第五章指纹图谱

●流出组分可以收集
●采用多种检测器，可同时获 取保留值信息和化合物的光谱、 质谱信息
诃子指纹图谱
I II III 诃 子 小诃子
大诃子
绒毛诃子
（1） 紫外可见分光光度法和红外光谱法 这两种方法能够给出药效物质基础的结构信 息，但所给出的信息是所有化学物质结构结构信息 的加和，不具备指纹特征，但可作为中药指纹图谱 研究的辅助方法。
一、样品收集
1. 最关键的步骤
2. 10批以上 3. 原药材 ：不同产地、不同采收季节等
真实性 代表性
二、供试品溶液制备
原则
1. 确保中药中的主要化学成分或有效成分在
图谱中得以体现 2. 所含成分的理化性质和检测方法
二、供试品溶液制备
1.原药材、饮片供试品溶液的制备 目的：①考察药材本身质量情况， ②考察制剂和原药材的相关性。
与标准 指纹图 谱相比
第四节 中药指纹图谱分析与评价
标定共有指纹峰，确定参照峰
计算各共有峰的相对保留时间、峰面积比
给出标准（对照）指纹图谱及数据 非共有峰总面积不得大于总峰面积的10％
第四节 中药指纹图谱分析与评价
• 基本参数的概念 共有指纹峰：
多个样品中所具有的相同相对保留值的色谱峰。
重叠率：
♦ 液相色谱 ● 色谱柱：比较试验加以选择
流动相：至少用三种不同组成比较
流动相 1
流动相 2
流动相 3
适宜的柱温和检测波长
15 203
20
210
25
236
30
254
35
365
五、方法学验证
1. 稳定性试验
供试品溶液的稳定性
表3 川芎指纹图谱稳定性试验相似度计算结果（n=5）
对照指纹图谱 S1 S2 S3 S4 S5
特点与问题 中药 药材 饮片 提取物 中成药
来源于生物，化 学成分变化大
化学成分复杂， 有效成分尚未阐 明 多成分、多靶点 作用 种植技术与生产 过程控制水平差
单指标或少数 指标定性、 定量分析
？
特征图谱鉴别
指纹图谱整体 成分控制
药品
质量一致性
生物等效性 使用安全性
●具有色彩参数，可获得色彩丰富 的色谱图像，直观性强；同时辅以 功能团显色剂还可提示成分的类别， 提高鉴别的专属性。
TLC举例：区分不同品种
TLC举例：监控工艺
气相色谱
Gas Chromatography (GC)
●分离效能高 ●分析速度快 ●适用于植物的挥发油成分 及其它易挥发性成分或可转 化为可挥发的成分测定 ●可提供保留值信息，与质 谱联用，还可提供更丰富的 化学结构信息
（1） 紫外可见分光光度法和红外光谱法
操作简便（不需要复杂的提取 仪器）、快速、准确、经济、 溶剂低毒、重复性高、实用性 强。 ●几乎所有的物质都有特征 的红外光谱。
●虽然植物中药提取物还是一
个混合物，但是由于不同物 质的红外光谱具有加合性， 因此，植物中药提取物的红 外光谱能反映出所有成分的 综合信息因而具有全息光谱 的特点。
红外光谱图
小蓟丁酮提取物的红外 指纹图谱
• 中国药典规定：小 蓟在开花时采。 • 根据1384cm-1处 吸收峰的有无，可 以鉴别其采集时间 是否正确。
质谱（ＭＳ）
• 按照带电粒子的质荷比（ｍ／ｚ）和其相 对丰度大小排列组成图谱。 • 中药特征提取物置质谱仪中进行轰击裂解 为不同的碎片，获得提取物中化学成分的 MS图，不同中药由于所含化学成分的种类 及组成比例的不同，所得质谱图中分子离 子峰和碎片离子峰亦不一致。
尽可能与生产工艺的提取溶剂接 近或一致定量操作进行
二、供试品溶液制备
2. 半成品/中间体供试品溶液的制备 参考制剂和产品制备工艺 制备方法必须确保提取物或中间体中主要化学成 分在指纹图谱中得以体现，取样与原药材编号一致 或有明确关联，保证数据可追溯。
二、供试品溶液制备
3. 中药制剂供试品溶液的制备 目的：控制最终产品中成分，保证批之间的稳定性， 确保质量。 溶液制备：直接使用、稀释或溶剂提取的方式 复方制剂成分类别差别大，分析条件要求不同，样 品预处理需分别进行，便于获得2张或2张以上的图
HPCE, CE/MS 光谱技术 UV IR
波谱技术 MS NMR X-射线衍射法 分子生物学技术
薄层色谱
●可在同板同时分析多达18个样品， ●展距局ห้องสมุดไป่ตู้在 10cm~20cm ，‘柱效’ 时效高 相对较低，对复杂组分 ●所用的是正相展开剂，其组成变 不提高分离度则难以提 化灵活，可适应多种成分的分离 取指纹特征的药材受到 限制。 ●离线操作，即可直观比较图谱， 又可扫描得到轮廓图和处理数据 ●开放系统，对环境温 度、相对湿度要求较高 ●占机时间短
0.997 0.996 0.991 0.990 1.000 0.994
0.998 0.999 0.999 0.999 0.994 1.000
五、方法学验证
2.精密度试验 考察仪器的精密度n=5 峰面积比值 RSD 不大于3％
±
保留时间：平均相对保留时间±1min
五、方法学验证
3. 重复性试验 实验方法的重复性
峰面积比值的要求： 保留时间小于或等于30分钟的共有峰：
Ai≥20％At：SD≤±20％； 20％At>Ai≥ 10％At：SD≤±25％； 10 ％At>Ai≥ 5％At：SD≤±30％； Ai<5％At：峰面积比值不作要求，但必须标定相 对保留时间。 Ai ≥ 10％At：按上述规定执行； Ai < 10％At：峰面积比值不作要求，但必须标 定相对保留时间。
第二节中药指纹图谱研究程序及技术要求
固定产地、采收期 和加工炮制的中药 代表性 均一性 10批以上中药 预处理
选择测试条件 测定图谱参数
中药未 知检品
图谱测试、相似度评价 方法检验
评价标准
药效学试验
相关性
图 谱 评 价
供试品溶液
方法建立考察
中药指纹图谱
图谱信息 图谱分析
不同产地、采收期 和加工炮制的中药
指纹图谱中应包含的信息
1. 对于中药材和中药饮片：种的共性，用药 部位的共性，产地的个性，采收期、炮制 方法的个性信息。 2. 对于半成品和中药制剂：原药材（甚至辅 料）的信息；工艺信息等。 3. 药效信息：药效信息。
中药指纹图谱构建方法
TLC
色谱技术
HPLC, LC/MS
GC, GC/MS
色谱指纹图谱
保留时间超过30分钟的共有峰：
非共有峰面积
供试品图谱与指纹图谱比较，非共有 峰总面积不得大于总峰面积的5％。
例：银杏提取物EGB761
• EGB761中含总黄酮成分24%，萜类内酯6%， 原花青素类7.0% ，羧酸类成分13.0%，儿茶 素类2.0%，非黄酮类苷类20%，高分子化合 物4.0%，无机物5.0%，水分溶剂3.0%，其 他3.0%。
谱。
三、对照品（参照物）溶液制备
1. 参照物的选择 ①道地药材/饮片 半成品 制剂 通常为主要成分 主要活性成分或指标成分
考察指纹图谱的稳定程度和重现性，有助于指纹 图谱确认。
②内标物 2. 合适溶剂
四、指纹图谱实验研究
原则： 专属性、重现性、普遍适用性 • 试验方法:首选色谱法 • 试验条件：建立最佳色谱条件，要使 供试品中所含成分尽可能获得分离， 为中药的指纹图谱评价及其品质鉴定 提供依据。
• 分辨率高，得到的 色谱组份非常复杂， 尤其是含挥发油药材， 单萜类成分组成很不 稳定，样品间差异可 能很大，处理数据和 判别相似度时一定程 度的取舍
肉桂油的气相色谱指纹图谱
羌活GC指纹图谱
独活GC指纹图谱
毛细管电泳
Capillary Electrophoresis
●分离效能高
●分析速度快 ●高分辨率
• 有害成分银杏酸类≤5ppm
银杏叶提取物指纹图谱
芦丁
银杏叶提取物及制剂指纹图谱
小结
• 中药指纹图谱是一种量化的鉴别手段。
• 指纹图谱必须符合整体性、特征性、稳定 性、关联性的基本要求。 • 指纹图谱与药效相结合才有现实意义。
• 特征指纹峰的含量测定结合指纹图谱是理 想的质量控制模式。
S1 S2 S3 S4 S5 对照指纹图谱
1.000 0.997 0.995 0.995 0.997 0.998
0.997 1.000 0.998 0.997 0.996 0.999
0.995 0.998 1.000 0.998 0.991 0.999
0.995 0.997 0.998 1.000 0.990 0.999
六、指纹图谱的建立和辨认
1. 要求“准确的辨认”而不是“精密的测量”； 2. 比较供试品与对照品的色谱指纹图谱要求“相似” 而不是“相同”。 • 评价色谱比较的结果，是根据其模糊属性，着眼 于宏观的规律性的特征分析，即着重辨认完整色 谱的“图貌”，而不是求索细枝末节。
六、指纹图谱的建立和辨认
1. 直观分析比较：看一看 2. 量化数据比较：算一算（重叠率，相似率等） 计算机辅助相似度评价
没有完全达到基线分离者，计算该组峰的总峰面积
作为峰面积，同时标定改组各峰的相对保留时间。
有关技术参数的计算公式
（1）相对保留时间RTR TR（i） RRT（i）=
TR（S）
TR（i）各色谱峰的保留时间；TR（s）参考峰的保留时间 （2）积分相对比值RA A（i） RA= A（s） A（i）为各色谱峰积分面积； A（s）为参考峰积分面积。
中药指纹图谱的含义 中药经适当处理后，采用一定的 分析手段，得到的能够标示该中 药特征的共有峰的图谱。
中药指纹图谱的特性
能反映中药 有效部位所 含大部分成 分的种类， 或指标成分 的全部 能特征地区 分中药的真 伪与优劣
稳定性（重现性）
在规定的方法与条件下，不同的操作者和 不同的实验室应能重复
第一节 概述 建立中药指纹图谱检测标准的必要性
●可与紫外、荧光、电化学、质 谱、拉曼光谱等联用，可提供更 丰富的化学结构信息
H P C E 指 纹 图 谱
反相高效液相色谱 (RP-HPLC)
●适用范围广 对较为复杂的色谱实 验条件要求比较苛刻，由 此带来不同实验室之间重 现性的难度增大
●分离性能好
●分析速度快 ●流动相选择范围宽 ●灵敏度高 ●色谱柱可多次重复使用
定性依据，为中药品种鉴定提供了可靠证据。 n强峰： 占总峰面积的70%以上，峰数1/5-1/3 反映了主要成分的含量，评价中药质量的重要信息和依据。 特征指纹峰：
色谱法中共有指纹峰具体规定：
相对保留时间的计算 外标法：对照品为参照物，以参照物的峰面积作为1
内标法：以共有峰中A值较大，较稳定的峰面积为1
重叠率和相似率计算
重叠率=
共有峰数×2
×100% 指纹图谱峰数+供试品峰数
重叠率和相似率计算
供试品图谱中特征指纹峰面积 ×100% 特征指纹峰相似率= 指纹图谱中特征指纹峰面积
中药注射剂指纹图谱的评价 以指纹图谱相似度评价软件评价 中间体和注射剂指纹图谱的相似度应不低 于0.90。 以色谱峰面积的比值评价
Fingerprints of Chinese Materia Medica
第五章 中药指纹图谱
第一节 概述 指纹图谱的起源与发展
指纹图谱技术应用于植物药质量控制，是从 20 世纪 70 年代，色谱技术的发展，人们大量采用薄层色谱（ TLC ）方法，将植物中化学成分展载于由各种担体铺成 的薄层板上。根据薄层板上的斑点的位置、斑点大小、 斑点颜色、斑点数目的多少进行定性鉴别，这种薄层鉴 别方法具备了指纹图谱的特征。
X射线衍射法（XRD）及核 磁共振法（NMR）
• 这两种方法能给出药效物质基础的结构信 息，部分信息也可能与特定化学成分直接 关联。但该两种方法所使用的仪器在国内 尚未普及，不适应该方法的应用与推广。 在中药指纹图谱研究过程中不建议采用X射 线衍射法及核磁共振法。
生物学方法
1. DNA指纹图谱： 用于中药真伪、品种及种质资源的鉴定。 2 .基因组学指纹图谱： 用以阐明中药作用的个体差异和特定基因的作用模 式。 3.蛋白组学指纹图谱： 全面提供中药负杂物质基础的大量信息，同时还能 提供量效的相关信息，具有鉴定和研究的双重作 用，对于制剂可以确定该制剂的主要活性物质。
±
n=5
峰面积比值 RSD 不大于3％
保留时间：平均相对保留时间±1min
注意事项
1. HPLC和GC指纹图谱：记录时间一般为1h； 2. TLC指纹图谱：须提供从原点至溶剂前沿的 图谱； 3. 光谱方法制定指纹图谱：必须按各种光谱的 相应规定提供全谱。 4. 对于化学成分类型复杂品种，必要时可建立 多张指纹图谱。