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体内药物分析 课件
本章内容提要
第四章 分析方法的建立与验证
分析方法的设计依据 分析方法建立的一般步骤 分析方法验证的内容与要求 体内药物分析应用示例
15.01.2021
体内药物分析
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第四章 分析方法的建立与验证 第一节 分析方法的设计依据
二、分析测定的目的与要求
体内药物分析的目的——影响分析方法的应用
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体内药物分析
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第四章 分析方法的建立与验证
第二节 分析方法 建立的一般步骤
一、分析方法的选择 二、分析方法的建立
(一) 检测条件的筛选 (二) 分离条件的筛选
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体内药物分析
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一、分析方法的选择
第四章 分析方法的建立与验证 第二节 分析方法的建立步骤
体内药物分析方法的设计
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体内药物分析
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1．空白溶剂试验
第四章 分析方法的建立与验证 第二节 分析方法的建立步骤
待测药物的非生物基质溶液（通常为水溶液） ——采用拟定的分析方法进行衍生化反应、萃取分离等 样品预处理（反应试剂、衍生化试剂、萃取溶剂等） ——测定响应信号（如HPLC峰面积或峰高）
考察目标 ——方法的特异性 ——空白值应尽可能小，并能有效校正
药代动力学——研究药物在体内吸收、分布、代谢和排泄过程 ——血浆浓度随时间的变化过程；代谢途径及代谢产物
要求 ——同时测定原形药物和代谢产物 检测 ——宽线性范围(Cmax～Cmax的1/20)、高灵敏度(10-9g/ml)和高专属
性(分离能力)(原形药物及其代谢产物的分离) 方法 ——不必强调方法的简便、快速；
分析方法的建立和验证过程——是不可截然划分的 ——为便于讨论而分别叙述
分析方法的建立步骤 ➢ 第一步：检测条件的筛选 ➢ 第二步：分离条件的筛选
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体内药物分析
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(一)检测条件的筛选
第四章 分析方法的建立与验证 第二节 分析方法的建立步骤
标准物质 —— 照拟定的分析方法(不包括生物基质的预处理)测定
——需经化学反应的预处理过程，若预处理过程仅为生物样品 的提取分离，则可不进行该步骤，直接进行空白生物基质试验
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2. 空白生物基质试验
第四章 分析方法的建立与验证 第二节 分析方法的建立步骤
空白生物基质 (blank biological matrix) ——如空白血浆 ——照 “1. 空白溶剂试验” 项下方法操作
➢ 分析方法建立之前
查阅文献资料——充分了解药物在体内的动力学过程，使所 拟定的分析方法
——避免受到代谢产物的干扰适用于实际生物样品测定
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二、分析方法的建立
第四章 分析方法的建立与验证 第二节 分析方法的建立步骤
➢ 初步拟定分析方法后 进行一系列试验工作——选择最佳分析条件 同时验证分析方法的可行性——确认是否适用于实际生物样品
—— 确定最佳分析检测条件(如色谱条件)和检测灵敏度
HPLC —— 调整检测器(类型、条件)
色谱柱(型号、牌号、填料性状与粒经、柱长度)
流动相(组分及其配比)及其流速
柱温、进样量、内标物质的浓度及其加入量等
—— 使各物质具有足够的方法灵敏度(LOQ)
良好的色谱参数(n、R、T)
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适当的保留时间(tຫໍສະໝຸດ Baidu)
生物样品中的药物浓度——决定分析方法的首要因素 生物样品中药物或其特定代谢产物的浓度低、样品量少
——难以通过增加取样量提高方法灵敏度 ——通过选择适当的分析方法适应样品分析需求 体内药物分析中常用分析方法——特点见表4-1
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二、分析方法的建立
第四章 分析方法的建立与验证 第二节 分析方法的建立步骤
以血浆或血清为分析样品 采用蛋白沉淀-溶剂萃取预处理技术 ——分析样品较为“干净”，可用HPLC检测
用RIA分析 ——样品的预处理方法可较为粗放 ——经过简单的蛋白沉淀或不经任何预处理直接测定
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四、实验室条件
第四章 分析方法的建立与验证 第一节 分析方法的设计依据
在设计体内药物分析方法时，还应充分考虑 到实验室现有的或有可能在其它实验室使用的仪 器装备，合理选择可行的分析方法。
中毒患者的临床抢救 药物浓度极高
方法——不必强调方法的灵敏度，强调方法的特异性和分析速度 ——大多采用色谱及其联用技术GC、GC-MS、RIA或EIA
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第四章 分析方法的建立与验证 第一节 分析方法的设计依据
三、生物样品的类型与预处理方法
生物样品的类型与预处理方法——决定分析方法的应用
体内药物分析
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(二)分离条件的筛选
第四章 分析方法的建立与验证 第二节 分析方法的建立步骤
在进行分离条件筛选时，应考察生物基质中的内源性物质及代谢 产物对分离与检测的干扰，步骤如下：
1．空白溶剂试验 ——溶剂(方法特异性) 2．空白生物基质试验 —— endogenous compounds(方法特异性) 3．模拟生物样品试验 —— 方法效能指标 4．实际生物样品测试 —— 代谢产物(方法特异性)
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色谱分析法
第四章 分析方法的建立与验证 第二节 分析方法的建立步骤
——可通过改变反应条件、萃取方法或萃取条件（萃取溶剂的 极性、混合溶剂的配比，固相萃取填料性质、冲洗剂与洗脱剂及其用 量等），甚至检测器类型
——空白试剂信号应不干扰药物的测定（如R＞1.5） 本步骤主要考察
考察目标 ——生物基质中内源性物质对测定的干扰（方法特异性）
——在待测药物(或特定的活性代谢物、内标物质等)的“信号窗” （信号附近的有限范围）内不应出现内源性物质信号
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3. 模拟生物样品试验
第四章 分析方法的建立与验证 第二节 分析方法的建立步骤
——大多采用色谱及其脱线或在线联用技术，如HPLC、LC-MS
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第四章 分析方法的建立与验证 第一节 分析方法的设计依据
二、分析测定的目的与要求
临床治疗药物监测 有效治疗浓度范围内药物浓度
方法——尽量简便、易行；适用于长期、批量样品的测定 ——大多采用UV、RIA或EIA等
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第四章 分析方法的建立与验证
分析方法的设计依据 分析方法建立的一般步骤 分析方法验证的内容与要求 体内药物分析应用示例
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第四章 分析方法的建立与验证 第一节 分析方法的设计依据
二、分析测定的目的与要求
体内药物分析的目的——影响分析方法的应用
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第二节 分析方法 建立的一般步骤
一、分析方法的选择 二、分析方法的建立
(一) 检测条件的筛选 (二) 分离条件的筛选
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一、分析方法的选择
第四章 分析方法的建立与验证 第二节 分析方法的建立步骤
体内药物分析方法的设计
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1．空白溶剂试验
第四章 分析方法的建立与验证 第二节 分析方法的建立步骤
待测药物的非生物基质溶液（通常为水溶液） ——采用拟定的分析方法进行衍生化反应、萃取分离等 样品预处理（反应试剂、衍生化试剂、萃取溶剂等） ——测定响应信号（如HPLC峰面积或峰高）
考察目标 ——方法的特异性 ——空白值应尽可能小，并能有效校正
药代动力学——研究药物在体内吸收、分布、代谢和排泄过程 ——血浆浓度随时间的变化过程；代谢途径及代谢产物
要求 ——同时测定原形药物和代谢产物 检测 ——宽线性范围(Cmax～Cmax的1/20)、高灵敏度(10-9g/ml)和高专属
性(分离能力)(原形药物及其代谢产物的分离) 方法 ——不必强调方法的简便、快速；
分析方法的建立和验证过程——是不可截然划分的 ——为便于讨论而分别叙述
分析方法的建立步骤 ➢ 第一步：检测条件的筛选 ➢ 第二步：分离条件的筛选
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(一)检测条件的筛选
第四章 分析方法的建立与验证 第二节 分析方法的建立步骤
标准物质 —— 照拟定的分析方法(不包括生物基质的预处理)测定
——需经化学反应的预处理过程，若预处理过程仅为生物样品 的提取分离，则可不进行该步骤，直接进行空白生物基质试验
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2. 空白生物基质试验
第四章 分析方法的建立与验证 第二节 分析方法的建立步骤
空白生物基质 (blank biological matrix) ——如空白血浆 ——照 “1. 空白溶剂试验” 项下方法操作
➢ 分析方法建立之前
查阅文献资料——充分了解药物在体内的动力学过程，使所 拟定的分析方法
——避免受到代谢产物的干扰适用于实际生物样品测定
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二、分析方法的建立
第四章 分析方法的建立与验证 第二节 分析方法的建立步骤
➢ 初步拟定分析方法后 进行一系列试验工作——选择最佳分析条件 同时验证分析方法的可行性——确认是否适用于实际生物样品
—— 确定最佳分析检测条件(如色谱条件)和检测灵敏度
HPLC —— 调整检测器(类型、条件)
色谱柱(型号、牌号、填料性状与粒经、柱长度)
流动相(组分及其配比)及其流速
柱温、进样量、内标物质的浓度及其加入量等
—— 使各物质具有足够的方法灵敏度(LOQ)
良好的色谱参数(n、R、T)
15.01.2021
适当的保留时间(tຫໍສະໝຸດ Baidu)
生物样品中的药物浓度——决定分析方法的首要因素 生物样品中药物或其特定代谢产物的浓度低、样品量少
——难以通过增加取样量提高方法灵敏度 ——通过选择适当的分析方法适应样品分析需求 体内药物分析中常用分析方法——特点见表4-1
15.01.2021
体内药物分析
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二、分析方法的建立
第四章 分析方法的建立与验证 第二节 分析方法的建立步骤
以血浆或血清为分析样品 采用蛋白沉淀-溶剂萃取预处理技术 ——分析样品较为“干净”，可用HPLC检测
用RIA分析 ——样品的预处理方法可较为粗放 ——经过简单的蛋白沉淀或不经任何预处理直接测定
15.01.2021
体内药物分析
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四、实验室条件
第四章 分析方法的建立与验证 第一节 分析方法的设计依据
在设计体内药物分析方法时，还应充分考虑 到实验室现有的或有可能在其它实验室使用的仪 器装备，合理选择可行的分析方法。
中毒患者的临床抢救 药物浓度极高
方法——不必强调方法的灵敏度，强调方法的特异性和分析速度 ——大多采用色谱及其联用技术GC、GC-MS、RIA或EIA
15.01.2021
体内药物分析
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第四章 分析方法的建立与验证 第一节 分析方法的设计依据
三、生物样品的类型与预处理方法
生物样品的类型与预处理方法——决定分析方法的应用
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(二)分离条件的筛选
第四章 分析方法的建立与验证 第二节 分析方法的建立步骤
在进行分离条件筛选时，应考察生物基质中的内源性物质及代谢 产物对分离与检测的干扰，步骤如下：
1．空白溶剂试验 ——溶剂(方法特异性) 2．空白生物基质试验 —— endogenous compounds(方法特异性) 3．模拟生物样品试验 —— 方法效能指标 4．实际生物样品测试 —— 代谢产物(方法特异性)
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体内药物分析
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色谱分析法
第四章 分析方法的建立与验证 第二节 分析方法的建立步骤
——可通过改变反应条件、萃取方法或萃取条件（萃取溶剂的 极性、混合溶剂的配比，固相萃取填料性质、冲洗剂与洗脱剂及其用 量等），甚至检测器类型
——空白试剂信号应不干扰药物的测定（如R＞1.5） 本步骤主要考察
考察目标 ——生物基质中内源性物质对测定的干扰（方法特异性）
——在待测药物(或特定的活性代谢物、内标物质等)的“信号窗” （信号附近的有限范围）内不应出现内源性物质信号
15.01.2021
体内药物分析
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3. 模拟生物样品试验
第四章 分析方法的建立与验证 第二节 分析方法的建立步骤
——大多采用色谱及其脱线或在线联用技术，如HPLC、LC-MS
15.01.2021
体内药物分析
7
第四章 分析方法的建立与验证 第一节 分析方法的设计依据
二、分析测定的目的与要求
临床治疗药物监测 有效治疗浓度范围内药物浓度
方法——尽量简便、易行；适用于长期、批量样品的测定 ——大多采用UV、RIA或EIA等