蓝藻蛋白的分离与纯化

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钝顶螺旋藻中藻蓝蛋白的分离纯化及特研究

钝顶螺旋藻中藻蓝蛋白的分离纯化及特研究
螺旋藻是一类低等生物原核生物由单细胞或多细胞组成的丝状体体长200500m宽510m圆柱形疏松或紧密的有规则的螺旋旋形弯曲形如钟表发条故而得名
钝顶螺旋藻中藻蓝蛋白的分离纯化及特*研究
为发展新型海洋*物,采用SephacrylS-200凝胶层析和羟基*灰石柱层析对人工养殖钝顶螺旋藻中的藻蓝蛋白进行了分离和纯化,得到了藻蓝蛋白纯品.测定了藻蓝蛋白的氨基*组成和含量.藻蓝蛋白的紫外、可见吸收光谱表明其最大特征吸收波长为278,360,620nm.得到的藻蓝蛋白经等电聚焦显示为一条带,其等电点为pH=4.3.还测量了藻蓝蛋白红外吸收光谱.研究所获得的藻蓝蛋白为后续开展临床应用提供了可靠的样品.
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地木耳中藻蓝蛋白的分离与纯化

地木耳中藻蓝蛋白的分离与纯化
发利用提供理论依据。
将上 加人固体 ( 助 多 清液 N 0准之达 %饱和, 搅 5 2 充分 拌, 静置30而n,1侧 9下冷冻离心30 i ,弃去离心管底 x幻 mn 部沉淀。 上清液中 继续加人 (N 多 使之达到 %饱和, ) 4 H o ’ 5 充分 搅拌, Z , 静置 然后在1以 9下离心3腼i , b xx〕 n 弃去上清 液, 沉淀即 蓝蛋白 ( 一 y o ya i , ) 和 蓝蛋白 为藻 C Pcc nn P h C 别藻
1.2 3 盐析 .
层析 (HA层析) , 用磷酸盐缓冲液洗脱 (PBS 后, ) 得到了 藻蓝蛋白 (P ) 和别藻蓝蛋白 (A c ) 的洗脱峰。洗脱的 c P 顺序为藻蓝蛋白 在前, 别藻蓝蛋白 在后。
1.3 纯度鉴定
收稿日期: 20 8刁3一 0 0 2 作者简介: 李三相 ( 1 7卜) , 9 男, 甘肃静宁人,天水师范学院生命科学与化学学院讲师, 硕士。
A0 ycn A ( 1 户 o y in, ) 的 合 。 淀 00 m讥的 酸 c c P 混 物 沉 用1 o 磷 .
缓冲液(P S) 溶解( 含0.02mol NaCI及0.( lmol EDTA) , B L l ) X L l
定溶至一定体积, 加人固体 (NH4 多 使其浓度达2 %, ) o ’ 6 充 分搅拌, 印 in, 卫 静置 m 10以〕 9离心10m 弃去沉淀。 in, 继 续加人 (N坳 多 达3 %饱和,静置Z 仪 〕 . 0 5 h,1 众9下离心 0 n 1 mi ,沉淀即为藻蓝蛋白 (P ) 。用同样的方法,再以 C
液 (分 10、 50、 0 、 o lllm 别为 20: 1 Z o泥, 人 o 比并加 0.lm
N l 梯度洗 洗脱速度为 sm , c a ) 脱, . / 4 l 分步收集洗 h 脱液, 每

藻蓝蛋白的提取、纯化及紫外可见光谱仪检测蛋白纯度

藻蓝蛋白的提取、纯化及紫外可见光谱仪检测蛋白纯度

藻蓝蛋白的提取、纯化及紫外可见光谱仪检测蛋白纯度谭一心一、实验目的学习并掌握提取、纯化藻蓝蛋白及紫外可见光谱仪检测纯度的方法。

二、实验原理1冻融法:将细胞置低温下冰冻一定时间,然后取出置室温下(或40℃左右)迅速融化。

如此反复冻融多次,细胞可在形成冰粒和增高剩余胞液盐浓度的同时,发生溶胀破碎。

2盐析法:蛋白质在稀盐溶液中,溶解度会随盐浓度的增高而上升(盐溶),但当盐浓度增高到一定数值时,其溶解度又逐渐下降,直至蛋白质析出(盐析)。

盐析的发生在于盐浓度增高到一定数值时,使水活度降低,进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和,水化膜逐渐被破坏,最终引起蛋白质分子间相互聚集,并从溶液中析出。

3DEAE—纤维素:二乙基胺乙基纤维素,总交换量0.9meq/g功能基:二乙基胺乙基,弱碱性阴离子交换剂。

原理:含有某些功能基团,可以进行离子交换,性能比一般离子交换树脂温和,适用于分离具有生物活性的大分子,可以将性质相近的大分子物质分开。

1.装柱:装柱前先将层析柱垂直固定在支架上。

装柱的方法分干装和湿装两种。

干装是直接加吸附剂到柱中,然后倒入溶剂,此法不易将气泡排尽。

湿装法是先加适量溶剂到柱中,排走其中的空气,然后把预先用溶剂浸泡好的吸附剂搅匀,随即将此悬浮液连续倾入柱中,打开柱下端出口,让溶剂慢慢流出,使柱上端悬浮液缓缓下降到需要的高度,吸附剂表面要平整,应使其一直浸没在溶剂中,以防气泡产生。

2.加样:经过平衡的层析柱当平衡液流到与固定相表面一致位置时,用滴管轻轻把分离样品的溶液加到固定相表面,要尽量避免冲动基质。

加入样品液的体积一般应小于床体积的1/2(体积越小越有利于提高分辨率)。

3.洗脱:待样品液的液面流到固定相表面时,用滴管加入洗脱剂(5cm),并在柱上端与装有洗脱剂的储液瓶连接开始洗脱。

同时在柱下端与部分收集器接通,立即进行分级收集(按体积或时间分管收集)。

4.测定:随后将收集的每管溶液进行浓度或活性测定。

藻蓝蛋白的提取、纯化及紫外可见光谱仪检测藻蓝蛋白纯度-2

藻蓝蛋白的提取、纯化及紫外可见光谱仪检测藻蓝蛋白纯度-2

藻蓝蛋白的提取、纯化及紫外可见光谱仪检测藻蓝蛋白纯度-23.结果分析:实验测得的藻蓝蛋白纯度只有0.509,比较我们班其他组的结果相差不算太大,但其他班有的组测得藻蓝蛋白得纯度可达到 1.7左右,相对于这个纯度,我们所提取得藻蓝蛋白纯度时偏低的,影响藻蓝蛋白纯度的原因主要有以下几个:1)冻融次数:本实验时采用冻融法破碎细胞,冻融法破碎细胞主要是因为藻体在冻结过程中,细胞内外的液态水形成冰晶体,造成体积膨大,对藻体细胞壁和细胞膜产生破坏作用,使其通透性加大,内容物流出。

藻体冻结过程中首先是从最容易生成细小冰晶体的地方开始,然后冰晶体逐渐变大,向四周扩展,将距这些地方比较近的细胞壁和细胞膜胀破,压破。

每次冻融最容易生成细小冰晶体的地方是不一样的,即在细胞内外形成冰晶的部位是不同的,这样就能对细胞不同部位的细胞壁和细胞膜产生破坏,因而多次冻融能使破碎效果提高。

冻融时间增加随能使冰晶体变大,但由于受细胞内外水分含量的限制,冰晶的长大使有限度的,因而对细胞壁和细胞膜破坏只是在原有基础上的破坏,破坏区域较少,效果较差,所以冻融时间对冻融效果影响不大。

可见,在冻融法中次数对藻蓝蛋白得率得影响比时间对它得影响大,多次反复冻融的细胞破碎效果比较好。

我们自己只冻融了一次,其余是老师整体冻融的,所以我们冻融方面应与其他组没有多大区别。

2)不同饱和度硫酸铵的盐析效果:实验过程中,饱和度在20%时,没有明显的沉淀,查资料得知,当饱和度在25%以下时,没有明显的沉淀,在25%以上后,随着硫酸铵饱和度的增加,提取率逐步升高。

从纯度看,随着饱和度的升高,纯度先降后升。

实验测得的结果偏低,可能是加入硫酸铵过程中,随着饱和度的增大,杂蛋白,藻红蛋白和别藻蓝蛋白沉淀出的量都在增大,藻蓝蛋白所占的比例减小,所以纯度减小。

由于我们过柱时取的样不是我们组的,所以无法考证是这两种原因引起我们结果偏低,只能说这两种原因对我们所得的藻蓝蛋白纯度会有影响。

藻蓝蛋白的分离纯化及其在食品中的应用

藻蓝蛋白的分离纯化及其在食品中的应用

藻蓝蛋白的分离纯化及其在食品中的应用蓝绿藻是一种广泛存在于水体中的微生物,具有丰富的蛋白质,其中具有生物活性的藻蓝蛋白是其重要成分之一。

藻蓝蛋白具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等多种生理功能,在食品领域中的应用也越来越受到人们的关注。

首先,提取藻蛋白是藻蓝蛋白分离纯化的第一步。

一种常用的方法是溶解蓝藻细胞膜,并通过离心等操作将藻蛋白从细胞中分离出来。

然后,可以使用尺寸排除色谱、离子交换色谱和亲和色谱等技术进一步纯化。

这些分离纯化的方法能够去除其他蛋白质和杂质,提高藻蓝蛋白的纯度。

藻蓝蛋白在食品中的应用有许多潜力。

首先,在抗氧化方面,藻蓝蛋白具有很高的自由基清除能力,可以减少食品在贮存和加工过程中的氧化反应,延长食品的保鲜期。

另外,藻蓝蛋白还能够稳定食品中的颜色,使颜色更加鲜艳。

这一特性使得藻蓝蛋白可以广泛应用于饮料、糕点等食品中,提高产品的市场竞争力。

其次,藻蓝蛋白还具有抗炎和抗肿瘤的作用。

研究发现,藻蓝蛋白能够抑制炎症反应中的炎症介质释放,从而减轻炎症反应对人体的伤害。

在食品加工过程中,添加藻蓝蛋白可以减少食品中的致炎物质的生成,提高食品的健康性。

此外,藻蓝蛋白还具有一定的抗肿瘤活性,可以用于开发新型的抗肿瘤功能性食品。

除此之外,藻蓝蛋白在食品领域中的应用还包括改善食品的营养价值和口感。

藻蓝蛋白中富含的氨基酸和多种微量元素可以提高食品的营养价值。

同时,藻蓝蛋白还具有一定的凝胶特性,在食品中可以改善质地和口感,提高食品的口感感受。

然而,尽管藻蓝蛋白在食品中的应用潜力巨大,但也面临一些挑战。

首先,藻蓝蛋白的生产成本较高,加上其稳定性和保存性能较差,限制了其在食品中的广泛应用。

其次,藻蓝蛋白作为一种新型成分,还需要进一步研究其对人体健康的影响,以确保其在食品中的安全性。

综上所述,藻蓝蛋白具有广泛的蛋白质来源、多种生理功能及一定的应用潜力,在食品领域中的研究和开发也取得了一些进展。

随着科学技术的不断发展,相信藻蓝蛋白在食品中的应用将会得到更大的推广和应用。

藻蓝蛋白生产工艺

藻蓝蛋白生产工艺

藻蓝蛋白生产工艺藻蓝蛋白是一种天然的蓝色色素,广泛用于食品、药品和化妆品等领域。

藻蓝蛋白的生产工艺一般包括培养和提取两个步骤。

首先是藻类培养。

选择一种高产藻类作为目标菌株,常用的有蓝细菌和蓝藻等。

蓝藻是一种常见的藻类,具有高产蓝色素的特点。

蓝藻可以在光合作用下自主合成藻蓝蛋白,因此只需提供充足的光照和适宜的培养基即可。

蓝藻的培养一般采用液体培养法或固体培养法。

液体培养法是将蓝藻菌种接种到含有适宜营养物的培养液中,利用搅拌或充气等方法提供充足的氧气和养分,以促进菌株的生长和藻蓝蛋白的合成。

固体培养法是将蓝藻菌种接种到含有固体基质的培养皿或柱中,通过调节温度和湿度等因素,为蓝藻的生长提供适宜的环境条件。

在培养过程中,需要控制培养液的温度、光照强度和光周期等参数,以及添加适当的营养物,如碳源、氮源和矿物盐等。

此外,还要注意防止外源污染和细胞自身的寄生菌感染等问题。

培养达到一定程度后,即可进行藻蓝蛋白的提取。

提取工艺一般包括细胞破碎、离心和过滤等步骤。

首先将培养液中的藻藻菌株离心下沉,然后通过破碎细胞壁的方法将细胞内的藻蓝蛋白释放出来。

常用的破碎方法包括超声波破碎和高压破碎等。

接下来,通过离心和过滤等步骤将藻蓝蛋白与细胞碎片、杂质等分离,得到相对纯净的藻蓝蛋白溶液。

最后,对提取得到的藻蓝蛋白溶液进行精制和纯化。

常用的精制方法包括吸附、离子交换和凝胶过滤等。

通过这些方法,可以去除藻蓝蛋白中的杂质和不纯物质,提高藻蓝蛋白的纯度和质量。

总之,藻蓝蛋白的生产工艺包括培养和提取两个步骤。

培养过程中需要控制好培养液的环境参数和添加适宜的营养物,提取过程中需要采用破碎、离心和过滤等方法将藻蓝蛋白与细胞碎片等分离,最后通过精制和纯化等步骤提高藻蓝蛋白的纯度和质量。

高纯度藻蓝蛋白分离纯化及光谱特性研究

高纯度藻蓝蛋白分离纯化及光谱特性研究

human and rat CN TF.J Neurochem,1991,57(3):1003~10125 咸海青,范 明,甘思德,等(Xian H Q,Fan M,G an S D, et al).人睫状神经营养因子的原核表达纯化及其生物效应.中国应用生理学杂志(Chinese J Appli Phsiol),1996,12(1): 21~246 Daniel M B,Stuart J E.Protein Methods.New Y ork:Wiley2Liss Press,1991.50~1607 Marston F A O,Freedman F B.Recovery and reaction of recombi2 nant proteins.Biochem Soc Trans,1988,16(1):101~1038 Marston F A O,Angal S,Lowe P A,et al.Scale2up of the recovery and reaction of recombinant proteins.Biochem Soc Trans, 1988,16(1):112~1159 Doonan S,Walter J M.Downstream processing of protein products.Biochem Soc Trans,1990,18(1):231~234Study of R enaturation of R ecombinant H uman Ciliary N eurotrophic F actor Expressed in E.coli. XIAN Hai2Qing,FAN Ming,WU Yan(Instit ute of B asic Medical Science,A cademy of M ilitary Medical Sciences,Beiji ng100850,China);Q IU Z ong2Y in(Medical U niversity of Chongqi ng, Chongqi ng400046,China).Abstract Renaturation of human cilinary neurotrophic factor expressed in recombinant bacteria,by gel filitration chromatograph,was studied.It was showed that the renaturation rate by this way was higher than that by dilution and dialy2 sis,and the protein was purified at the same time.It was a simple,rapid,good reproducibility and efficient procedure which can be used to produce ciliary neurotrophic factor in large scale.K ey w ords recombinant ciliary neurotrophic factor, renaturation,inclusion body高纯度藻蓝蛋白分离纯化及光谱特性研究3王 勇 钱凯先董 强1)(浙江大学生物科学与技术系,杭州310027)(山东省医学科学院,济南250062)摘要 藻蓝蛋白(PC)具有特征性吸收光谱和荧光光谱,是一种新颖的荧光分子探针.为了获取高纯度PC,经过反复探索研究建立了Sephadex G2200、DEAE2SephadexA225、HA、Sephadex G2200的分离纯化程序。

固液分离和硫酸铵分级沉淀纯化藻蓝蛋白

固液分离和硫酸铵分级沉淀纯化藻蓝蛋白

固液分离和硫酸铵分级沉淀纯化藻蓝蛋白一、目的1掌握提取液的固液分离方法。

2掌握硫酸铵分级沉淀藻蓝蛋白的原理和方法。

3熟练硫酸铵分级沉淀蛋白技术。

二、原理硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。

用此方法可以将提取液中的藻蓝蛋白和杂蛋白分离。

高浓度的盐离子在蛋白质溶液中一方面可与蛋白质竞争水分子,从而破坏蛋白质表面的水化膜,降低其溶解度,另外可以中和蛋白质表面所带电荷,降低蛋白质之间的静电排斥,使之从溶液中沉淀出来。

各种蛋白质的溶解度不同,因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。

这种方法称之为盐析。

采用硫酸铵分级沉淀可以分别沉淀杂蛋白和藻蓝蛋白,实现藻蓝蛋白的纯化。

三、实验器材及试剂1实验仪器及工具:机械搅拌器、冰箱、电子天平、酸度计、漏斗、离心机、三角瓶、烧杯、移液枪等。

2实验原料及试剂硫酸铵、稀酸、稀碱等。

四、实验方法及步骤1、样品准备:打开低温离心机预冷30分钟,将藻蓝蛋白提取液分装至50毫升离心管中,每管装液量约为30~40毫升,不能超过40毫升,每管都要用天平进行称重平衡。

2、固液分离:将平衡好的离心管对称放置,装样品不能对称时,可以用离心管装水对称,盖好盖子后开始离心,离心过程中必须有专人看管,离心结束后必须等到转速降为0才能打开离心机。

3、藻蓝蛋白提取液体积量取:用量筒量取上清液体积并记录,然后将藻蓝蛋白提取液分为设定份数,记录体积(留取1份放至冰箱冷藏)。

4、硫酸铵分级沉淀:根据藻蓝蛋白提取计算出10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%饱和度所需的硫酸铵,分别加入到上述藻蓝蛋白溶液中,机械搅拌均匀后放在4℃静置过夜分级沉淀。

5、沉淀蛋白量测定:将沉淀蛋白固液分离后称取湿重,记录湿重。

五、实验结果记录藻蓝蛋白提取液体积记录藻蓝蛋白溶液颜色观察、记录沉淀蛋白颜色记录沉淀上清液颜色记录六、实验结果分析。

藻蓝蛋白的提取纯化与鉴定(实验教案)

藻蓝蛋白的提取纯化与鉴定(实验教案)

藻蓝蛋白的提取纯化与鉴定(实验教案)藻蓝蛋白(phycocyanin , PC)是一种存在于蓝藻细胞内的光合色素 ,能高效捕获光能。

其分子质量在 40 ku 左右 ,由α、β两个亚基组成 ,亚基分子质量都在 20 ku 左右。

肽链上共价结合 1 个开链的四吡咯环辅基 ,类似动物红细胞的血红素结构。

天然存在的藻蓝蛋白通常以六聚体(αβ) 6的形式存在。

与之相近的别藻蓝蛋白(Anthocyanin ,APC)为三聚体( αβ) 3 ,在 650 nm 处有最大吸收峰。

分离纯化的水溶藻蓝蛋白在溶液中呈蓝色 ,并发出紫色荧光 ,在波长620 nm 具有特异吸收峰 ,可用吸光度 A 620 / A 280表示其纯度。

因其水溶性、无毒、清亮且着色力强等优点 ,藻蓝蛋白被广泛用于食品着色剂和化妆品的添加剂。

藻蓝蛋白带有荧光 ,可用作荧光标记物。

一、教学目的通过藻蓝蛋白的提取纯化与鉴定使学生学会生物大分子制备方案设计与实践研究,体验从复杂细胞混合物体系中提取生物大分子的基本原理、过程和方法。

整个实验过程学生独立完成,虽然操作难度较大,所需要的实间较长(64-80学时),但每一步单元操作的原理清晰,技术成熟,实验结果明显,能给学生较多的动手机会。

有利于培养学生的学习兴趣。

二、实验方案1材料与方法1. 1 实验材料钝顶螺旋藻粉产自中国科学院武汉植物所 ,其他无机盐和酸碱试剂均为国产分析纯试剂。

1. 2 分析方法1.2.1藻蓝蛋白浓度的测定方法一:【曲文娟等,钝顶螺旋藻藻蓝蛋白的脉冲超声辅助提取技术,食品科学,2007年5期,135-138】用紫外分光光度计对粗提的藻蓝蛋白溶液进行全波段扫描, 可见藻蓝蛋白的特征吸收在620nm, 异藻蓝蛋白的特征吸收在:方法二:【刘杨等,水提分离钝顶螺旋藻藻蓝蛋白及其稳定性研究,天津师范大学学报(自然科学版),Vol.28 No.3.11-14(2008)】 螺旋藻中以藻胆蛋白吸收光谱的差异作为其测定标准。

太湖蓝藻藻蓝蛋白的提取及纯化

太湖蓝藻藻蓝蛋白的提取及纯化

太 湖 蓝 藻 藻 蓝 蛋 白 的 提 取 及 纯 化
韩士群 李辉 东 , 严 少华 夏 明珠 , ,
( .江苏省农业科学 院农 业资源与环境研究所 , 1 江苏 南京 20 1 104;2 南京理工 大学 工业 化学研究 所 , . 江苏 南京 2 0 1 ) 10 4
摘要 : 为利 用太湖打捞蓝藻 的蛋 白质 资源 , 用冻融 破壁 、 采 絮凝 、 析 、 析 、 水相萃取 等方 法制备荧光 试 盐 透 双
HAN iq , LIHu — o g ’ Sh . un id n , YAN h o h , XI Mi g z S a — ua A n —hu
( .ntu gi l rl e uc n ni n etl c ne, in s A a e yoA r utrl c ne, aj g2 0 1 , hn 1 Istt o r ut a R s r a dE v om na i cs Ja gu cdm f gi l a i cs N ni 10 4 C i i e fA c u o e r Se c u Se n a;2 Is tto Ids .ntue n u- i f ta hmir,N nn nvrt Si c Tcnlg , a n 104,C i r l e sy aj g U i syo c ne& eh o y N g2 0 1 i C t i ei f e o hn a)
a js dt 0 9 % .A e o c l i y7 5 g L p l r lm n m c lr e te p y o y nn w t te p r y( 6 / dut . 5 e o t f f r c u t n b . / o mei a iu hoi , h h cc a i i h ui A 2 l ao y c u d h t 0

藻蓝蛋白的提取纯化与鉴定(实验教案)

藻蓝蛋白的提取纯化与鉴定(实验教案)

藻蓝蛋白的提取纯化与鉴定(实验教案)藻蓝蛋白(phycocyanin , PC)是一种存在于蓝藻细胞内的光合色素 ,能高效捕获光能。

其分子质量在 40 ku 左右 ,由α、β两个亚基组成 ,亚基分子质量都在 20 ku 左右。

肽链上共价结合 1 个开链的四吡咯环辅基 ,类似动物红细胞的血红素结构。

天然存在的藻蓝蛋白通常以六聚体(αβ) 6的形式存在。

与之相近的别藻蓝蛋白(Anthocyanin ,APC)为三聚体( αβ) 3 ,在 650 nm 处有最大吸收峰。

分离纯化的水溶藻蓝蛋白在溶液中呈蓝色 ,并发出紫色荧光 ,在波长620 nm 具有特异吸收峰 ,可用吸光度 A 620 / A 280表示其纯度。

因其水溶性、无毒、清亮且着色力强等优点 ,藻蓝蛋白被广泛用于食品着色剂和化妆品的添加剂。

藻蓝蛋白带有荧光 ,可用作荧光标记物。

一、教学目的通过藻蓝蛋白的提取纯化与鉴定使学生学会生物大分子制备方案设计与实践研究,体验从复杂细胞混合物体系中提取生物大分子的基本原理、过程和方法。

整个实验过程学生独立完成,虽然操作难度较大,所需要的实间较长(64-80学时),但每一步单元操作的原理清晰,技术成熟,实验结果明显,能给学生较多的动手机会。

有利于培养学生的学习兴趣。

二、实验方案1材料与方法1. 1 实验材料钝顶螺旋藻粉产自中国科学院武汉植物所 ,其他无机盐和酸碱试剂均为国产分析纯试剂。

1. 2 分析方法1.2.1藻蓝蛋白浓度的测定方法一:【曲文娟等,钝顶螺旋藻藻蓝蛋白的脉冲超声辅助提取技术,食品科学,2007年5期,135-138】用紫外分光光度计对粗提的藻蓝蛋白溶液进行全波段扫描, 可见藻蓝蛋白的特征吸收在620nm, 异藻蓝蛋白的特征吸收在:方法二:【刘杨等,水提分离钝顶螺旋藻藻蓝蛋白及其稳定性研究,天津师范大学学报(自然科学版),Vol.28 No.3.11-14(2008)】 螺旋藻中以藻胆蛋白吸收光谱的差异作为其测定标准。

蓝隐藻藻蓝蛋白的分离、纯化及性质研究

蓝隐藻藻蓝蛋白的分离、纯化及性质研究
第2 4卷第 4期
21 年 1 01 O月
烟 台大 学 学报 ( 自然 科学 与工 程版 )
Junl f ati nvr t N tr c neadE gnei dt n ora o na U i sy( a a Si c n nier gE io ) Y ei ul e n i
中藻 胆蛋 白比较 特殊 : 种 隐 藻 只含 有 一 种 藻胆 一 蛋 白 , P , P 不含 A C; 或 C 或 E, P 隐藻 藻 胆蛋 白不像 红 、 藻藻 胆蛋 白那 样组 装 成 藻 胆 体 并 伸 展 在类 蓝
敏治疗等方面 , 更具有广泛的应用前景 [ . 6 ]
目前发 现 的 隐 藻藻 胆 蛋 白有 大约 6种 , 括 包
三聚体或六聚体形式 , 更易作为荧光探针进入细 胞内, 在分子标记 、 示踪 、 临床检测 、 分析及肿瘤光
收稿 日期 : 0 0 1—2 2 1—0 1
基金项 目:国家 自然科学基金资助项 目(0 7 0 3 . 4 96 8 ) 作者简介 :张允允( 9 3 ) 女 , 18 一 , 山东济 宁人 , 硕士研究生 , 研究方 向: 海洋 生物学 ; 通信作者 : 陈敏 (hn c ce m l m@13 6 cm) 教授 , o , 博士.
P 1 , 3 C6 2 6 0和 6 5 以及 P 5 5 5 5和 5 6 文 4, E4 , 5 6,
中选用 的蓝隐 藻 ( hom ns lcie 中的 P C r oa pao ) o d C属
于 P 65型. c一 4 以往纯化藻胆蛋 白多采用羟基磷 灰石柱的层析法 , 本研究设计 了硫铵分级沉淀和 二次 分子筛 层析 分离 流程 , 到 了纯化 的隐藻 得 P, C 并对其性 质作 了初 步的分析. 中性 P G 经 AE

从蓝藻中快速分离纯化C-藻蓝蛋白和异藻蓝蛋白的方法[发明专利]

从蓝藻中快速分离纯化C-藻蓝蛋白和异藻蓝蛋白的方法[发明专利]

专利名称:从蓝藻中快速分离纯化C-藻蓝蛋白和异藻蓝蛋白的方法
专利类型:发明专利
发明人:张玉忠,颜世敢,陈秀兰,张熙颖,周百成
申请号:CN200810014404.0
申请日:20080228
公开号:CN101240010A
公开日:
20080813
专利内容由知识产权出版社提供
摘要:一种从蓝藻中快速分离纯化C-藻蓝蛋白和异藻蓝蛋白的方法,属于藻蓝蛋白分离纯化技术领域。

本发明应用经冻溶和低离子强度溶涨快速提取C-藻蓝蛋白和异藻蓝蛋白,然后经硫酸铵沉淀进行初步纯化,最后利用琼脂糖凝胶FF(DEAE Sepharose Fast Flow)离子交换层析技术,用恒定的离子强度、pH梯度的缓冲液进行洗脱,一步法可以得到高纯度的C-藻蓝蛋白和异藻蓝蛋白。

本方法操作简便,省时省力,对设备要求简单,得率高并且大大降低了CPC和APC的制备成本,从而为将CPC和APC应用于超灵敏的生物医学检测奠定了基础。

申请人:山东大学
地址:250100 山东省济南市历下区山大南路27号
国籍:CN
代理机构:济南金迪知识产权代理有限公司
代理人:许德山
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藻蓝蛋白的生产工艺流程

藻蓝蛋白的生产工艺流程

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在进行藻蓝蛋白的生产之前,藻种培养是关键的第一步。

藻蓝蛋白的提取与纯化

藻蓝蛋白的提取与纯化

藻蓝蛋白的提取与纯化螺旋藻粉提取藻蓝蛋白摘要:藻蓝蛋白是一种可用于配制化妆品及各种天然食品或荧光探针标记的多用途蛋白。

本实验旨在找出最适螺旋藻粉中提取藻蓝蛋白的工业提取工艺。

对藻蓝蛋白的提取,本课题组采用了反复冻融法、水提法、缓冲液法,以找出提取效率高,成本低的方法。

实验结果显示,反复冻融三次的藻蓝蛋白浓度A620/A280分别为:0.819/1.871、0.597/1.676、0.245/0.629;水提法三次的A620/280分别为:0.842/1.768、0.650/1.136、0.177/0.737;缓冲液提取三次的A620/A280分别为:1.040/2.102、0.260/0.630、0.052/0.247。

在蛋白质的分离时,采用两步盐析法,盐析前A620=1.143,A280=1.983;两步盐析后,A620=2.203,A280=1.492。

最后在纯化方法上选择了羟基磷灰石柱分离,得到蛋白样品A620=1.379,A280=0.528。

关键词:螺旋藻;藻蓝蛋白;二次盐析;柱分离介绍:藻蓝蛋白既是一种蛋白质,又是一种很好的天然食用色素,同时又是极好的保健食品。

藻蓝蛋白是自然界中少见的色素蛋白之一,不仅颜色鲜艳,而且本身是一种营养丰富的蛋白质,其氨基酸组成齐全,必需氨基酸含量高。

藻蓝蛋白具有抗癌、促进血细胞再生、养护卵巢、促使人体内合成弹力蛋白等功效。

21世纪初,在欧美、日本等国,藻蓝蛋白广泛用作食品和化妆品的高级天然色素,并被制成生化药品。

因为藻蓝蛋白为胞内蛋白,所以细胞破碎技术是直接影响蛋白提取得率的关键因素之一。

藻蓝蛋白的提取一般有超声波、高压均质、反复冻融、水提法、缓冲液提法等【1】。

本实验通过反复冻融、水提法和缓冲液法对螺旋藻细胞进行破碎提取藻蓝蛋白,对各条件下得到的蛋白溶出率进行了比较分析,确定了各条件下蛋白提取的最佳条件。

在藻蓝蛋白的分离时,主要是把蛋白质与提取液中其他物质分离。

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藻蓝蛋白的分离与纯化
一、实验目的和要求1、了解藻蓝蛋白的生理意义及功能,藻蓝蛋白一般的提取和纯化的方法;
2、掌握蛋白含量测定方法;掌握盐析和离子交换层析纯化蛋白的实验技术。

二、实验原理
藻蓝蛋白(PC)是一类普通存在于蓝藻细胞中的光合辅助色素,也是一种天然色素蛋白,具有水溶性,可用作食品着色剂。

此外,它具有强烈的荧光,在分子生物学上被制成荧光探针,是一种无毒、无副作用的理想光敏剂。

藻蓝蛋白还具有重要的医疗价值,不但能提高机体细胞的非特异性免疫功能,而且对特异性免疫功能有促进作用。

另外,它还具有清除自由基的能力,可以抗疲劳,延缓衰老,对人体的生理功能有重要的生物学意义。

利用盐析沉淀蛋白质的基本原理:盐在水溶液中电离所形成的正负离子NH可吸引水分子,从而夺取蛋白质分子上的水化膜,还可中和部分电荷,致使蛋白质聚集,从而达到盐析沉淀蛋白质的目的。

由于各种蛋白质颗粒大小、所带电荷的多少及亲水程度不同,当使用某种中性盐对其进行盐析时,所需的最低盐浓度各不相同研究表明可用25%(NH4)2SO4 饱和度沉淀除去杂质,55%(NH4)2SO4 沉淀藻蓝蛋白。

盐析出来的蛋白质,需通过脱盐以除去硫酸铵等盐类物质。

最常用的脱盐方法是透析。

蛋白质是大分子物质,它不能透过半透膜,而小分子物质可以自由透过半透膜,顾不断更换蒸馏水或缓冲液可将盐类等小分子杂质透析掉。

蛋白含量的测定有紫外分光光度计法和显色法(Folin-酚法、考马斯亮蓝法等)本实验采用考马斯亮蓝法测定提取藻蓝蛋白的,含量,考马斯亮蓝G-250 在酸性溶液中为棕红色,当它与蛋白质通过疏水作用后变为蓝色,最大光吸收由465nm 变为595nm,在一定范围内,蛋白质的含量与595nm 处吸光值成正比。

离子交换层析法纯化蛋白质,常用的阳离子交换剂有弱酸性的羧甲基纤维素(CM-纤维素),阴离子交换剂有弱酸性的二乙氨基乙基纤维素(DEAE-纤维素)。

蛋白质的混合物与纤维素离子交换剂的酸性基团或碱性基团结合,结合力的大小取决于彼此间相反电荷基团的静电引力。

因此,被吸附的蛋白质的洗脱通过改变PH 或离子强度来实现,与离子交换剂结合力小的蛋白质首先从层析柱中被洗脱下来。

本实验以蓝藻为材料,采用反复冻融、分步盐析法对藻蓝蛋白进行提取和初步纯化,采用考马斯亮蓝法测定提取藻蓝蛋白的含量,然后使用DEAE-纤维素柱层析对提取的藻蓝蛋白进一步纯化(由于来源不同和种类的差别,目前研究报道的藻蓝蛋白等电点尚无一致结论,但都在3.4-4.8 之间,其中钝顶螺旋藻藻蓝蛋白的等电点为4.3,在PH6.5 磷酸盐缓冲液中带负电,所以选择DEAE-纤维素阴离子交换柱)。

预期得到纯度较高的藻蓝蛋白。

三、试剂与仪器
1、试剂螺旋藻藻粉0.01mol/L 磷酸盐缓冲液(PH6.5)、标准蛋白(0.1mg/L)、考马斯亮蓝G-250、0.5mol/LNaOH、0.5mol/LHCl、NaCl、0.5mol/LHCl、NaCl、硫酸铵、透析袋、DEAE 纤维素、奈氏试剂
四、实验步骤
(一)、藻蓝蛋白的提取及初步纯化
1、藻蓝蛋白抽提:采用反复冻融法破碎细胞,磷酸盐缓冲液浸提蛋白。

具体操作:取螺旋藻粉1g,加入0.01mol/LPH6.5 的磷酸盐缓冲液10mL,充分搅拌混匀。

室温浸泡30min-1h 后,在-20℃和38℃之间反复冻融数次(3-5 次)。

细胞破碎后,将悬浮液移入离心管,加入10mL0.01moL/L PH6.5 的磷酸盐缓冲液,混匀,静止30min,4000r/min 离心20min ,上清液即为抽提得到的藻蓝蛋白混合液。

2、分步盐析:采用不同浓度的硫酸铵分步盐析初步纯化出藻蓝蛋白。

具体操作:取上清液,用25%饱和度的硫酸铵4℃盐析30min ,然后4000r/min 离心20min,所得上清液用55%饱和度的硫酸铵放入冰箱盐析30min,4000r/min 离心20min,弃去上清液,离心收集得到沉淀即为藻蓝蛋白。

3、透析去盐得到的沉淀用10mL0.01moL/Mlph6.5 的磷酸盐缓冲液溶解,然后将藻蓝蛋白粗提液置于透析袋(截留分子质量为10Kd)中在蒸馏水中透析以去除盐离子。

每隔1h 换一次透析液,换3-4 次。

(二)藻蓝蛋白含量测定1、制作标准曲线;2、样品含量测定;3、计算结果。

具体操作步骤如下:取洁净干燥的试管若干,按表1-1 比例配置标准蛋白溶液。

原本标准蛋白的浓度为0.1mg/mL。

表1-1 标准溶液配置管号标准蛋白(mL)蒸馏水(mL)1 0 1 2 0.2 0.8 3 0.4 0.6 4 0.6 0.4 5 0.8 0.2 6 1.0 0 混匀此6 组试管中的标准蛋白溶液,分别加入4mL 考马斯亮蓝G-250,摇匀(充分混匀),室温放置5min 后在595nm 波长处别色,以1 号试管调零点,得到5 组标准蛋白溶液在595nm 处的吸光值A595。

以标准蛋白浓度(mg/mL)为横坐标,以A595 值为纵坐标作图,得到的趋势线即标准曲线。

将提取的藻蓝蛋白溶液1mL 适当稀释(6-10 倍左右),再取0.2mL,补充水到1mL,同上进行比色操作,得到其595nm 处的吸光值,通过标准曲线推算其含量。

(三)藻蓝蛋白纯度的测定测定A620 和A280 值,纯度可用A620/A280 来表示。

将上述稀释后的样品,用可见分光光度计,测定其在620nm 波长处的
吸光值A620;再将样品转出,装入石英比色皿,放入紫外分光光度计,测定其在280nm 波长处的吸光值A280。

由于藻蓝蛋白在620nm 波长处有特征吸收峰,其纯度可以用A620/A280 来表示。

因此,根据在可见和紫外分光光度计中得到的数据就可以推算出提取的藻蓝蛋白样品的纯度。

(四)藻蓝蛋白的进一步纯化
1、DEAE-纤维素处理、装柱和平衡
2、上样、洗脱
3、测定纯化的蛋白浓度和纯度,并分别计算回收率和纯化倍数。

具体操作:3.测定纯化的蛋白浓度和纯度,并分别计算回收率和纯化倍数。

具体操作:用三倍柱床体积的0.01mol/LpH6.5 磷酸盐缓冲液平衡。

将初步纯化得到的藻蓝蛋白液上DEAE-纤维素柱,采用0.01mol/LpH6.5 磷酸缓冲液洗脱(含0.4mol /LNaCI)进行洗脱,柱上层的深蓝色部分大多被迅速洗脱下来,只残留少量蓝色。

流速控制在10d/min,用小试管收集洗脱液,每管收集2mL(或30 滴),收集10-12 管(呈现蓝色的液体内含有目的蛋白)。

测定每管样品的A620,横横坐标洗脱体积、纵坐标A620 值,绘制洗脱曲线。

合并所有管中的样品,A620 和A280 值,计算纯度。

然后用0.01mol/LpH6.5 磷酸缓冲液(含0.6mol/LNaCI)洗脱,洗脱下的是藻蓝蛋白。

柱料的再生:用0.5ml/LHCl 溶液处理柱料,洗2-3 倍柱床体积,用水洗至pH6.0,0,01mol/LpH6.5 磷酸缓冲液平衡。

四、数据处理及实验结果
表四根据数据制作藻蓝蛋白的洗脱曲线
六、思考题1、蛋白含量测定方法有哪些?各有什么特点?
(1)、微量凯氏定氮法,(2)、Folin-酚法,(3)紫外吸收法,、特点:操作简便迅速,且不消耗样品(可以回收),低浓度的盐类不干扰测定。

(4)、考马斯亮蓝染色法,
2、盐析分离蛋白的原理是什么?盐在水溶液中电离所形成的正负离子NH可吸引水分子,从而夺取蛋白质分子上的水化膜,还可中和部分电荷,致使蛋白质聚集,从而达到盐析沉淀蛋白质的目的。

由于各种蛋白质颗粒大小、所带电荷的多少及亲水程度不同,当使用某种中性盐对其进行盐析时,所需的最低盐浓度各不相同研究表明可用25%(NH4)2SO4 饱和度沉淀除去杂质,55%(NH4)2SO4 沉淀藻蓝蛋白。

盐析出来的蛋白质,需通过脱盐以除去硫酸铵等盐类物质。

最常用的脱盐方法是透析。

蛋白质是大分子物质,它不能透过半透膜,而小分子物质可以自由透过半透膜,顾不断更换蒸馏水或缓冲液可将盐类等小分子杂质透析掉。

3、离子交换层析纯化蛋白的原理?离子交换层析法纯化蛋白质,常用的阳离子交换剂有弱酸性的羧甲基纤维素(CM-纤维素),阴离子交换剂有弱酸性的二乙氨基乙基纤维素(DEAE-纤维素)。

蛋白质的混合物与纤维素离子交换剂的酸性基团或碱性基团结合,结合力的大小取决于彼此间相反电荷基团的静电引力。

因此,被吸附的蛋白质的洗脱通过改变PH 或离子强度来实现,与离子交换剂结合力小的蛋白质首先从层析柱中被洗脱下来。

4、藻蓝蛋白的功能有哪些?广泛用于食品着色剂和化妆品的添加剂。

藻蓝蛋白带有荧光, 可用作荧光标记物藻蓝蛋白具有刺激红细胞集落生成,类似红细胞生成素(epo)的作用;藻蓝蛋白具有补血、调整白血球和提高淋巴细胞活性的作用;增加体能、促进红血球增长,能增进机体免疫功能,促进生长发育;藻蓝蛋白还具有抑制某些癌细胞的作用;具有很高的营养价值和医
疗价值。

藻蓝蛋白作为天然食用色素,它可以改善食品的色泽,不仅能提高食品的档次,而且能增加食品中的功能成份。

藻蓝蛋白是少见的色素蛋白之一。

它不仅颜色鲜艳,而且本身是一种营养丰富的蛋白质,其氨基酸组成齐全,必需氨基酸含量高。

藻蓝蛋白是水溶性色素,清亮鲜艳,外观悦目可爱,可作为食品、化妆品的添加剂。

七、注意事项1、标准曲线制作规范、准确,样品含量测定准确;
2、藻体细胞要反复冻融3 次以上,确保细胞全部破碎;
3、注意离心机使用;
4、DEAE-纤维素柱层析,洗脱液的离子浓度严格控制。

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