蛋白质组学在动物医学中的研究应用与进展

宫腔液体中的蛋白质生物学功能分类
蛋白质组学在动物医学研究中的应用案例分析
案例二
应用方式：亚细胞差异定量蛋白质组学（iTRAQ） 研究背景： A流感病毒（RNA病毒）感染鸟类和哺乳动物，引发急性呼吸疾病。A 流感病毒感染后的炎性体激活机制（先天免疫激活机制）尚不清楚。 研究目的：利用亚细胞定量蛋白质组学分析A流感病毒感染的原始巨噬细胞中宿 主-病原菌的互作机理。 免疫机制研究
蛋白质组学在动物医学研究中的应用案例分析
案例二
免疫机制研究
共鉴定蛋白：3477 定量信息：2466
线粒体：1999 胞质：1423 细胞核：1230 分泌蛋白：627
差异胞内组分：1321（>1.5, <0.67） 差异分泌蛋白：544
蛋白质组学在动物医学研究中的应用案例分析
案例二
病毒感染后，线粒体和细胞核中的蛋白动态变化 溶酶体蛋白（包括组织蛋白酶）快速泄露 P2X7 受体和src酪氨酸激酶对病毒感染后的炎性 体激活至关重要 不同DAMP的分泌在抗病毒响应中起重要作用 免疫机制研究
蛋白质组学技术应用思路
思路2 ：通过前期工作的积累，将研究目标锁定到某一个具体的蛋白质
或者信号通路。通过质谱技术来研究目的蛋白质的序列，修饰状况，亚细 胞定位和互作蛋白,从而来探索该蛋白质的功能及其作用机制。
细胞器蛋白 质表达谱
细胞器定位
细胞器功能
目标 蛋白
IP Pull down 纯化表达或 修饰富集
案例一
应用方式：差异定量蛋白质组学 + 生物信息学 研究背景： 早期胚胎丢失是影响乳牛、肉牛生育能力的关键。而早期牛胚胎的 生长和发育依赖于宫腔液体的成分组成。宫腔蛋白质组可能由血细胞蛋白质和子 宫上皮细胞的分泌蛋白质组成。 研究目的：通过研究牛宫腔液体和血浆蛋白质组的差异，分析和鉴定牛宫腔中影 响胚胎生长和发育的特异性蛋白质。 宿主生理、病理研究
蛋白质组学在动物医学研究中的应用案例分析
案例五
Clp deficient Mtb Wildtype Mtb ClpP2 deficient Msm
病原物生理研究
Wildtype Msm
蛋白质组学分析 （TMT）
蛋白质组学分析 （TMT）
1564个蛋白质（132个表达上调）， 大量转录因子累积
共有107蛋白质表达量显著累积
内
容
• 蛋白质组学及其技术相关介绍 • 蛋白质组学技术的主要应用思路 • 蛋白质组学在动物医学研究中的应用案例分析
蛋白质组学的概念技术特点与优势
1980年代
1994年 1998年
• •
OMICS：大规模数据输出——全面数据挖掘，整体和网络水平研究 MS based Proteomics ：更大规模的数据输出 基于蛋白的化学构成——亚型、修饰 不受抗体限制——新发现、创新研究
Tandem MS spectra
基于质谱技术的定量蛋白质组学
可以更加有效的检测低丰度蛋白质和极端生化性质的蛋白质。
技术方法和路线
Label free
Cell or tissue Protein SILAC iTRAQ MRM
Peptides
MudPIT MS/MS Data analysis
In vitro-iTRAQ
蛋白质 组学
互作蛋白
蛋白复合物 组成与功能
质谱 分析
目标蛋白 修饰状态和 位点 目标蛋白 序列
分离纯化
蛋白质组学在动物医学研究中的应用案例分析
蛋白质组学及其技术相关介绍
蛋白质组学研究内容和技术方法分类
蛋白质鉴定 蛋白质修饰（磷酸化/ 乙酰化/糖基化…）
蛋白质，组织、 细胞、亚细胞、 体液等的蛋白提 取液
定性研究
大规模表达谱构建
MALDI TOF/TOF （较纯样品）
LC-MSMS(shotgun) (复杂混合样品)
蛋白质组学
蛋白质相互作用（IP）
蛋白质组学在动物医学研究中的应用案例分析
病原物毒力研究
案例三
致病 不致病
后续生理生化验证
S /T /Y
P MW=+79.9799 S /T /Y—P
生物信息学
Motif分析 GO注释 PPI/聚类
K12：166个肽段，167个位点，117个蛋白质 EHEC O157:H7:561个肽段，416个位点，287个蛋白质
中需要绝对定量
蛋白质组学在动物医学研究中的应用案例分析
免疫原鉴定
案例四
应用方式：蛋白质组学相对定量+绝对定量 研究背景： 职业性哮喘在海鲜从业人员中比较常见，已经在多个海鲜物种 中报道了可以引起职业性哮喘的过敏原。 研究目的：从蛋白质组水平出发，大规模地筛选北极虾中可能的引起职业性 哮喘过敏原。
蛋白质组学在动物医学研究中的应用案例分析
代谢组学
生物信息学
聚类分析 功能注释 通路注释 网络构建
后续验证 （MRM）
模型建立
蛋白质组学在动物医学研究中的应用案例分析
案例五
病原物生理研究
应用方式：蛋白质组学与转录组学同时应用（揭示翻译后修饰调控） 研究背景： 结核分枝杆菌含有众多的生长所必需的蛋白酶，它们在结核杆菌的 生理和毒力调控方面具有重要地位和意义。 研究目的：从蛋白质组水平出发，大规模地筛选Clp蛋白降解系统的可能底物， 并阐明其影响生长的作用机理。该研究对结核杆菌的新药开发具有重要意义。
Expression validation (PCR/WB/ELISA/IF) Function evaluation (silence/mutation/inhibition)
Overall bioprocesses and pathway networks
Mechanism
蛋白质组学在动物医学研究中的应用案例分析
不一定适合所有蛋白质的定量，因此大规模的组学定量数据后期需要进行单 个的验证。
2.通常情况下蛋白质组学相对定量结果采用western以及Elisa进行验证，但
是这两项技术需要抗体。
3.目的蛋白质后续的功能和生理生化研究工作繁杂并且耗时耗力，因此需要
保证前期工作的准确性。
4.某些重要蛋白质（酶，蛋白酶的底物，多肽类激素，过敏原）在研究过程
免疫原鉴定
案例四
MRM绝对定量
蛋白质组学在动物医学研究中的应用案例分析
免疫原鉴定
案例四
发现tropomysin,argine kinase,sarcoplamic calcium-binding protein等蛋白质是可能的过敏原。
蛋白质组学技术在农林学研究中的应用思路及案例介绍
SRM/MRM原理及流程
m=31
m=28

来源不同的相同蛋白样品在一级质谱上表现相同 Balance group在二级质谱发生中性丢失

Reporter group 在二级质谱产生2个报告离子，分别是
114和117 通过分析报告离子的峰强度比值就可以分析同一个蛋白在不 同样品间的表达量比值
蛋白质组学及其技术的简介
Contents
蛋白质组学在动物医学研究中 的应用与进展
严 峻 博士
中国科学院上海生命科学院 Shanghai Institutes for Biological Sciences 上海中科新生命生物科技有限公司 Shanghai Applied Protein Technology Co.,Ltd
图像 分析
质谱 鉴定
DIGE（荧光差异双向凝胶电泳）
大规模蛋白Shotgun鉴定
Protein mixture
Protein digestion
SCX column fractionation
ReversΒιβλιοθήκη Baidu column separation
Auto MS/MS detection
Results
BioWorks data base search
对照组
vs. 实验组
基因组学
思路1：
某一个具体的现象进行研究，通过组学 的手段大规模的挖掘和积累数据，以达 到解释该现象的目的。 1. 蛋白质组学技术可以单独应用 2. 蛋白质组学技术可以和其他组学手段 得到的数据整合起来分析，更加综合， 全面，立体地来研究具体的机制。
蛋白质组学 转录组学
定性 定量 修饰
绝对定量：
1.需要合成相应同位素肽段 为内参（内标法） 2.合成普通肽段做标准曲线 （外标法）
蛋白质组学在动物医学研究中的应用案例分析
免疫原鉴定
案例四
MRM优势： 1.无需依赖抗体; 2.绝对定量； 3.多靶标分析
蛋白质组学在动物医学研究中的应用案例分析
免疫原鉴定
案例四
Tropomyosin以及arginine kinase在空气中的含量达到375和480 ng/m3
锁定目标蛋白质 肽段： 检出 1.蛋白特异性肽段序列 2.能够在质谱中被有效 3. 每个蛋白质选择1-3
选择肽段及其离子对，质谱条件 优化
样品质谱分析（定量）
个肽段 离子对： 1.高强度 2.低干扰 3. 每个肽段选择3-5个 离子对
相对定量： 1.无需合成相应同位素 肽段 2.以样品中丰度稳定且 相对较高的肽段为内参, 通常内参选择两个及以 上蛋白质。或者添加外 源性标准品做内参
蛋白质组学在动物医学研究中的应用案例分析
病原物毒力研究
案例三
这些磷酸化位点具有保守的motif。酪氨酸磷酸化蛋白参与了多样的生物学过程。 致病岛蛋白质为磷酸化蛋白质。
蛋白质组学技术在农林研究中的应用思路及案例解析
SRM/MRM:针对某一个或者某几个蛋白质进行精细定量的技术 1.由于在大规模的定量过程中质谱条件是固定的，同时采集大规模数据信息
定量蛋白质组学研究技术方法的选择和比较
iTRAQ/TMT
样本类型 样本需求量 实验规模 鉴定数量 动态范围 实验经费
Label-free
2-DE/DIGE
丰度较高的蛋白 （疏水性，极碱或极酸 性蛋白不适合） +++ 多组 + + +
更多样品（组织， 更多样品（组织，体液） 体液） ++ 2-8组（多组） ++ ++ ++ + 多组（依赖于质 谱重复性） ++ +++ +
非标记：2D 基于凝胶技术 标记：DIGE
定量研究
基于质谱技术
非标记：Label free 标记： iTRAQ/SILAC SRM/MRM
相对定量
绝对定量
基于凝胶技术的定量蛋白质组学——双向凝胶电泳
原理：基于等电点和分子量分离蛋白质
技术方法和路线 蛋白 提取
一向
等电 聚焦
二向 SDSPAGE
染色
扫描
蛋白质组学在动物医学研究中的应用案例分析
病原物毒力研究
案例三
应用方式：磷酸化蛋白质组学 研究背景：酪氨酸磷酸化修饰在真核生物中具有十分重要的生物学调控意义。 细菌酪氨酸激酶影响重要的细胞功能和细菌致病性。 研究目的：全局描绘Escherichia coli酪氨酸磷酸化图谱，并且阐释E.coli的 致病机制。
比较蛋白质组学
Lager-scale profile of proteins with different expression
Top changed /prediction /references
生物信息学
特征筛选/ 聚类 Go注释/ 聚类 PPI/聚类 通路注释/ 聚类
Candidate protein
蛋白质组学在动物医学研究中的应用案例分析
案例一
宿主生理、病理研究
鉴定到宫腔液体和血浆的共有蛋白质112个， 差异蛋白质：35个上调，18个下调
实验设计: 混合样标记为内标，达到整合多个八标iTRAQ实验数据的目的。
蛋白质组学在动物医学研究中的应用案例分析
案例一
宿主生理、病理研究
宫腔液体中的差异蛋白质参与了代谢，抗氧化，免疫响应等调控过程和功能。
qPRC
转录水平分析，锁定蛋白 量积累而其转录水平无正 相关变化的蛋白 转录水平分析，锁定蛋白 量积累而其转录水平无正 相关变化的蛋白
9.3%的结果相吻合，其中 包括CarD 以及WhiB1
蛋白质组学在动物医学研究中的应用案例分析
案例五
病原物生理研究
后续的生理生化实验证明了CarD 以及WhiB1是Clp蛋白降解系统的底物，并且 WhiB1的积累会对结合杆菌的生长产生严重的毒性
内
容
• 蛋白质组学概念和研究的必要性与重要性
• 蛋白质组学技术的主要应用思路与案例分析
蛋白质组学在动物医学研究中的应用案例分析
蛋白质组学在动物医学研究中的主要应用方向
蛋白质组
宿主
免疫应答机制
病原物
生理、病理
药理和毒理
生理、发育
毒力
药物作用机制， 药靶筛选
研究思路I —— 比较蛋白质组学
Sample type I VS Sample type II Control VS Treatment Normal VS Model Silence / inhibition / over-expression before VS after