基层医院如何开展临床微生物检测

细菌的形态
细菌主要有三种形态，即球形、杆形、螺形。据 此将细菌分为三大类：球菌、杆菌、螺形菌。
球菌
1、双球菌 2、链球菌 3、葡萄球菌 如脑膜炎双球菌 如乙型溶血性链球菌 如金黄色葡萄球菌
脑膜炎奈瑟菌
链球菌
葡萄球菌
杆菌
单杆菌 如大肠杆菌 链杆菌 如炭疽芽孢杆菌 棒状杆菌 如白喉棒状杆菌 分枝杆菌 如结核分枝杆菌 球杆菌
E试条是一条5mm×50mm无孔试剂载体，一面固定有一系 列预先制备的浓度呈连续指数增长稀释抗菌药物，另一面有读数 和判别的刻度。抗菌药物的梯度可覆盖有20个MIC对倍稀释浓度 的宽度范围。将E试条放在细菌接种过的琼脂平板上，经孵育过 夜，围绕试条明显可见椭圆形抑菌圈，圈的边缘与试条交点的刻 度浓度即为抗菌药物抑制细菌的最小抑菌浓度，对照CLSI标准判 断其敏感、耐药、中介。
卫生部文件： 加强对抗菌药物临床应用的指导和监管
• 医疗机构要加强临床微生物检测与细菌耐药监测 工作
• 根据全国和本地区细菌耐药监测结果，结合本机 构实际情况，建立、完善抗菌药物临床应用与细 菌耐药预警机制，并采取相应的干预措施 • 各级地方卫生行政部门要逐步建立、健全本辖区 抗菌药物临床应用与细菌耐药监测管理体系 • 开展对医疗机构抗菌药物临床应用的评价和指导
菌落的肉眼观察
观察要点：菌落大小、颜色、溶血性、形态、表面光泽、 湿润或干燥等。 菌落大小：肠球菌、链球菌菌落小、肠杆菌科细菌菌落大 （与培养时间、营养状态亦有关系）； 颜色：PAE产绿色素、粘质沙雷菌菌落红色、SAU菌落金黄 色； 溶血性：α、β、γ 溶血； 形态：圆形、凸起、扁平、不规则锯齿形； 表面光泽：PAE具有特殊的金属光泽； 湿润/干燥：BCA菌落干燥易破碎、革兰阴性杆菌菌落湿润。
体系内应该包含但不限于以下内容： • 各级检验人员的职责和权限 • 实验室安全措施 • 各类标本采集和处理方法 • 细菌检验项目 • 培养基和试剂的配制方法 • 室内和室间质量控制
★ 操作体系应该每年进行一次评估，适时更新。
细菌鉴定基本知识
• 细菌形态结构-----显微镜下观察 • 菌落形态特征 • 如何利用生化反应鉴定细菌
◆质控菌株：
ATCC来源、室间质评来源。
药敏质控必备的三个菌株：
大肠埃希菌
铜绿假单胞菌
ATCC25922
ATCC27853
金黄色葡萄球菌
ATCC25923
标准化操作体系
应该建立一套微生物检测的标准化操作体系，其 参考资料可以来源于：《全国临床检验操作规程》、 《试剂盒说明书》、定期更新的CLSI文件等。
趋向性生化反应
氧化酶实验 触酶实验
阳性：大量气泡 阴性或弱阳性：无或少量气泡
阳性：紫红色
阴性：无色
（+） 氧化酶
大部分非发酵属细菌、弧菌属
（- ）
肠杆菌属、不动杆菌属、嗜麦芽寡养单胞菌
（+） 触酶 （- ）
葡萄球菌属
链球菌属、肠球菌属
有关抗菌药物敏感性实验的方法学！
• 常用方法：K-B法、微量稀释法、E-test法； • 操作步骤 • 注意事项
6.孵育后形成一椭圆形抑菌圈，抑菌圈和试条 的相交处的刻度即为抗菌药物对该菌的最低 抑菌浓度(MIC) 。
如何来确定常规报告的抗菌药物种类？
• 根据采用的方法学不同：K-B法、MIC法；
★不是所有种类细菌都能采用K-B法报告药敏结果； ★不是所有细菌都有明确的折点判断标准。
• 根据自己医院内使用的抗菌药物种类； • 由医院医务处、药学部、检验科微生物室共同 商讨制定。
◆葡萄球菌属：头孢西丁、青霉素、红霉素、万古霉素、环
丙沙星、庆大霉素；
◆肠球菌属：青霉素 、万古霉素 、四环素 、高浓度庆大 霉素、环丙沙星、氨苄西林； ◆不动杆菌属：头孢他啶 、亚胺培南、阿米卡星、头孢吡 肟 、米诺环素； ◆洋葱伯克霍德菌：头孢他啶 、米诺环素、甲氧苄啶/磺胺 异噁唑 ；
◆嗜麦芽窄食单胞菌：甲氧苄啶/磺胺异噁唑、左氧氟沙星、 米诺环素。
举例：
肺炎链球菌对苯唑西林的抑菌环 ≥20mm的菌株对青霉素亦敏感 (MIC≤0.06μg/ml)，并经临床证实可以认为 对氨苄西林、阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸、 氨苄西林/
舒巴坦、头孢克洛、头孢地尼、头孢吡肟、 头孢他美、 头孢克肟、头孢噻肟、头孢丙烯、头孢 布烯、头孢曲松、 头孢呋辛、头孢泊肟、头孢唑肟、厄他培南、亚胺培南、 氯碳头孢和美洛培南敏感，所以不需要再测定这
7.用无菌镊子或纸片分配器将抗菌纸片粘贴于M-H琼脂的表面， 一旦纸片贴上，不能移动；各抗菌纸片中 心距离应大于 24mm，纸片距平板内缘应大于15mm。
8.经过35℃16～24h孵育。
9.取抑菌环直径，根据CLSI标准，报告细菌对该 抗生素敏感(S)、耐药(R)、中介(I)。
E-TEST
原理：
需配备的设施条件、仪器设备
◆试剂： 接种标本用：哥伦比亚血平板、麦康凯平板、巧克力
平板、真菌显色平板、淋球菌平板等；
细菌鉴定用：氧化酶、触酶、靛基质、甲基红、VP、
枸橼酸盐、氨基酸脱羧酶、胆汁七叶苷、6.5%NaCL等；
药敏实验用：各种抗生素纸片、MH平板、HTM平板
等；
观察细菌形态用：革兰染液、抗酸染液。
• 涂片镜检： 初步判断细菌革兰染色阴、阳性，球菌、 杆菌、酵母菌等。
革兰阳性
革兰阴性
• 影响因素：涂片过厚将使脱色不完全，酒 精脱色时间过长将导致过度脱色；染液储 存过久由于蒸发而影响浓度，特别是碘液 久存或见光而形成碘酸，失去媒染作用； 95%酒精如果密封不佳易挥发，失去脱色 作用；细菌形态学检查以对数生长期的细 菌形态最为典型，菌龄过长易致阴性。
最重要的两个原因： 不断增加的细菌耐药性！ 促进抗生素的合理使用！
政策性文件
• 卫医发〔2004〕285号:卫生部关于施行<抗菌药物 临床应用指导原则>的通知 • 卫办医发〔2006〕133号：卫生部办公厅关于进一 步做好抗菌药物临床应用和细菌耐药监测工作的 通知 • 卫办医发〔2008〕48号: 卫生部办公厅关于进一 步加强抗菌药物临床应用管理的通知 • 卫办医发〔2008〕130号:卫生部办公厅关于加强 多重耐药菌医院感染控制工作的通知 • 卫办医政发〔2009〕38号：卫生部办公厅关于抗 菌药物临床应用管理有关问题的通知
如何开展临床微生物检测？
软硬件设施建立： ★人员素质 ★仪器设备 ★标准化的操作体系
人员素质
◆应该掌握临床微生物基本知识；
◆掌握细菌鉴定及药敏试验基本操作技能； ◆掌握常用培养基的配制； ◆ 熟悉微生物检验室内质量控制规则。
需配备的设施条件、仪器设备
◆设施条件： 符合生物安全的独立实验用房，分区设置 合理（样本处理区、无菌区、转种区）。 ◆仪器设备： 超净工作台（生物安全柜）、高压灭菌器、 普通培养箱、CO2培养箱（烛缸）、冰箱、 接种环、电热灭菌器（酒精灯）、光学显 微镜等。
结果报告的解释
• 敏感
是指分离菌株能被使用推荐剂量在感染部位 通常可达到的抗菌药物浓度所抑制。
• 中介
包括这些菌株，其抗菌药物 MIC 接近于血液 和组织中通常可达到的水平，而抗微生物药治疗 的反应率可能低于敏感株。“中介”分类意味着 药物在生理浓集的部位具有临床效力(如尿液中的 喹诺酮类和β-内酰胺类)或者可用高于正常剂量的 药物进行治疗(如β-内酰胺类)。
• • • • • •
• 菌落形态大小与培养时间长短、培养基种 类有关系； • 不同平板上相同的细菌具有不同的形态特 征； • 不同的细菌在相同的平板上也可以菌落形 态相似。
细菌 鉴定
• • • • • 涂片镜检 趋向性反应实验 根据不同种属细菌选择生化反应 根据主要的生化反应结果判定细菌种类 商品化的鉴定试剂条、细菌鉴定仪
纸片扩散法（Kirby-Bauer法）
原理：
将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试 菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼脂中 水分溶解后不断向纸片周围扩散形成递减的梯度 浓度，在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长 被抑制，从而形成无菌生长的透明圈即为抑菌圈。 抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感 程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关。
已经培养阳性的患者为何还要定期做重复的培养
由铜绿假单胞菌引起的严重感染，青霉素类药物若敏
感则需提高治疗剂量。对这种感染，用单一抗菌药物 常致临床治疗失败，应考虑增加体外对铜绿假单胞菌
有抗菌活性的第2种药物（如氟喹诺酮类、氨基糖苷
类） 长期应用喹诺酮类治疗过程中，葡萄球菌属可发展其 耐药性。因此，最初敏感的分离株在开始治疗3-4天 后可以变为耐药，应对重复分离株测试药敏试验。
5.盖上平板的盖子，放置培养箱内孵育，放 置3~10分钟后贴上标准抗生素纸片。
6.根据选择的菌株挑选相应的抗菌纸片。
◆肠杆菌科：氨苄西林、阿米卡星、哌拉西林/ 他唑巴坦、
头 孢噻肟、环丙沙星、亚胺培南、氨曲南、庆大霉素；
◆铜绿假单胞菌：头孢他啶、庆大霉素、哌拉西林、阿米卡
星、环丙沙星、头孢吡肟、亚胺培南；
操作方法 ： 1.将在约56℃恒温的无菌M-H琼脂倾注直径为90mm 的平板，其厚度 4mm。
2.无菌挑取孵育16～24h的血平板上4~5个菌落。
3.置于无菌生理盐水中，校正其浊度于McFarland No 0.5管。
4.用无菌棉签浸入细菌悬液中，将拭子在试管上壁轻轻挤压以 挤去过多的菌液。棉签在三个方向均匀抹琼脂表面（每次 转60℃）使菌液均匀分布，最后沿平板内缘涂抹一周。
些药。
随着用Ⅲ代头孢菌素治疗时间的延长，肠杆菌属、枸 橼酸杆菌属和沙雷菌属可发展为耐药。 最初分离的敏 感菌株在开始治疗3~4天内可变为耐药，因此对重复 分离菌株应重新进行药敏试验。 在长期用抗生素治疗过程中铜绿假单胞菌可能发生耐 药，因此，初次分离的敏感菌株在治疗3－4天后可能 发生耐药。测试重复分离菌株可能是必要的。
已经培养阳性的患者为何还要定期做重复的培养
基层医院如何开展临床微生物检测
襄阳市中心医院临床检验部微生物室 邹玖明
• 为什么要开展临床微生物检测？----必要性 • 如何开展临床微生物检测？----软硬件设施 建立！ • 细菌鉴定基本知识及技能！ • 有关抗菌药物敏感性实验的方法学！ • 保证检验质量的准确性！----质量控制
为什么要开展临床微生物检测？
结果报告的解释
• 耐药
是指分离菌株不被常规剂量用药通常可 达到的药物浓度所抑制，和/或证明抑菌环 直径落在可存在某些特定的微生物耐药机 制范围(如β-内酰胺酶)，并且治疗研究显示 药物对分离菌株的临床疗效不可靠。
关于药敏报告！
• 不是所有的抗生素都需要做药敏实验，可 以根据已报告的某种药物进行推定； • 3天之内的同患者同部位重复分离株可以不 用重复进行药敏试验，但除这期间外的重 复分离株必须再次测定。
• 不同杆菌的大小、长短、粗细很不一致。
大 中 小
炭疽芽胞杆菌 3-10 μ m
大肠埃希菌 2-3 μ m
布鲁菌 0.6-1.5 μ m
杆菌的形态多样
两端齐平 两端尖细
炭疽芽胞杆菌
白喉棒状杆菌
• 掌握细菌的镜下形态结构对于细菌鉴定很 重要！ • 某些特殊细菌的直接镜检报告对于临床疾 病具有诊断意义！如：抗酸染色、分泌物 涂片查革兰阴性双球菌。 • 血液、脑脊液的阳性培养需要即时报告细 菌的革兰染色结果，根据细菌的染色性、 排列方式、形态可以初步区分种类。
操作方法：
1.挑取16～20h的菌落 2.用无菌生理盐水制备成0.5麦氏比浊管浊度的菌 液。
3.用无菌棉签浸入细菌悬液中，将拭子在试管上壁轻轻挤 压以挤去过多的菌液。棉签在三个方向平均涂抹琼脂表 面（每次转60℃）使菌液均匀分布，最后沿平板内缘涂 抹一周。
4.用镊子将E-TEST试条的抗菌药物的一面贴向琼脂表面，有刻度的 一面向外，直径140mm的平板可放置6条，9mm平板只能放置 1～2试条 。 5.孵育，置平板于35℃孵育16～24h。
抗生素的中国式滥用！
一个鲜明的对比： 医院抗菌药物年使用率 74% 中国
•
VS
22%~25% 美英等发达国家
-----2006-2007年度卫生部全国细菌耐药监测
★世界上没有哪个国家如此大规模地使用抗生素★
Байду номын сангаас
＊中国的住院患者中抗生素的使用率高达70%，其中外科患者几乎人人都用抗 生素，比例高达97%。