G418筛选tzmbl细胞适宜浓度实验
G418原理及筛选方法
G418原理及筛选方法原理分析转化得功能与表达需要DNA稳定转染至宿主细胞染色体。
外源基因进入细胞后，部分能够通过细胞质进入细胞核内,根据细胞类型，至多80%得进入核内得外源DNA得到瞬时表达。
极少数情况下，进入细胞得外源DNA通过系列非同源性分子间重组核连接，最终整合进细胞染色体。
细胞基因组自由部分表达，所以整合并不一左意味着表达，只有整合到表达区得基因才会表达,而且整合到不同得染色体区段得外源基因得表达得量也就是不同得。
由于摄取、整合、表达外源基因就是小概率事件，通常根据新表型筛选軽軽体。
一般情况下这种新表型由共转染得编码抗生素抗性基因提供。
细菌Tn5转座子序列（ne。
抗性基因）携带得氨基糖昔磷酸转移酶可以将G418转变成无毒形式。
G418就是一种氨基糖类抗生素，其结构与新霉素、庆大靈素、卡那靈素相似，它通过影响80S 核糖体功能而阻断蛋白质合成，对原核与真核等细胞都有毒性，包括细菌、酵母、植物与哺乳动物细胞，也包括原生动物与蠕虫。
就是稳定转染最常用得选择试剂。
当neo基因被整合进真核细胞基因组合适得地方后，则能启动neo基因编码得序列转录为niRNA,从而获得抗性产物氨基糖昔磷酸转移酶得高效表达,使细胞获得抗性而能在含有G418得选择性培养基中生长。
G418得这一选择特性，已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上0418有杀菌作用, 所以有人主张转染时不加英它抗生素。
英实G418本身有很好得杀菌效果，在用G418进行筛选得过程中很少会发生污染。
但有一点，其实我觉得问题也不就是很大，那就就是:在老外得一本实验手册中提到，在脂质体转染时所用培养基中最好不加任何抗生素。
我想她得想法可能就是脂质体对细胞膜有影响,可能此时加抗生素对细胞损伤较大。
因为庆大离素、链鑫素.0418 均就是氨基糖貳类药物，其药理作用完全一样。
G418筛选TZMBL
建立细胞系所用G418 浓度的确定将TZM-bl细胞以1×103个细胞/孔的密度接种到96孔板中。
24 h后，分别用含有100 μg/mL、200 μg/mL、300 μg/mL……1 000 μg/mL G418的DMEM培养细胞。
2~3天更换新鲜培养基，培养2周，选择细胞全部死亡的最低G418浓度作为细胞筛选的浓度。
最终确定筛选用G418浓度为800 μg/mL。
在做稳定克隆筛选之前，一定要做细胞的梯度敏感实验。
通常用100、200、300、400、500、800 ug/ml六种梯度筛选之前确定G418浓度：1，由于每种细胞对G418 的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。
2，G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。
neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素和G418。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。
3，汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%4，G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。
具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。
一个具体试验：3*106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h 后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。
理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。
筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。
最全的G418筛选稳定表达细胞系总结1
最全的G418筛选稳定表达细胞系简介G418是一种广谱抗生素，可以选择性地杀死没有正确整合的质粒DNA转染的细胞，从而筛选出具有稳定表达的细胞系。
G418筛选是基因转染中常用的一种选择方法，通过对G418敏感性的筛选来选择转化基因。
本文将G418筛选步骤和优化方案。
G418筛选步骤细胞株选取首先需要选取稳定转染所需的细胞株。
需要保证选取的细胞株生长健康、分裂正常、易于培养以及不易死亡。
常用的细胞株有293T、CHO、HEK293。
转染在开始筛选之前，需要将目的基因转染进入所选细胞株。
目前常用的转染方法有磷酸钙共沉淀法、电转染法和脂质体转染法等，需要根据实际情况选择转染方法。
初步筛选完成转染后，需要在培养基中加入G418，通常的加药浓度不超过1mg/mL，推荐浓度为400μg/mL。
在转染后24-48小时内开始进行初步筛选，通过观察细胞的生长状态以及基因表达情况来判断筛选效果。
细分筛选初步筛选后，需要将G418的浓度逐步增加，通常第二轮加药浓度是初步筛选浓度的2倍，第三轮加药浓度是第二轮的2倍。
逐渐递增药物浓度，可以让敏感的细胞死亡，生存的细胞逐渐表达目的基因，从而得到稳定的细胞株。
稳定维持筛选到稳定的细胞后，需要对细胞进行定期维护。
通常可以在培养基中加入适当的G418浓度，维持稳定表达的转染细胞。
优化方案药物浓度G418的加药浓度直接影响到细胞死亡率和筛选效果。
在进行筛选前需要先进行剂量反应实验，通过不同浓度药物的处理，检测细胞生长状态和基因表达情况。
细胞密度传统细胞密度在98%时，死亡率是最高的。
因此，为了降低G418对细胞的毒性，可以将细胞密度控制在70-80%左右。
同时，过稀的细胞密度也会影响到筛选效果，因此需要根据实际情况进行调整。
培养时间筛选时间也直接影响到G418对细胞的毒性程度和筛选效果。
不同的细胞株和实验条件下，对筛选时间的选择有所不同。
通常初步筛选时间在24-48小时，细分筛选筛选时间需要根据实际情况进行判断。
G418筛选转染克隆的注意事项
G418筛选转染克隆的注意事项G418作为稳定转染通用的一种筛选方式，在进行筛选前应该要注意几点：1. G418的浓度：G418是一种氨基糖苷类似物，它通过干扰核糖体功能来阻止哺乳动物细胞蛋白质的合成。
因此在筛选过程中G418的浓度将对转染细胞的筛选产生很大的影响。
在筛选之前最好进行条件优化确定最佳筛选浓度。
尽管文献有报道筛选浓度，最好还是要自己亲自做一下筛选浓度的确定。
2. 细胞状态：细胞状态会影响对药物的敏感性。
可以通过常规的培养步骤保持转染铺板前的细胞健康。
每周传代一到两次，稀释程度使得下次传代前细胞几乎融合。
不要使细胞保持融合超过24小时。
3. 细胞维护：根据培养基的颜色和细胞生长情况，定期更换新鲜培养基。
4. 其他抗生素的使用：对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是G418抗生素的竞争性抑制剂。
在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。
这样，在转染前也不必润洗细胞。
5. 细胞保存：细胞培养在实验室中保存数月和数年后会经历突变，总染色体重组或基因调控变化等而演化。
如果随时间发现这种变化，一管保存的新鲜的细胞可能会恢复原先的活性。
比如，新鲜融化的NIH 3T3细胞比传代8次的细胞表现出更高的转染效率。
融化细胞的进一步传代并没有降低转染效率。
因此，如果观察到细胞活性降低，可以试着复苏新鲜培养的细胞以恢复最佳结果。
一、筛选曲线的建立1. G418的配制：取G418共1g溶于1mol/L的HEPES溶液1ml 中，加蒸馏水至10ml，过滤除菌，4℃保存；2. 细胞培养：取待测培养细胞，制备成细胞悬液，按等量接种入多孔培养板中，培养6h左右开始加药；3. 制备筛选培养基：在100~1000ug/ml范围内确定几个梯度，比如先做个100、400、800、1000ug/ml，按梯度浓度用培养基稀释G418制成筛选培养基；4. 加G418筛选：吸除培养基，PBS洗涤一次，每孔中加入不同浓度的筛选培养基；5. 换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，每隔3~5d更换一次筛选培养基；6. 确定最佳筛选浓度：在筛选10~14d内能够杀死所有细胞的最小G418浓度即为最佳筛选浓度。
G418筛选
从G418筛选，转染到xx化的总结筛选之前确定G418浓度：1.由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。
2.G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。
neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素和G418。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。
3.汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%4.G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。
具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。
一个具体试验：3*106个细胞电转后，分别接种，，细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时细胞孔内大约50%汇合度。
理论上孔内应有4%的汇合度。
筛选9天后，观察孔内有两三个克隆，按比例孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。
加药时间和维持浓度1.由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。
所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。
随着细胞的代谢G418的浓度和活性都回下降，所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。
这时药物浓度可以降至200ug/ml。
2.加抗生素的时机，主要是考虑插入到细胞基因组的抗性基因是否已经得到表达。
一般是转染48小时后加入抗生素。
g418筛选细胞原理
g418筛选细胞原理一、引言在生物学研究中，细胞是一个非常重要的研究对象。
为了更好地理解细胞的功能和特性，科学家们经常需要筛选出特定类型的细胞。
本文将重点介绍一种常用的细胞筛选方法，即使用g418进行筛选的原理。
二、g418的作用机制g418是一种广谱抗生素，属于氨基糖苷类抗生素，常用于细胞筛选和基因转染实验。
它能够抑制细菌和真菌的生长，同时对哺乳动物细胞具有选择性毒性。
g418的作用机制主要是通过抑制细胞内的蛋白质合成而起作用。
三、g418筛选细胞的原理g418筛选细胞的原理是利用细胞对g418的敏感性来筛选出特定类型的细胞。
在细胞培养基中加入一定浓度的g418，只有对g418敏感的细胞才能够存活下来，而对g418不敏感的细胞则会死亡。
因此，通过调整g418的浓度，可以选择性地杀死或保留特定类型的细胞。
四、g418筛选细胞的步骤1. 准备细胞培养基：在培养基中添加适量的g418，使其浓度达到所需浓度；2. 培养细胞：将待筛选的细胞加入带有g418的培养基中，进行培养；3. 观察细胞生长：观察细胞在带有g418的培养基中的生长情况。
对于对g418敏感的细胞，它们将在培养基中存活和繁殖；而对g418不敏感的细胞，则会死亡或生长缓慢；4. 筛选细胞：根据细胞的生长情况，筛选出对g418敏感的细胞。
五、g418筛选细胞的注意事项1. g418的浓度要根据具体实验目的进行调整，过低的浓度可能无法有效筛选出特定细胞，而过高的浓度可能对所有细胞都具有毒性；2. g418的作用时间也需要根据实验目的进行调整，通常需要持续培养一段时间才能筛选出对g418敏感的细胞；3. 在筛选细胞的过程中，需要定期观察细胞的生长情况，及时调整培养基中的g418浓度，以保证细胞的生长和筛选效果。
六、g418筛选细胞的应用g418筛选细胞的方法在生物学研究中得到了广泛应用。
例如，在基因转染实验中，可以利用g418筛选出成功转染的细胞，以便进行后续的功能研究；在细胞分离和纯化实验中，也可以利用g418筛选出特定类型的细胞，以便进一步研究其特性和功能。
稳定细胞株筛选药物浓度确定方法
稳定细胞株筛选药物浓度确定方法
在使用G418、潮霉素B或嘌呤霉素筛选稳定细胞系细胞之前，需要先通过梯度实验确定适合该类细胞的最佳药物浓度。
对于一些常见的细胞系，通常可以在资料中找到推荐的药物浓度。
例如Hela细胞用400 μg/ml的G41或1 μg/ml的嘌呤霉素进行稳定细胞株筛选。
用G418或潮霉素B，选用在5天左右出现细胞大批死亡，2周全部死亡的浓度作为筛选浓度。
对于嘌呤霉素,通常采用在3-4天杀死全部细胞的浓度。
不同批次的药物活性有一定差异。
因此在使用新批次药物时，需要重新测定最佳浓度。
筛选抗生素的推荐使用浓度（μg/ml）
抗生素工作范围筛选浓度维持用量
G418 50-800 400-500 100
Hygromycin 50-800 200 100
Puromycin 0.25-2 0.5-10 0.25
1、在加入筛选药物前一天将细胞以50%密度接种到6孔板。
第二天在培养基中按G418(0,50,1000,200,400,800μg/ml)或者嘌呤霉素（0,1,2.5,5,7.5,10μg/ml）加入。
2、用G418筛选处理5-10天。
每2天观察细胞一次。
每4天跟换新的有抗生素的培养基（如果有必要可以更换得更勤）。
直到得到最佳浓度。
3、用嘌呤霉素处理4-7天。
每2天跟换新的有抗生素的培养基。
G418筛选程序
G418筛选程序一、杀伤曲线1. 在24 孔板内接种细胞，约3x104/孔（只是参考值，根据细胞的体积和生长速度调整），共11孔，培养过夜。
2. 第二天，观察细胞密度为20%-30%（如果密度不合格，请重新进行细胞接种，不要勉强进行，浪费时间）。
稀释G418 (0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 µg/ml，如果G418储液浓度较高，进行稀释时，所取体积很小，有困难，请先把储液进行稀释（需要多少，稀释多少），以稀释的储液在进行稀释)至培养基, 每孔加入0.75m l培养基。
3. 每隔2天观察细胞的存活情况（贴壁细胞飘起即为死亡，悬浮细胞，可以通过观察细胞的膜情况来判断，死亡细胞的细胞膜较为粗糙，有皱褶，没光泽，准确应以取少量细胞进行台盼蓝染色为准），每隔3-4天更换0.75m l含相应浓度G418的培养基。
4. 筛选5-10天（早也不行，晚也不行）内使细胞全部死亡的最低G418浓度，即为杀伤浓度（筛选浓度）；二、细胞筛选1.转染（24孔板进行）或电转后培养24小时，按10%密度传代（传至35mm平皿），继续培养24小时，待细胞密度增至20％～25％汇合时；2.去掉培养液，PBS洗一次，加入按最佳筛选浓度（杀伤曲线实验确定）配制好的G418筛选培养基2-3ml。
3.根据培养基的颜色和细胞的存活情况，每隔3-4天更换一次筛选培养基(培养基用量为2-4ml，细胞多，多加培养基，细胞少，少加培养基), 一般在5-6天内出现细胞大量或少量死亡情况（如果转染效率或电转效率高，则死亡少；如果转染效率或电转效率低，则死亡多；如果筛选浓度偏低，筛选培养基用量少，细胞密度大于80%，会导致大量假阳性克隆）。
如果筛选第一周，出现细胞大量死亡，则在原培养皿中继续加入筛选培养基进行筛选一周；如果筛选第一周，出现细胞少量死亡，则把细胞按10%密度传代（传至35mm平皿，传一个皿即可，多余细胞丢弃），利用筛选培养基进行筛选一周；4.筛选第二周结束后，则把细胞消化下来，进行终点稀释（10ul培养基中含1个细胞，用筛选培养基稀释），把上述10ul细胞悬液加入96孔板中（提前加入40ul筛选培养基），一共加24孔，4小时后观察每个孔的情况，记录只含一个细胞的孔，含有一个细胞的孔用于继续筛选，其余孔舍弃；5.根据培养基的颜色和细胞生长情况换入新的筛选培养基，待细胞密度为80%时，将其传代至24孔板中增殖，待细胞密度为80%时，将其传代至6孔板中增殖，待细胞密度为80%时，将其传代至T25瓶（一传3）中增殖，每隔3天换液。
转染、G418筛选、单克隆化的总结
转染、G418筛选、单克隆化的总结筛选之前确定G418浓度：1，由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。
2，G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。
neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素和G418。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。
3，汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%4，G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。
具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。
一个具体试验：3*106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。
理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。
筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。
加药时间和维持浓度1，由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。
所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。
随着细胞的代谢G418的浓度和活性都回下降，所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。
这时药物浓度可以降至200ug/ml。
2，加抗生素的时机，主要是考虑插入到细胞基因组的抗性基因是否已经得到表达。
G418筛选实验
G418筛选实验相关问题点击次数：1011 作者：guodengjun12 zhaolifei sandy99等发表于：2008-08-06 23:39转载请注明来自丁香园来源：丁香园问：G418筛选预实验用未转染的细胞做，选10-14天内细胞死亡的最小浓度，然后将更高一级别的浓度应用于转染的细胞，是这样吗？答：G418是一种细胞毒性药物（氨基糖苷类抗生素），依不同浓度，对细胞有一定的抑制或杀伤作用，而拟转染的质粒上带有G4 18的药代酶，能降解G418，从而使细胞获得对G418的耐药性。
也就是说转染后的细胞可以耐受G418，而未转染成功的细胞不能耐受G418，因而被杀灭或抑制。
通过G418筛选体系，使得未转染成功的细胞比例不断减少，转染成功的细胞比例不断增高。
如果G418浓度太高则会杀伤所有的细胞，如果G418浓度太低则没有什么毒性，两种情况都不能起到筛选作用。
G418筛选预实验则是先用未转染的细胞做，选14天内细胞死亡的最小浓度应用于转染的细胞，因为不同的细胞对G418的耐受性也不一样，这样的目的是找一个实验细胞能耐受G418的工作浓度，从而为筛选转染的细胞打下基础，因为这种浓度只能抑制未转染的细胞，而不抑制转染成功的细胞的！从而起到筛选作用。
建议你再多查找一下国内外相关文献，实验动手之前一定要明白其原理，要不然会很盲目，充分的准备可以避免走很多不必要的弯路！问：第二次筛选要怎么做？答：第二次筛选就是将转染好的细胞接种培养后，向培养液中加入G418以杀伤或抑制其中的未转染成功的细胞，因为不管转染效率多么高，都不可能是100%，所以要通过G418筛选体系（或者其他筛选体系）来筛掉那些没有成功转染的细胞，此时加入G418的浓度可以略高于你第一次预实验时摸索出来的“最小有效浓度”，实验中可以再根据细胞生长情况进行浓度的调整！问：第二次筛选是经过第一次筛选以后，已经筛选出一部分转染细胞了，但是因为有些细胞还是会丢失目的基因所以要得到稳定表达的细胞还要进行2-3次筛选，这时候还是用原来预实验的浓度，还是要再提高一个浓度？答：你要在荧光显微镜下观察一下，判断一下细胞转染的效率，也就是转染成功的细胞的比例，再根据情况选用或高或低的浓度！转染成功的细胞的比例越高，则加入G418的浓度就可以越低。
最新G418筛选稳定表达细胞系经验总结资料
G418筛选稳定表达细胞系经验总结我做了稳定转染，从G418浓度确定到最后的单克隆化鉴定。
有自己的体会也有其他战友遇到的情况, 和大家分享. 没有总结好的地方，大家补充。
筛选之前确定G418浓度：1、由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。
2、G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。
neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素G418。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。
3、汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%4，G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。
具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。
一个具体试验：3x106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。
理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。
筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。
加药时间和维持浓度1，由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。
所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。
随着细胞的代谢G418的浓度和活性都会下降，所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。
筛选稳定表达细胞系经验总结
G418筛选稳定表达细胞系经验总结我做了稳定转染，从G418 浓度确定到最后的单克隆化鉴定。
有自己的体会也有其他战友遇到的情况, 和大家分享. 没有总结好的地方，大家补充。
筛选之前确定G418 浓度：1、由于每种细胞对G418 的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418 有效成分的比重不同，一般1g 的粉剂中有效的G418 含量大约为。
2、G418 是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418 对细菌和真核细胞都起作用。
neo 就是编码3 ‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素G418 。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418 有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。
3、汇合度对G418 筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%4 ，G418 的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418 的最佳筛选浓度。
具体如下：将细胞稀释到1000 个细胞/ml ，在100ug/ml~1mg/ml 的G418 浓度范围内进行筛选，选择出在10~14 天内使细胞全部死亡的最低G418 浓度来进行下一步的筛选试验。
一个具体试验：3x10 6个细胞电转后，分别接种1/4000 ，1/1000 ，1/300 细胞到24孔板中，48h 后加药筛选，此时1/300 细胞孔内大约50%汇合度。
理论上1/4000 孔内应有4% 的汇合度。
筛选9 天后，观察1/4000 孔内有两三个克隆，按比例1/300 孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。
加药时间和维持浓度1，由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。
所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染之后才开24 小时始加G418 筛选。
G418筛选
从G418筛选，转染到单克隆化的总结筛选之前确定G418浓度：1.由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。
2.G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。
neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素和G418。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。
3.汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%4.G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。
具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。
一个具体试验：3*106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。
理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。
筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。
加药时间和维持浓度1.由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。
所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。
随着细胞的代谢G418的浓度和活性都回下降，所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。
这时药物浓度可以降至200ug/ml。
2.加抗生素的时机，主要是考虑插入到细胞基因组的抗性基因是否已经得到表达。
最全的G418筛选稳定表达细胞系总结3
最全的G418筛选稳定表达细胞系G418是最常用的筛选剂之一，可用于筛选稳定表达的质粒载体含G418抗性基因的细胞系。
在这篇文档中，我们将介绍如何进行G418筛选，以及如何评估稳定表达的细胞系。
G418的使用G418是一种广谱抗生素，能够影响细胞内的核糖体功能。
在含有G418抗性基因的质粒载体中，这一基因将在细胞内表达，从而使细胞对G418具有抗性。
因此，通过加入G418到培养基中，可以筛选出含有G418抗性基因的细胞。
G418的浓度和作用时间很重要。
一般情况下，使用0.4 ~ 1 mg/mL的G418浓度，作用时间为72小时。
当G418加入到培养基中后，需要每两天换一次培养基，并检查细胞生长情况。
如何评估稳定表达的细胞系进行G418筛选后，需要评估哪些细胞系是确实稳定表达了目标基因。
以下是常用的评估方法：1. RT-PCRRT-PCR是常见的定量分析方法之一，可以用于测量目标基因在细胞中的表达水平。
通过提取RNA，用逆转录酶将RNA转录成cDNA，然后用PCR来放大目标区域。
在最后的荧光测量中，可以测量出目标基因的表达水平。
RT-PCR的优点是灵敏度高，且可以针对不同寡核苷酸的序列进行定量分析。
2. Western BlotWestern Blot是常见的蛋白质分析方法之一，可以用于测量目标蛋白在细胞中的表达水平。
通过提取蛋白质，将其分离成各种大小不同的片段，然后用抗体来特异地检测目标蛋白。
Western Blot的优点是能够定量分析特定蛋白，且具有较高的灵敏度。
3. 细胞功能实验在某些情况下，需要通过测量细胞的功能来评估细胞系的稳定表达水平。
例如，对于表达了RNA干扰分子的细胞系，可以通过测定下游基因的表达量或细胞增殖率来检验RNA干扰是否成功实现。
G418筛选稳定表达细胞系是一种常见的实验方法。
在筛选前，我们需要准备含有G418抗性基因的质粒载体，然后在适当的时间和浓度下进行G418筛选。
G418筛选
G418筛选相关1.G418筛选要做预试验确定最佳浓度，将细胞稀释至1000cell/ml，每孔100ul加入有培养基的24孔板，将每孔中的G418浓度稀释至0,,100, 200,300, 400,500, 600,700, 800,900, 1000,11 .00ng/ml等１2个级别, 培养10-14天，以最低细胞全部死亡浓度为基准，一般400-８００左右，筛选时比该浓度再高一个级别，维持使用筛选浓度的一半。
2.我们掌握是传过10代以后用维持量，但不能不用，因为有时候抗性基因会丢失，如果没有G418，很快会形成优势的。
３.即是有G41抗性，也不一定有目的基因，单克隆化操作是很重要的。
2.转染后，每个细胞内目的基因与宿主染色体的整合状况是不同的，目的蛋白表达有的多，有的少，外源蛋白表达少的细胞由于代谢负荷较小，所以生长较快，在生长若干代之后，表达少的细胞会形成优势，长期之后，表达最弱的细胞会由于竞争优势占主要，转绿色荧光蛋白基因后，表达越来越暗就是这个道理。
所以，要进行单克隆化操作，使得到的均来自于同一祖先细胞，遗传性状尽量一致，也是对高表达细胞的保护。
操作用96孔板法，每代细胞长满后，大多数冻存，留２００cell左右就可以进行该操作了，该方法在很多关于单克隆抗体和细胞原代培养书中均有讲述，我就不赘述了。
必须指出，单克隆化要做几遍，一遍是不够的，我前十代都是这样的，结果绿色荧光蛋白不但没减弱，反而增强了很多。
现在很多代了，很稳定。
3. 1.可以肯定的是，外源基因与宿主染色体之间的整合是随机的而且不是单拷贝的，这点我们做过FISH验证过，表达量与整合数目，上游序列特性，特定部位DNA立体结构都是相关的，装入了SV40只是增加了表达了数目，但并不能掩盖其它因素对表达的影响。
按你的讲法，转染完GFP的细胞应该亮度一致，但实际上差别很大。
neo基因也是这样，而且，同一细胞中不同基因的拷贝数不会相同，不同细胞同一基因的数目也不会相同，这点可以用数学关于泊松分布的观点理解。
最全的G418筛选稳定表达细胞系总结4
最全的G418筛选稳定表达细胞系G418，又称为geneticin，是一种广谱抗生素，常用于筛选稳定转染的哺乳动物细胞系。
G418能够靶向细胞内的Neo基因表达，使转染后含有Neo基因的细胞能够存活。
在此，我们将详细介绍如何使用G418筛选稳定表达细胞系，并常见问题以及解决方法。
G418筛选实验步骤转染表达向量在进行G418筛选实验之前，首先需要将目标基因克隆到表达向量中，并将表达向量转染到细胞系中。
转染方法常见的转染方法有磷酸钙共沉淀法、聚乙烯醇法、脂质体转染法等，具体方法可参考相应文献或实验室内部标准操作规程进行操作。
添加G418将转染过的细胞在培养基中培养至80%～90%的密度后，加入G418。
加入G418前需进行药物浓度优化实验，确定最适合本实验所用细胞系及所选转染质粒的G418浓度。
筛选G418作用于Neo基因表达的细胞会死亡，而未表达Neo的细胞能够幸存下来。
因此通过逐渐增加G418浓度，筛选出稳定表达目标基因的细胞。
扩增筛选出稳定表达细胞后，需要扩大细胞数量以供后续实验使用。
可使用限稀稀释法或其他适合本实验的细胞扩增方法进行扩增。
常见问题及解决方法细胞死亡太多可能原因： - G418浓度过高； - 转染效率低。
解决方法： - 降低G418浓度； - 提高转染效率。
细胞生长太慢可能原因： - G418浓度不足； - 细胞密度过高。
解决方法： - 增加G418浓度； - 控制细胞密度。
稳定表达效果不理想可能原因： - Neo基因位点修饰造成表达低下； - 转染质粒与细胞系不匹配。
解决方法： - 检查Neo基因位点修饰； - 更换适合细胞系的转染质粒。
通过对G418筛选稳定表达细胞系的介绍，我们可以看出，G418筛选是一种快速、有效的细胞系稳定性筛选方法。
通过对常见问题及解决方法的，可以及时解决可能出现的问题，保证实验顺利进行。
祝大家在细胞实验中取得好的结果。
G418筛选tzmbl细胞适宜浓度实验
表1含有不同剂量组G418的DMEM培养基配制
0
1
2
3
4
5
G418体积（பைடு நூலகம்L）
100
（从前一管中吸取，后面类推）640
5000
5000
5000
5000
DMEM体积（μL）
900
9360
5000
5000
5000
5000
管中G418浓度（μg/mL）
50000
3200
1600
800
400
200
每孔G418含量（μg）
对照
C
D
表2不同剂量组G418的DMEM培养基加入96孔板
三、2~3天更换新鲜培养基，培养2周，选择细胞全部死亡的最低G418浓度作为细胞筛选的浓度。最终确定筛选用G418浓度为---------μg/mL。
2.G418储液浓度为500mg/mL=500μg/μL，先用DMEM培养基将其稀释为50μg/μL的工作液。
3.每个剂量组做三个复孔，每孔加入100μL含有G418的DMEM培养基，每次准备的各个剂量DMEM培养基按500μL计算，一次性配制10次的培养基量，为5000μL。对照组，加入100DMEM培养基
320
160
80
40
20
每孔加入体积（μL）
100
100
100
100
100
G418工作液浓度（μg/mL）
3200
1600
800
400
200
（0号管为1.5 ml EP管，2-5号为15 ml无菌离心管）
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表1含有不同剂量组G418的DMEM培养基配制
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G418体积（μL）
100
（从前一管中吸取，ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ面类推）640
5000
5000
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DMEM体积（μL）
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9360
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管中G418浓度（μg/mL）
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800
400
200
每孔G418含量（μg）
建立MicoRNA稳转TZMbl细胞系所用G418筛选浓度实验
实验目的
实验细胞
G418
G418储液浓度
建立MicoRNA稳转TZMbl细胞系所需要的G418筛选浓度
TZM-bl细胞
实验室自制
2006
500mg/mL
一、将TZM-bl细胞以1000个/孔的密度接种到96孔板中。
二、1.24 h后，弃去旧的培养基，分别用含有200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL、16 000μg/mL、3200μg/mL G418的DMEM培养细胞。
对照
C
D
表2不同剂量组G418的DMEM培养基加入96孔板
三、2~3天更换新鲜培养基，培养2周，选择细胞全部死亡的最低G418浓度作为细胞筛选的浓度。最终确定筛选用G418浓度为---------μg/mL。
320
160
80
40
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每孔加入体积（μL）
100
100
100
100
100
G418工作液浓度（μg/mL）
3200
1600
800
400
200
（0号管为1.5 ml EP管，2-5号为15 ml无菌离心管）
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B
3200μg/mL
1600μg/mL
800μg/mL
400μg/mL
200μg/mL
2.G418储液浓度为500mg/mL=500μg/μL，先用DMEM培养基将其稀释为50μg/μL的工作液。
3.每个剂量组做三个复孔，每孔加入100μL含有G418的DMEM培养基，每次准备的各个剂量DMEM培养基按500μL计算，一次性配制10次的培养基量，为5000μL。对照组，加入100DMEM培养基