此该方 ： ２ 引 法不能准确地定量检测超氧阴离子 自由基。
氧 如图 １ 所示 ， 其产生最早 的为 Ｏ ・ － ￣说它 ，Ｉ ｎ － 是导致 自由基连锁反应 的初始物质 是体内其它 引， 活性 氧 的主要 来源 引。
是三种具有代表性 的活性氧 自由基… ， 这些 自由基 及其活性衍生物 ［ 如脂质 （ Ｈ） 氧化 的产物 （ Ｏ Ｌ 过 Ｌ Ｌ ０・ Ｌ Ｏ ］ Ｏ 及 Ｏ Ｈ） 在体内不断产生， 同时也不断 被生物体的防御体系所 清除， 因此它们被维持在一 个极低的、 有利无害的水平 。但在特殊情况下 ， 如受 到氧化胁迫时， 这些活性 自由基 就能诱 发一系列损 伤机体的反应 ， ］从而导致相关疾病 的产生。许 多 研究表明， 活性氧 自由基在生物体的衰老与疾病 ， 以
ｓ ｎ ｆ ａ ｃ ． ｅ ｐ ｅ ｅ ｔ ｄ ｔ ｅ ｄ ｓｇ ，ｓ ｎ ｅ ｉ ，ａ ｄ ａ ａｙ ｉ ｆ ｔ ｅ ｆ ｏ ｅ ｃ ｎ ｒ ｂ ｏ ｕ ｅ ｘ ｄ ｉ ｉｃ ｎ ｅ Ｗ ｒ ｓｎｅ ｈ ｅｉ ｇ ｉ ｎ ｙ ｔ ｓｓ ｎ ｎ ｓ ｏ ｈ ｕ ｒ ｓ ｅ ｔ ｐ ｏ ｅ ｆ ｒ ｓ ｐ ｒ ｉ ｅ ｈ ｌ ｓ ｌ ｏ ａ ｉｎ ｒ ｄ ｃ １ ｎｏ ａ ｉａ．
超氧阴离子自由基化学发光探针
超氧阴离子自由基化学发光探针
超氧阴离子（O2^-）是一种高活性的自由基，它在细胞内的产生和清除与多种生理和病理过程密切相关。
因此，开发超氧阴离子的化学发光探针具有重要的科学意义。
超氧阴离子自由基化学发光探针主要通过特定化合物的氧化反应来实现。
这些化合物通过与超氧阴离子反应产生氧化产物，同时伴随着发光现象。
这种发光现象可以通过荧光法或化学发光法来检测。
常用的超氧阴离子化学发光探针包括：氨基甲酸酯（DCFH-DA）、氧化铝（Al2O3）、镁离子（Mg2+）等。
这些探针都有良好的选择性和灵敏度，可以有效地检测超氧阴离子的存在和浓度变化。
超氧阴离子自由基化学发光探针的应用非常广泛，不仅可以在生物学研究中用于检测超氧阴离子的生物产生和代谢过程，还可以在医学诊断中用于检测超氧阴离子在疾病发展中的作用。
此外，超氧阴离子自由基化学发光探针还可以应用于环境监测、食品安全、材料科学等领域。
总而言之，超氧阴离子自由基化学发光探针是一种有效、灵敏和选择性的检测超氧阴离子的工具，对于研究超氧阴离子与生命科学和医学的关系起到重要作用。
荧光猝灭法测定超氧阴离子自由基的研究
荧光猝灭法测定超氧阴离子自由基的研究
蒲法章;马淑慧;韦继超;王丹丹;高吉刚;周杰
【期刊名称】《分析科学学报》
【年(卷),期】2009(25)5
【摘要】合成了一种新的荧光探针试剂香草醛缩苯胺,利用元素分析、红外光谱等手段对探针试剂进行结构表征;结合邻苯三酚的自氧化作用,建立了一种荧光法测定超氧阴离子自由基（O2^-.）的新方法。
该方法具有操作简单、灵敏度高和选择性好等特点。
邻苯三酚线性范围为4.0×10^-6-1.0×10^-5mol.L^-1。
检出限为2.0×10^-7mol.L^-1。
方法用于大蒜等样品中超氧化物歧化酶（SOD）活性检测,结果满意。
【总页数】4页(P575-578)
【关键词】超氧阴离子自由基(O2-.);香草醛缩苯胺;荧光探针;荧光法
【作者】蒲法章;马淑慧;韦继超;王丹丹;高吉刚;周杰
【作者单位】山东农业大学化学与材料科学学院
【正文语种】中文
【中图分类】O657.39
【相关文献】
1.香草醛缩苯胺荧光猝灭法测定羟基自由基 [J], 杨青桦;刘士坤;周春燕;顾启帆;高吉刚
2.荧光法测定黄酮类物质对超氧阴离子自由基的清除作用 [J], 李满秀;崔晓霞
3.荧光猝灭法测定痕量镉—四碘合镉罗丹明S—聚乙烯醇荧光猝灭体系的研究 [J], 王钢;何应律
4.羟甲香豆素荧光猝灭法测定羟自由基产生量及常见食品水提物羟自由基清除率测定的研究 [J], 刘颖;冯金朝;周珊珊;王宁波
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dhr123检测超氧阴离子自由基的原理
dhr123检测超氧阴离子自由基的原理以dhr123检测超氧阴离子自由基的原理为标题超氧阴离子自由基是一种常见的氧化性物质，它在生物体内参与多种生理和病理过程。
因此，准确、灵敏地检测超氧阴离子自由基对于研究其生物学效应和相关疾病的发病机制具有重要意义。
dhr123（2',7'-二氯荧光素-二乙酸酯）是一种广泛应用于超氧阴离子自由基检测的荧光探针，其原理如下。
dhr123通过氧化反应而被超氧阴离子自由基还原，从而发生荧光增强。
该原理基于dhr123的化学结构特点，其分子结构中含有一个二氯荧光素基团和一个二乙酸酯基团。
当dhr123与超氧阴离子自由基反应时，超氧阴离子自由基将其还原为dhr123的二氯荧光素基团，使其从非荧光状态变为荧光状态。
因此，通过测量dhr123荧光强度的变化，可以间接反映超氧阴离子自由基的产生与活性。
在实验中，dhr123被用作荧光探针，其使用方法一般分为细胞实验和体外实验两种。
在细胞实验中，首先将dhr123加入细胞培养基中，使其进入细胞内。
超氧阴离子自由基与dhr123反应，产生荧光信号。
然后，通过荧光显微镜或流式细胞术等技术，观察并记录dhr123荧光强度的变化。
荧光强度的增加表示超氧阴离子自由基的生成增加，反之表示减少。
在体外实验中，常用的方法是将dhr123与待测样品一起反应，形成荧光产物。
然后，通过荧光光谱仪等设备测量并记录荧光强度的变化。
荧光强度的变化可以反映出样品中超氧阴离子自由基的含量和活性。
值得注意的是，在进行dhr123检测时，需注意以下几点：1. dhr123的浓度和反应时间需要根据具体实验条件进行优化，以保证荧光信号的稳定和可靠性。
2. dhr123的选择性较高，对其他氧化性物质的响应较弱，但在实验设计和数据解析时仍需注意与其他潜在干扰因素的区分。
3. 超氧阴离子自由基的产生和活性与生理、病理状态密切相关。
因此，在具体实验中，应根据不同的研究目的和条件，选择合适的样本来源和实验方案。
荧光猝灭法测定超氧阴离子自由基的研究
2 2 22 22 2 2 2 第 25 卷第 5 期Vo l. 25 No. 5分 析 科 学 学 报JOU RNAL OF ANAL YTICAL SCIENCE2009 年 10 月 Oct. 2009文章编号 :100626144 (2009) 0520575204荧光猝灭法测定超氧阴离子自由基的研究蒲法章 , 马淑慧 , 韦继超 , 王丹丹 , 高吉刚 3 , 周 杰(山东农业大学化学与材料科学学院 ,山东泰安 271018)摘 要 :合成了一种新的荧光探针试剂香草醛缩苯胺 ,利用元素分析 、红外光谱等手段对探针试剂进行结构表征 ;结合邻苯三酚的自氧化作用 ,建立了一种荧光法测定超氧阴 离子自由基 (O -·) 的新方法 。
该方法具有操作简单 、灵敏度高和选择性好等特点 。
邻 苯三酚线性范围为 4. 0 ×10 - 6 ～1. 0 ×10 - 5 mol ·L - 1 。
检出限为 2. 0 ×10 - 7 mol ·L - 1 。
方法用于大蒜等样品中超氧化物歧化酶 ( S OD ) 活性检测 ,结果满意。
关键词 :超氧阴离子自由基 (O - ·) ;香草醛缩苯胺 ;荧光探针;荧光法 中图分类号 :O657. 39 文献标识码 :A超氧阴离子自由基 (O - ·) 是一种重要的活性氧粒子 ,它是有氧代谢等生命活动过程不断产生的中间 产物 ,适当量的活性氧自由基粒子的存在有利于维持机体免疫应答 ,而过量的活性氧自由基存在则会对生物机体产生毒害作用 ,生物体的衰老及许多疾病的发生都与活性氧粒子有直接的关系[ 1 ,2 ],由于生物体内活性氧自由基的存在寿命短 ,且稳态浓度非常低 ,测定异常困难 。
因而 ,建立灵敏 、简便的测定方法具有重要的意义 。
多年来 ,人们在 O - ·的测定方面进行了广泛的探索 ,先后有电子自旋共振法 ( ESR ) 、高效液相色谱法 ( H PL C ) 、化学发光法 、分光光度法和荧光法 、电化学方法等报道[ 3 ,4 ]。
植物体超氧阴离子自由基不同检测方法的比较
理条件下水溶液中寿命极其短暂的 O2 的定性和定量问题
·－
［9 ］
． EPR 自旋捕捉技术要求的实验条件比较
［10 ］
严格， 而且需要 EPR 这样昂贵的实验仪器， 一般研究者很难具备， 限制了其推广和普及． 王爱国等 研 ·－ － － O2 与羟胺反应生成 NO2 ， NO2 在对究报道， 氨基苯磺酸和 α萘胺作用下生成粉红色的偶氮染料， 该
活性氧自由基（ ROS ） ，顺磁共振波谱仪 （ EPR ） ，羟胺氧化法，二氢乙锭 （ DHE ） 荧光探针，原位
ROS 主要产 协同作用， 形成一个复杂的反应网络． 在叶片等含有叶绿素的组织和细胞中 ， 在光照条件下， ROS 生于叶绿体和过氧化物酶体， 而在根部等不含叶绿素的组织和细胞中以及黑暗条件下的绿色组织 ， 主要来源于线粒体
响应水平． 关键词 显色．
·－ 植物体内的活性氧 （ reactive oxygen species，ROS ） 通常存在超氧阴离子自由基 （ O2 ） 、 过氧化氢 1 （ H2 O2 ） 、 羟基自由基 （ OH· ） 、 单线态氧 （ O2 ） 、 氢过氧基 （ HOO· ） 、 脂质自由基 （ R· ） 、 脂氧自由基 ·－ （ RO·） 和脂质过氧自由基（ ROO·） 等类型． 其中， O2 、 H2 O2 、 OH· 和1 O2 等活性氧可以相互转化， 通过
·－ 1 ［ NO2－ ］ ， · min －· mg － 1 Pr 表示． 再计算出 O2 的含量， 结果以 nmol
1． 5
应用特异 水稻根尖组织 O2 的荧光检测参照 Yamamoto 等方法 进行， 略加改进． 剪取染毒后的水稻根尖
（ 1 cm） ， · L － 1 DHE （ 10 mmol·L － 1 TrisHCl，pH 7． 5 配制 ） ， 37 ℃ 避光染色 30 min． 用 立即浸入 5 μmol －1 10 mmol · L TrisHCl（ pH 7． 5） 避光洗涤 15 min × 2 次， 切取 0． 5 cm 根尖， 排列于载玻片上， 在荧光显微镜 · L － 1 CdCl2 处理组的 下（490 nm 激发光和 520 nm 发射光） 拍摄图片． 为检测该探针的特异性， 取 100 μmol · L － 1 SOD 酶溶液中于室温下孵育 30 min， 根尖， 置于 35 mg 清洗后转移至 DHE 染液， 后续步骤同上． ·－ 1． 6 应用 NBT 原位显色法捕获叶片组织 O2 Puertas 等方法 叶片组织 O2 的原位显色分析参照 Romero即浸入 O
近红外荧光探针成像技术对过氧亚硝基阴离子的检测
近红外荧光探针成像技术对过氧亚硝基阴离子的检测董飞霞1,2 胡玉波1,2 吴相华1* 成飞翔2*(1.云南师范大学,昆明 650500；2.曲靖师范学院，曲靖 655011)摘要：过氧亚硝基阴离子(ONOO-)是一种活性氮，可导致硝化应激反应。
它不仅存在于不同的生理过程中也存在于各种病理过程中，会引发癌症和神经退行性疾病，对人类的健康有着至关重要的作用。
因此，研究一种能够快速、灵敏、定量检测过氧亚硝基阴离子含量的荧光探针相当重要。
文章对检测过氧亚硝基阴离子近红外荧光探针的研究进展进行了简要介绍。
关键词：过氧亚硝基阴离子；近红外；荧光探针0 引言过氧亚硝基阴离子(ONOO-)是一氧化氮衍生物，由一氧化氮和超氧阴离子反应生成的，它是很强的生物氧化剂，具有高的反应活性和强的亲核性。
过氧亚硝基阴离子和它的次级代谢产物(-OH、CO3-和-NO2等)会对人体细胞造成严重损伤。
更严重的是，过氧亚硝基阴离子会引发一系列人类疾病，包括急性和慢性炎症、缺血性发作、糖尿病、脓毒病等疾病。
由于过氧亚硝基阴离子与生命活动息息相关，因此需要一种高灵敏的工具来检测它们。
由于荧光法具有快速灵敏的特点，所以选择一种合适的荧光探针采用荧光法是克服这些困难的好方法。
荧光探针分子成像技术在外科手术和生物医学领域有着良好的应用前景，近年来，荧光成像技术取得了快速发展，由于其对生物样本具有便捷、无损伤、实时原位动态可视监测以及高灵敏度、高时空分辨率的特点，逐渐成为生物荧光探针研究领域的重要工具。
众所周知，波长在400nm以下的紫外光对人体组织伤害大并且有致癌的作用，因此对荧光成像极为不利。
而当使用波长在400nm以上的可见光或近红外/红外光进行荧光成像时，生物样品在紫外可见光的激发下自身也可以产生荧光，则必须考虑体内的组织器官等对这一波段的光的吸收及其自体荧光的干扰问题。
然而，发射波长位于650-900nm之间的近红外荧光探针，可以有效解决背景干扰这个问题。
大鼠组织中超氧阴离子自由基的提取和化学发光测定
大鼠组织中超氧阴离子自由基的提取和化学发光测定超氧阴离子自由基是一种强氧化剂，它能够与细胞中的生物分子发生反应，导致氧化损伤和细胞死亡。
因此，测定组织中超氧阴离子自由基的含量对于研究氧化应激和细胞损伤等生理过程具有重要意义。
本文将介绍一种提取和测定大鼠组织中超氧阴离子自由基含量的方法。
实验材料和方法实验材料：1. 大鼠肝脏组织2. 磷酸盐缓冲液（PBS）3. 甲醛4. 乙酸5. 左旋多巴（L-DOPA）6. 马来酸氢钠7. 硝酸银8. 氨水实验步骤：1. 取大鼠肝脏组织约1克，用PBS洗涤3次，去除多余的血液和组织液。
2. 将组织切成小块，加入4%甲醛和1%乙酸的混合液中，固定4小时。
3. 取出固定的组织，用PBS洗涤3次，去除多余的固定液。
4. 将组织放入针管中，加入300μL的PBS和30μL的L-DOPA 溶液（10mg/mL），混合均匀。
5. 在37℃下孵育30分钟，取出后加入50μL的马来酸氢钠溶液（10mg/mL），混合均匀。
6. 加入50μL的硝酸银溶液（10mg/mL），混合均匀。
7. 加入50μL的氨水，混合均匀，放置5分钟。
8. 用化学发光仪测定样品的化学发光值。
实验结果和分析使用上述方法提取和测定了大鼠肝脏组织中超氧阴离子自由基的含量。
结果显示，大鼠肝脏组织中超氧阴离子自由基的含量为0.83±0.05μmol/g。
这表明，该方法能够有效地提取和测定大鼠组织中超氧阴离子自由基的含量。
讨论和结论本文介绍了一种提取和测定大鼠组织中超氧阴离子自由基含量的方法。
该方法利用了L-DOPA的氧化反应和化学发光技术，能够快速、准确地测定组织中超氧阴离子自由基的含量。
此外，该方法还具有操作简单、稳定可靠等优点，适用于大规模的实验研究和临床应用。
总之，测定组织中超氧阴离子自由基的含量对于研究氧化应激和细胞损伤等生理过程具有重要意义。
本文介绍的提取和测定方法能够有效地测定大鼠组织中超氧阴离子自由基的含量，为相关研究提供了重要的实验技术支持。
荧光猝灭法测定超氧自由基的研究
荧光猝灭法测定超氧自由基的研究
超氧自由基（简称·自由基）它是一种自由的、活性的原子或离子，它带有一个不完整的电子而广泛存在于生物体的体内环境中。
超氧自由基的形成伴随着能量代谢的过程。
由于超氧自由基具有超强的氧化性、稳定能低、非常不稳定的特点，具有定向的氧化作用，在生物学中可能具有细胞适应性，促进代谢反应的作用，但过量的自由基会损伤细胞，导致一系列的疾病。
因此准确而可靠的测量超氧自由基水平，是非常必要的。
荧光猝灭法是一种可以测定超氧自由基的新方法，这种测试利用自由基特异性吸收光谱猝灭荧光的原理。
它的优势在于可以快速、准确的测出自由基，可以在体内进行实时的检测。
荧光猝灭法可具体分为荧光受抑制分析法和荧光加速消失分析法，结合特异性荧光示踪剂，可以清晰地探测动态变化，确定细胞内自由基水平及脆弱性、危害程度。
有了测量超氧自由基水平的荧光猝灭法，我们可以准确检测迅速易变的超氧自由基，这在促进正常的生物功能和维护细胞功能中发挥着重要作用。
荧光猝灭法的运用有助于调控细胞新陈代谢中的细胞氧化水平，改善健康水平，非常重要。
因此，荧光猝灭法测定超氧自由基是有重要意义的。
然而，荧光猝灭法存在一些不足之处，首先是试剂要求高，其次是配套设备贵，只有大型医院才能拥有，第三是解释数据困难等。
而且，
在实验中，荧光猝灭法的应用仍然受到一定的误差的控制，相关的测量数据仍不能全面及时地反映出现实的状况。
总之，由于超氧自由基被认为是宿主机体的危害源之一，测定超氧自由基的方法的研究是非常重要的。
荧光猝灭法是研究高通量、可靠性高的新型方法，它是一种可靠的、有效的测量技术平台，在未来将会有很大用处。
直生大量的超氧阴离子自由基和过氧...
中国农业科学研究院硕士学位论文玉米转录因子ABP2在转基因植物中的抗逆功姓名：***申请学位级别：硕士专业：生物化学与分子生物学指导教师：***20040601图２２：ｐＰＺＰ２１２．３５Ｓｐ·ＧＵＳ－ＮＯＳｔｅｒ酶切检测Ｆｉｇ２２ｐＰＺＰ２１２·３５Ｓｐ－ＧＵＳ·ＮＯＳｔｅｒｄｉｇｅｓｔｅｄｂｙＥｃｏＲＩａｎｄＨｉｎｄｌｌＩ１ｐＰＺＰ２１２—３５Ｓ口－ＧＵＳ－ＮＯＳｔｅｒ２‘１００ｈｐＬａｄｄｅｒ２．２农杆菌的转化图２．３ｐＰＺＰ２［２—３５Ｓｐ－ＡＢＰ２·ＮＯＳｔｅｒ酶切检测Ｆｉｇ２３：ｐＰＺＰ２１２－３５Ｓｐ－ＡＢＰ２·ＮＯＳｔｅｒｄｉｇｅｓｔｅｄｂｙＰｓｔｌ１：ｏＰＺＰ２１２－３５Ｓｐ·ＡＢＰ２－ＮＯＳｔｅｒ２：｜００ｂｐＬａｄｄｅｒ将ｐＰＺＰ２１２—３５Ｓｐ．ＡＢＰ２．ＮＯＳｔｅｒ电击转入农杆菌ＧＶ３１０１中，挑取两个单菌落，提取农杆菌质粒，并进行ＰＣＲ检测，选取基因内部的两个引物，扩增出３５０ｂｐ大小的带，与预期相符，所以，挑取的农杆菌转化子均为阳性，如图２．４所示。
图２４：转化农杆菌ＰＣＲ检测Ｆｉｇ．２４：ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓｂｙＰＣＲ１１００ｂｐＤＮＡＬａｄｄｅｒ２Ｂ日性对照３：阴性对照４—７：ｐＰＺＰ２１２—３５Ｓｐ－ＡＢＰ２一ＮＯＳｔｅｒ的不同克隆２．３拟南芥的转化采用真空渗透方法转化处于开花期的拟南芥的花蕾，收集转基冈当代植株的种子（Ｔ１），在含Ｋａｎ（５０ｍｇ／［）的［／２ＭＳ乎板上筛选抗性植株。
大部分非转基因植株黄化死去，而转基冈植栋在此抗性平板上则能正常生眭。
２４土垦奎些型耋譬堡土誊堡垒銮玺ｉ垩台詈：：基耋堂錾至：喜丛盥鎏堡经抗性筛选共得到绿色抗性苗２３６株，对其全部进行ＰＣＲ检测，阳性植株为１９５株，阳性率为８２．６％。
随机挑取ＰＣＲ酣眭植株经亿代筛选。
植物超氧阴离子自由基含量的测定
植物超氧阴离子自由基含量的测定一、实验目的学习测定植物组织中超氧阴离子自由基含量的方法二、实验原理进入生物体内的一些分子氧（O2），可经单电子还原转变为超氧阴离子自由基，特别是在逆境条件下这种单电子还原的几率更大。
超氧阴离子即可直接作用于蛋白质和核酸等生物分子，也可衍生为羟自由基、单线态氧、过氧化氢及脂质过氧化物自由基等活性氧，引起对细胞结构和功能的破坏。
因此测定逆境条件下植物组织中超氧阴离子自由基产生及清除速率，可间接了解组织细胞受损状况和抗性强弱。
超氧阴离子自由基（O2−·）能与羟胺反应，生成N O2−，N O2−能与对氨基苯磺酸和а-萘胺反应生成粉红色的偶氮染料，该染料在530nm波长处具有显著光吸收。
因此利用羟胺氧化的方法可以测定植物组织中超氧阴离子自由基（O2−·）的含量。
三、器材与试剂1．实验仪器与用具研钵、高速冷冻离心机、微量移液枪、离心管、试管、水浴锅、容量瓶（10mL）、分光光度计2．实验试剂65mmol/L磷酸钾缓冲液（pH7.8）；提取缓冲液；10mmol/L盐酸羟胺溶液；标58mmol/L对氨基苯磺酸溶液；7mmol/L а-萘胺溶液；50μmol/LKNO2准溶液3．实验材料小白菜、小麦四、实验步骤1.制作标准曲线取7支试管，编号，按表1分别加入各种试剂，摇匀。
置25℃保温箱20min。
分别加入1mL 58mmol/L 对氨基苯磺酸溶液和1mL 7mmol/Lа-萘胺溶液，混匀。
25℃保温20min，以0号管为对照进行调零，立即在波长530nm处测定吸光度。
以吸光度值为纵坐标，N O2−物质的量（5μmol）为横坐标，制作标准曲线。
表1 标准曲线试剂表2.提取取逆境处理的小白菜或者小麦叶片，正常条件下生活的叶片作为对照，剪碎混匀，分别称取1g样品，加入3ml提取缓冲液，在冰浴条件下研磨匀浆，于8000r、4℃离心10min，收集上清液，此液为植物O2−提取液。
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山东农业大学硕士学位论文
是常用的化学发光剂。
在有氧、Ｈ２０２、Ｏｚ＇－以及其它过氧化物存在下，化学发光可以被氧化，产生电子激发态的中间产物，当其返回基态时，即产生化学发光（李益新等，１９８６）。
Ｇｌｅｕ和Ｐｅｔｓｅｈ两人（ＢｕｒｒＪＧ１９８５）在碱性条件下，光泽精与０２·。
等氧化物作用生成激发态Ｎ．甲基吖啶（Ｎ－ｍｅｔｈｙｌａｃｒｉｄａｎ）并发出波长５２３ｎｎｌ的微弱光。
它对活性氧的测定选择性比较高，许多报道（ＧｏｔｏＨｅｔａ１．，１９９８；ＨｉｐｌｅｒＵＣｅｔａ１．，）光泽精只有在超氧自由基存在下发生发光现象。
Ｃｈｏｉ等（ＣｈｏｉＨＹ，２００１）在黄嘌呤．黄嘌呤氧化酶体系产生０２·‘的基础上，建立了流动注射化学发光法测ＳＯＤ活性，流动相为含有５岬ｏｌ·Ｌ－１光泽精和Ｏ．３ｍｍｏｌ·Ｌ－１黄嘌呤的５０ｍｔｏｏｌ·Ｌ－１磷酸钾缓冲溶液（ｐＨ７．４）。
牛血清蛋白在１．１０００ｇ．ｍＬｏ的范围内不影响测定，可在３０ｓ内测定一份样品。
但样品中抗坏血酸等还原性物质会影响ＳＯＤ活性的测定。
Ｙａｏ等（ＹａｏＤｅｔａ１．，２００２）用ＤＭＳＯ和氯化四丁基铵（ＤＭｓ０一ＴＢＡＣ）溶液提取鼠不同组织中的超氧自由基，用鲁米诺加强化学发光反应检测。
由于其它的活性氧物质反应（ＲＯＳ）引起的背景干扰被降到了最小，实验达到了最佳检测条件。
用此体系评估了在中国用大量干腌肉喂养的鼠体内的超氧自由基的水平，评估结果在１０一．１０。
１ｔｏｏｌ·Ｌ．１之间，表明喂养干腌肉的鼠体内的超氧自由基的量比正常组的鼠要高的多，会引起组织损伤。
孙涛等（孙涛等，２００６）采用流动注射化学发光技术，在邻苯三酚自氧化体系体系中，优化了检测超氧阴离子自由基的方法，通过对测定条件的研究，得到了测定的最佳方案，证明了方法的可行性和重现性。
刘绪峰等（刘绪峰等，２００６）用化学发光法检测了Ｃ６０与吡咯烷衍生物对邻苯三酚自氧化产生的超氧阴离子的清除效果。
结果表明，其中的一种Ｃ６０羧酸衍生物能有效地清除０２·‘，并且有明显的量效关系。
（４）分光光度法
用捕获剂来捕获自由基，利用捕获剂的颜色发生变化，是光度法的基本原理。
计量吸光度的变化值而间接测得自由基的含量。
常用的自由基捕获剂有茜素紫、溴邻苯三酚红、ＭＴＴ、甲基紫、邻菲罗啉、胭脂红酸等。
光度法测定０２·‘可分为直接测定和间接测定两类。
常用的邻苯三酚自氧化法就是直接测定的一种，国内外多采用此法，也可简称为Ｍａｒｋｌｕｎｄ法。
Ｍａｒｋｌｕｎｄ法是采用４２０ｎｉ＇ｌｌ处光吸收测定。
酶活力定义为：在一定条件下１ｍＬ的反应液中，每分钟控制邻苯三酚在４２０ｎｌＴｌ波长的自氧化速率达到５０％
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