MicroRNA腺病毒表达系统使用手册0828
腺病毒中文操作手册
腺病毒中文操作手册腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统AdEasyTM操作手册目录第一章简介 1第二章应用重组腺病毒的优点 2第三章 AdEasyTM 技术 33.1 技术概况 33.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3第四章主要流程 44.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体44.1.1 克隆的一般原则 44.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体 54.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生 54.2.1 共转化的一般原则 54.2.2 共转化方法 54.2.3 预期结果 54.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A 细胞 64.4.1 细胞铺板 64.4.2 磷酸钙转化技术 7第五章常用技术 85.1 QBI-293A细胞培养 85.1.1 QBI-293A细胞的初始培养85.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖 85.1.3 QBI-293A细胞的冻存8 5.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生 95.2.1 感染QBI-293A细胞 95.2.2 病毒空斑形成 95.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞 9 5.3 MOI测定 105.4 腺病毒感染力测定 105.4.1 X-Gal染色 115.5 重组腺病毒的筛选和纯化 115.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表达和基因输送 115.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增125.5.3 Western杂交 135.5.4 Southern杂交和点杂交 135.5.5 病毒裂解产物PCR 145.5.6 免疫测定 145.5.7 功能测定 145.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增 155.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒 165.7.1 不连续密度梯度离心 175.7.2 连续密度梯度离心 175.7.3 病毒溶液去盐和浓集 17 5.8 病毒滴度测定 18 5.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 195.8.2 空斑测定法 205.8.3 50%组织培养感染剂量法 20 第六章疑难解答 226.1 QBI-293A细胞培养 226.2 感染力测定 226.3 转移载体克隆 236.4 在BJ5183细胞中共转化和重组246.5 转染QBI-293A细胞 256.6 筛选和测定 256.7 在QBI-293A细胞中表达 266.8 重组腺病毒的扩增 266.9 纯化 266.10 病毒滴度测定 27缩写英文全称中文全称Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白cDNA Complementary DNA 互补DNA cccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋DNACPE Cytopathic Effect 细胞病理效应CsCl Cesium Chloride 氯化铯DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM培养基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清Hr Hour 小时ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复Kan Kanamycin 卡那霉素kb Kilobases 千碱基对KDa KiloDaltons 千道尔顿LB Luria-Bertani ( broth ) LB培养基MCS Multiple Cloning Site 多克隆位点Min Minute 分钟MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell ) 感染复数mRNA Messenger RNA 信使RNA MWCO MOIecular Weight Cut-off PAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯凝胶电泳PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲液PFU Plaque Forming Unit 空斑形成单位pi Post Infection 感染后RCA Replication Competent Adenovirus 增殖性腺病毒RITR Right Inverted Terminal Repeat 右侧反向末端重复SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸钠TBE Tris Borate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸TCID50 Tissue Culture Infectious Dose 50 50%组织培养感染剂量TCP Total Cellular Protein 细胞总蛋白TE Tris/EDTA TE溶液wt Wild Type 野生型X-Gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Gal actopyranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷第一章简介当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。
腺病毒中文操作手册
腺病毒中文操作手册腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统AdEasyTM操作手册目录第一章简介 1 第二章应用重组腺病毒的优点 2 第三章AdEasyTM 技术 3 3.1 技术概况 3 3.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3 第四章主要流程 4 4.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体 44.1.1 克隆的一般原则 4 4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体54.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生54.2.1 共转化的一般原则 54.2.2 共转化方法 54.2.3 预期结果 5 4.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增 6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A 细胞 64.4.1 细胞铺板 64.4.2 磷酸钙转化技术7 第五章常见技术85.1 QBI-293A细胞培养8 5.1.1 QBI-293A细胞的初始培养8 5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存8 5.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生9 5.2.1 感染QBI-293A细胞95.2.2 病毒空斑形成9 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞9 5.3 MOI测定10 5.4 腺病毒感染力测定105.4.1 X-Gal染色11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化11 5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表示和基因输送11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增125.5.3 Western杂交13 5.5.4 Southern杂交和点杂交13 5.5.5 病毒裂解产物PCR 145.5.6 免疫测定145.5.7 功能测定14 5.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒16 5.7.1 不连续密度梯度离心17 5.7.2 连续密度梯度离心17 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集17 5.8 病毒滴度测定185.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 195.8.2 空斑测定法20 5.8.3 50%组织培养感染剂量法20 第六章疑难解答226.1 QBI-293A细胞培养22 6.2 感染力测定22 6.3 转移载体克隆23 6.4 在BJ5183细胞中共转化和重组246.5 转染QBI-293A细胞25 6.6 筛选和测定25 6.7 在QBI-293A细胞中表示26 6.8 重组腺病毒的扩增26 6.9 纯化26 6.10 病毒滴度测定 27缩写英文全称中文全称Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白cDNA Complementary DNA 互补DNA cccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋DNA CPE Cytopathic Effect 细胞病理效应CsCl Cesium Chloride 氯化铯DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM培养基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清Hr Hour 小时ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复Kan Kanamycin 卡那霉素kb Kilobases 千碱基对KDa KiloDaltons 千道尔顿LB Luria-Bertani ( broth ) LB培养基MCS Multiple Cloning Site 多克隆位点Min Minute 分钟MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell ) 感染复数mRNA Messenger RNA 信使RNA MWCO MOIecular Weight Cut-off PAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯凝胶电泳PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲液PFU Plaque Forming Unit 空斑形成单位pi Post Infection 感染后RCA Replication Competent Adenovirus 增殖性腺病毒RITR Right Inverted Terminal Repeat 右侧反向末端重复SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸钠TBE Tris Borate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸TCID50 Tissue Culture Infectious Dose50 50%组织培养感染剂量TCP Total Cellular Protein 细胞总蛋白TE Tris/EDTA TE溶液wt Wild Type 野生型X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷第一章简介当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。
赛默飞世尔TaqMan MicroRNA Assays 简要操作说明说明书
快速参考手册TaqMan MicroRNA Assays简要操作说明（Rev.A.0）本操作说明提供了TaqMan MicroRNA Assays的简要操作指南。
更详细信息，请至赛默飞世尔官方网站下载英文版说明书：https:///content/sfs/manuals/cms_042167.pdf一．配制反转录体系1.准备总RNA（1）注意：应选择适当的提取方法，避免提取过程中丢失microRNA（2）RNA定量2.准备反转录预混液（1）将Taqman MicroRNA反转录试剂盒中的组分放在冰上融化后涡旋混匀。
（2）准备一支无RNA酶的离心管，参照下表，在冰上配制反转录预混液。
组成成分反应体系100mM dNTPs(with dTTP)0.15µl反转录酶 1.00µl10X反转录buffer 1.50µlRNase抑制剂0.19µl无核酸酶H2O 4.16µl总体积7.00µl（3）涡旋混匀，离心。
（4）将反转录预混液放置在冰上备用。
3.配制反转录体系（1）在冰上将5x反转录引物和RNA模板融化。
涡旋混匀。
（2）15µl的反转录体系中，加入1-10ng RNA（5µl），7µl反转录预混液，3µl反转录引物，涡旋混匀，离心。
（3）将反应管放在冰上放置5分钟，然后进行反转录实验。
4.设置反转录步骤将反应管放入PCR仪内，按照下列的反应程序进行设置：模式：标准模式，反应体积：15µl阶段时间温度退火30分钟16°C延伸30分钟42°C失活5分钟85°C∞4°C2二．定量PCR 扩增1.准备定量PCR 反应体系（1）将反应用到的组分放在冰上融化，混匀后放置冰上备用。
（2）按照20µl 反应体系计算所需要的试剂量。
将各组分加入离心管中，涡旋混匀，离心。
MicroRNA培训教材
一、microRNA简介1．什么是microRNAmicroRNAs（microRNAs）是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长约19~23个核苷酸。
成熟的microRNAs是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，随后组装进RNA诱导的沉默复合体，通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。
最近的研究表明microRNA参与各种各样的调节途径，包括生物个体发育、病毒防御、组织分化、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢、参与原癌基因作用等等。
2. MicroRNA的发现1993年，Lee，Feinbaum和Ambros等人发现在线虫体内存在一种RNA （lin-4），是一种不编码蛋白但可以生成一对小的RNA转录本，每一个转录本能在翻译水平通过抑制一种核蛋白lin-14的表达而调节了线虫的幼虫发育进程。
对于出现这种现象的原因，科学家们猜测是由于基因lin-14的mRNA的3'UTR 区独特的重复序列和lin-4之间有部分的序列互补造成的。
在第一幼虫阶段的末期降低lin-14的表达将启动发育进程进入第二幼虫阶段。
7年后科学家又发现了第二个microRNA－let-7，let-7相似于lin-4，同样可以调节线虫的发育进程。
自从let-7发现以来，应用随机克隆和测序、生物信息学预测的方式，又分别在众多生物体如病毒、家蚕和灵长类动物中发现了上千个的microRNAs。
被鉴定的microRNAs均被miRBase网站整理并加以注释。
此网站由著名的Sanger研究所主办，并对公众开放。
（/）3. microRNA的产生与作用机制microRNA基因以单拷贝、多拷贝或基因簇等多种形式存在于基因组中，约60%microRNA单独表达，15%的microRNA一基因簇的形式表达，而25%的microRNA位于基因的内含子中，与基因同时被转录。
microRNA过表达载体具体步骤及说明
microRNA过表达载体具体步骤及说明microRNA 过表达载体具体使用说明及步骤MicroRNA（miRNA）是一类真核生物内源性的小分子单链RNA，通常长为18~25nt，能够通过与靶mRNA 特异性的碱基配对结合，引起靶序列降解或抑制其翻译，从而对基因进行转录后的表达调控（如右图所示）。
GenePharma MicroRNA 载体利用CMV 启动子可以在众多哺乳动物细胞中快速、高效、持续表达pre-miRNA，经过Drosha（RNase Ⅲ）作用形成small hairpin pre-miRNAs。
在使用载体法针对某一MicroRNA 进行过表达研究过程中，通常会遇到如下几个问题：实验对照组的确立、细胞转染条件的确定、基因表达效率的检测。
1、实验对照组的确立在一个完善的MicroRNA 表达实验设计中，必须考虑设立正确合理的实验对照组。
通常，这些对照组包括载体阴性对照组、转染试剂对照组。
载体阴性对照可以有两种，一种是采用通用的阴性对照组，在本试剂盒中包括了该对照所需的载体（microRNA），可以表达与目的基因序列无同源性的microRNA 片段；另一种是将目的microRNA 的序列打乱后重新组合所得的阴性对照（scrambled）。
对照组的设立对于MicroRNA 表达研究是很有必要的，您可以利用载体对照来确认microRNA 实验中转染、RNA提取和基因表达检测方法的可靠性。
2、细胞转染条件的确定使用MicroRNA 载体转染细胞时，为了选择合适的转染方法和确定转染效率，通常采用报告基因来检测DNA 的导入情况。
最常用的报告基因是绿色荧光蛋白。
3、MicroRNA 表达的检测通常用两大类方法来检测MicroRNA 表达效率，一类方法是直接检测MicroRNA 的变化水平，常用的方法如northern 杂交、芯片（microarrays）以及核糖核酸酶保护分析，但这些传统的方法都需要用到标记探针与纯化的RNA 进行杂交，由于成熟的miRNAs 及其前体共享一段共同的靶序列，而且目前的这些方法有无法通过大小将其分开，因此很难专一识别成熟的MicroRNA，导致较高的背景信号。
miRNA腺病毒操作手册-推荐下载
miRNA腺病毒操作手册miRNA简介MicroRNAs（miRNAs）是一类长度为18-24个核苷酸的非编码RNA分子。
MiRNA通过与靶基因mRNA上的互补序列结合，降解mRNA或抑制mRNA的翻译。
MiRNAs在细胞分化、增殖、凋亡和癌细胞发生中发挥重要的调控作用。
MiRNAs 来源于具有60-80 个核苷酸茎环结构的microRNA 前体（premir）和序列更长一些的microRNA初级转录产物（primir）。
MiRNA在核内由RNA聚合酶II（polII）转录生成，最初产物primir具有帽子结构和多聚腺苷酸尾巴。
ViGene生物的mirAD-腺病毒microRNA前体表达系统包括三个相关产品：microRNA前体穿梭载体、microRNA前体腺病毒载体和预制microRNA前体腺病毒。
microRNA前体腺病毒简介重组腺病毒是进行基因转移和表达的工具，功能强大且易于操作。
腺病毒独特的生物学特征使它成为“载体的首选”，被科研工作者广泛应用。
首先，它能够感染包括分裂、非分裂细胞和干细胞在内的多种细胞。
第二，病毒滴度高。
第三，高滴度的病毒可获得高感染效率和高表达量。
第四，病毒进入细胞后，病毒基因组不整合到细胞染色体上，因此瞬时表达外源基因的重组腺病毒不会诱导宿主细胞中染色体的变化。
ViGene生物选用的是应用最广泛的复制缺陷型的人类血清5型腺病毒，该腺病毒载体缺失E1和E3基因。
E1 基因在组装感染性病毒颗粒时必不可少，可在HEK293T细胞病毒包装过程中得到补充，而E3基因可有可无。
由于E1和E3基因的缺失，腺病毒载体可插入高达7.5kb的外源基因。
pMir-microRNA precursor 是基于microRNA 前体表达系统的质粒。
microRNA前体天然的茎环结构被克隆到质粒的SgfI和MluI双酶切位点。
为了保持推测的发卡结构和诱导正确的内源性反应，miRNA茎环结构的两侧具有它的150-200bp的天然序列。
腺相关病毒操作手册
腺相关病毒操作手册一、腺相关病毒（Adeno-Associated Viral Vector，AAV）简介腺相关病毒属微小病毒科(parvovirus)，为无包膜的单链线状DNA病毒。
AA V的基因组约4700bp，包括上下游两个开放读码框架(ORF)，位于分别由145个核苷酸组成的2个反向末端重复序列(ITR)之间。
基因组中有3个启动子(P5、P19和P40)和2个开放阅读读框(ORF)，rep和cap，如图1所示。
rep编码4个重叠的多功能蛋白，即Rep78、Rep68、Rep52和Rep40，其中Rep78与Rep68参与AA V的复制与整合，Rep52和Rep40具有解螺旋酶和ATP酶活性，与Rep78、Rep68共同参与单链基因组的复制；cap编码的VP1、VP2、VP3是装配成完整病毒所需要的衣壳蛋白，它们在AA V病毒整合、复制和装配中其重要作用。
图1.AA V基因结构二、腺相关病毒的优点1.安全性高：迄今从未发现野生型AA V对人体致病，重组AA V基因组序列上去除了大部分的野生型AA V基因组元件，进一步保证了安全性；2.免疫原性低：AA V2的基因组仅4681个核苷酸，便于用常规的重组DNA技术进行操作，而且进行动物实验时造成的免疫反应小；3.宿主范围广：能感染分裂细胞和非分裂细胞；4.表达稳定：能介导基因的长期稳定表达；5.物理性质稳定：在60℃不能被灭活，能抗氯仿；（汉恒--AAV包装）三、重组腺相关病毒载体系统简介AAV是一种复制缺陷型微小病毒，其增殖复制需要腺病毒或疱疹病毒的辅助。
AAV无辅助病毒系统（AAV Helper-Free System）可以在无辅助病毒的条件下生产出重组腺相关病毒。
在AAV Helper-Free System中，生产具有感染性的AAV病毒颗粒所需的腺病毒基因产物（如：E2A，E4等基因）大部分由pHelper质粒提供，其余的腺病毒基因产物由稳定表达腺病毒E1基因的AAV-293宿主细胞提供。
MicroRNA
腺病毒中文操作手册
腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统AdEasyTM 操作手册目录第一章简介 1 3.2AdEasyTM 系统中产生重组腺病毒的时程 3第二章应用重组腺病毒的长处 2 第四章主要流程 4第三章 AdEasyTM 技术 3 4.1 将基因克隆入 AdEasyTM 转移载体 43.1 技术概略 3缩写英文全称中文全称AdAdenovirus 腺病毒LBLuria-Bertani(broth)LB 培育基Ad5Adenovirusserotype5 血清 5 型腺病毒MCSMultipleCloningSite 多克隆位点AdVAdenoviralVector 腺病毒载体MinMinute 分钟AmpAmpicillin 氨苄青霉素MOIMultiplicityofInfection(Virus/Cell) 感染复数β-Gal β-Galactosidase - 半β乳糖苷酶mRNAMessengerRNA 信使 RNAbpBasePair 碱基对MWCOMOIecularWeightCut-offBSABovineSerumAlbumin 小牛血清白蛋白PAGEPolyAcrylamideGelElectrophoresis 聚丙烯凝胶电泳cDNAComplementaryDNA 互补 DNA PBSPhosphateBufferedSaline 磷酸盐缓冲液cccDNAClosedCircularCoiledDNA 闭环螺旋 DNA PFUPlaqueFormingUnit 空斑形成单位CPECytopathicEffect 细胞病理效应piPostInfection 感染后CsClCesiumChloride 氯化铯RCAReplicationCompetentAdenovirus 增殖性腺病毒DMEMDulbecco’ sModifiedEagleMediumDMEM 培育基RITRRightInvertedTerminalRepeat 右边反向尾端重复DMSODimethylSulfoxide 二甲基亚砜SDSSodiumDodecylSulfate 十二烷基硫酸钠DTTDithiothreitol 二硫苏糖醇TBETrisBorate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四EDTAEthyleneDiamineTetraaceticAcid 乙二胺四乙酸乙酸EtBrEthidiumBromide 溴化乙锭TCID50TissueCultureInfectiousDose5050% 组织培育感染剂FBSFetalBovineSerum 胎牛血清量HrHour 小时TCPTotalCellularProtein 细胞总蛋白ITRInvertedTerminalRepeat 反向尾端重复TETris/EDTATE 溶液KanKanamycin 卡那霉素wtWildType 野生型kbKilobases 千碱基对X-Gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside5- 溴KDaKiloDaltons 千道尔顿-4-氯 -3-吲哚 -β-D- 半乳糖苷第一章简介此刻基因输送技术的发展日益复杂，一些治疗药物（生长激素、扰乱素、抗病毒和抗癌复合物）和诊疗性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。
miRNA产品使用说明
网址： Tel: 400-686-0075
表4 动物实验antagomir用量参考
Reference
al.
miR-122
Nature. 2005
miR-192
Jan Krützfeldt , et al.
Nucleic Acids Research.
500µl (400µl+50µl+50µl)
500µl (400µl+50µl+50µl)
12-well
1mL (800µl+100µl+100µl)
1mL (800µl+100µl+100µl)
1mL (800µl+100µl+100µl)
1mL (800µl+100µl+100µl)
1mL (800µl+100µl+100µl)
miR-16
2007
Alessandra Care, et al. Nature Medicine. 2007
miR-133
Animals 6-week-old
mice
6-week-old mice
8-week-old mice
Laura Fontana, et al. PLoS ONE. 2008
miR-206
HeLa,
50 nM
N/A
MDA-231,MCF-7
R Luthra1, et al. Oncogene,2008
miR-196a
Breast cancer
40 nM
N/A
Hua Zhua, et al. Biochem Pharmacol. 2008
microRNA在心血管系统中的表达和功能_刘媛圆
microRNA 在心血管系统中的表达和功能刘媛圆综述 杨新春 蔡 军审校=摘要> micro RNA (miRNA,m iR)是一类调控基因,在心血管系统中的角色和功能的相关研究甚多。
在生理状态下,m iR -1和m iR -133调控心肌细胞分化、心脏形态的形成及心肌细胞凋亡。
在病理状态下,心肌肥厚的发生与m iR -1、m iR -133、miR -21下调有关;一系列miRNA 参与冠心病多个病理过程,如m iR -126表达减少导致内皮炎性反应增强,miR -199下调促进心肌缺氧,心肌梗死后抑制m iR -92可促进心血管生成,miR -29、miR -30、m iR -133表达减少以促进心肌纤维化等;miR -1与miR -133可通过改变离子通道进而影响心肌自律性、传导性等多种途径引发相关心律失常;上调的miR -1、m iR -133、miR -21对心力衰竭起保护性作用。
=关键词> microRNA;细胞分化;心肌肥厚;冠心病;心律失常;心力衰竭DOI:10.3969/j.issn.1673-6583.2010.02.012 基金项目:国家自然科学基金(30770875);国家自然基金重大计划(90919054)作者单位:100020 首都医科大学附属北京朝阳医院心脏中心 通讯作者:杨新春,Email:yan gxc @micro RNA (miRNA,m iR)是一种内源性非编码RNA,在动物种系发生中具有保守序列,在基因表达的调控中发挥重要作用,通过识别靶向m RNA 的3c 非转录区(3c untranslated regio n,3c UT R),调节转录后基因沉默,促进mRN A 降解或抑制其转录发挥蛋白水平的调节功能,从而参与许多重要的生物进程。
miRNA 具有组织特异性[1],其在心血管系统生理和病理状态下均发挥作用。
1 生理条件下的表达和功能1.1 心肌细胞分化和心脏形态学在miRNA 家族中,miR -1和miR -133被认为具有心肌组织特异性,可维持分化和增值的平衡、诱导祖细胞向心肌细胞的分化,而缺失时则可能出现室间隔缺损等形态学异常。
腺病毒中文操作手册
腺病毒中⽂操作⼿册腺病毒载体操作⼿册中⽂版腺病毒重组系统AdEasyTM操作⼿册⽬录第⼀章简介13.2AdEasyTM系统中产⽣重组腺病毒的时程3第四章主要流程2 4第⼆章应⽤重组腺病毒的优点4.1技术3 将基因克隆⼊AdEasyTM转移载体4 第三章AdEasyTM4.1.13 3.1技术概况缩写英⽂全称中⽂全称AdAdenovirus腺病毒LBLuria-Bertani(broth)LB培养基MCSMultipleCloningSite5Ad5Adenovirusserotype5⾎清型腺病毒多克隆位点分钟腺病毒载体MinMinuteAdV AdenoviralVector AmpAmpicillin氨苄青霉素感染复数MOIMultiplicityofInfection(Virus/Cell) -半乳糖苷酶β-Galβ-GalactosidaseβRNA mRNAMessengerRNA信使MWCOMOIecularWeightCut-offbpBasePair碱基对PAGEPolyAcrylamideGelElectrophoresisBSABovineSerumAlbumin⼩⽜⾎清⽩蛋⽩聚丙烯凝胶电泳PBSPhosphateBufferedSaline磷酸盐缓冲液互补cDNAComplementaryDNADNADNA 闭环螺旋空斑形成单位PFUPlaqueFormingUnitcccDNAClosedCircularCoiledDNA CPECytopathicEffect细胞病理效应感染后piPostInfection CsClCesiumChloride氯化铯RCAReplicationCompetentAdenovirus增殖性腺病毒培养基DMEMDulbecco'sModifiedEagleMediumDMEM RITRRightInvertedTerminalRepeat右侧反向末端重复DMSODimethylSulfoxide⼆甲基亚砜SDSSodiumDodecylSulfate⼗⼆烷基硫酸钠⼄⼆胺四/⼆硫苏糖醇DTTDithiothreitol TBETrisBorate/EDTA三羟甲基氨基甲烷硼酸盐EDTAEthyleneDiamineTetraaceticAcid⼄⼆胺四⼄酸⼄酸组织培养感染剂TCID50TissueCultureInfectiousDose5050%溴化⼄锭EtBrEthidiumBromide量FBSFetalBovineSerum胎⽜⾎清TCPTotalCellularProtein细胞总蛋⽩⼩时HrHourITRInvertedTerminalRepeat反向末端重复溶液TETris/EDTA TE 卡那霉素KanKanamycin wtWildType野⽣型溴千碱基对X-Gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside5-kbKilobases半乳糖苷-3--4-氯吲哚-千道尔顿KDaKiloDaltons β-D-第⼀章简介当今基因输送技术的发展⽇趋复杂，⼀些治疗药物（⽣长激素、⼲扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋⽩（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更⾼效的基因输送⼯具。
microRNA 过表达载体具体步骤及说明
microRNA 过表达载体具体使用说明及步骤MicroRNA（miRNA）是一类真核生物内源性的小分子单链RNA，通常长为18~25nt，能够通过与靶mRNA 特异性的碱基配对结合，引起靶序列降解或抑制其翻译，从而对基因进行转录后的表达调控（如右图所示）。
GenePharma MicroRNA 载体利用CMV 启动子可以在众多哺乳动物细胞中快速、高效、持续表达pre-miRNA，经过Drosha（RNase Ⅲ）作用形成small hairpin pre-miRNAs。
在使用载体法针对某一MicroRNA 进行过表达研究过程中，通常会遇到如下几个问题：实验对照组的确立、细胞转染条件的确定、基因表达效率的检测。
1、实验对照组的确立在一个完善的MicroRNA 表达实验设计中，必须考虑设立正确合理的实验对照组。
通常，这些对照组包括载体阴性对照组、转染试剂对照组。
载体阴性对照可以有两种，一种是采用通用的阴性对照组，在本试剂盒中包括了该对照所需的载体（microRNA），可以表达与目的基因序列无同源性的microRNA 片段；另一种是将目的microRNA 的序列打乱后重新组合所得的阴性对照（scrambled）。
对照组的设立对于MicroRNA 表达研究是很有必要的，您可以利用载体对照来确认microRNA 实验中转染、RNA提取和基因表达检测方法的可靠性。
2、细胞转染条件的确定使用MicroRNA 载体转染细胞时，为了选择合适的转染方法和确定转染效率，通常采用报告基因来检测DNA 的导入情况。
最常用的报告基因是绿色荧光蛋白。
3、MicroRNA 表达的检测通常用两大类方法来检测MicroRNA 表达效率，一类方法是直接检测MicroRNA 的变化水平，常用的方法如northern 杂交、芯片（microarrays）以及核糖核酸酶保护分析，但这些传统的方法都需要用到标记探针与纯化的RNA 进行杂交，由于成熟的miRNAs 及其前体共享一段共同的靶序列，而且目前的这些方法有无法通过大小将其分开，因此很难专一识别成熟的MicroRNA，导致较高的背景信号。
micro RNA
MicroRNAs（miRNAs）是一种大小约21—23个碱基的单链小分子RNA，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大 小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成，不同于siRNA（双链）但是和siRNA密切相关。据推测，这些非编码 小分子RNA（miRNAs）参与调控基因表达，但其机制区别于siRNA介导的mRNA降解。第一个被确认的miRNA是在线 虫中首次发现的lin-4和let-7，随后多个研究小组在包括人类、果蝇、植物等多种生物物种中鉴别出数百个 miRNAs。
第二种是抑制靶基因的翻译——作用时与靶基因不完全互补结合，进而阻遏翻译而不影响mRNA的稳定性，这 种miRNA是目前发现最多的种类（如线虫lin-4）。而在植物中极少数的miRNA通过此方式来抑制靶基因。
第三种是结合抑制——具有以上两种作用模式：当与靶基因互补结合时，直接靶向切割mRNA；当与靶基因不 完全结合时，起调节基因表达的作用。
功能
MicroRNA的 过表达
MicroRNA的 下调
MicroRNA的过表达MicroRNA存在多种形式，最原始的是pri-miRNA，长度大约为300-1000个碱基pri-miRNA 经过一次加工后，成为pre-miRNA即microRNA前体，长度大约为70-90个碱基；pre-miRNA再经过Dicer酶酶切后， 成为长约20-24nt的成熟miRNA。实际研究中，pre-miRNA应用最早，也最广泛，目前很多商业化的MicroRNA库都 是pre-miRNA形式的。近几年来，研究发现microRNA的双臂对成熟miRNA的形成有着十分重要的作用，所以天然 的pri-miRNA形式越来越多地被研究者采用。
RNA-misi-microRNA快速提取试剂盒操作方法及步骤说明书
RNAmisi microRNA快速提取试剂盒目录号：RN05RN050150次❖适用范围：适用于快速提取各种细胞组织miRNA和其它各种小RNA ❖试剂盒组成、储存、稳定性：试剂盒组成保存50次Lysis/Binding buffer4°C避光50 ml70%乙醇室温9ml RNase-free H2O第一次使用前按说明加指定量乙醇Wash Solution 1室温12 ml第一次使用前加入28ml无水乙醇Wash Solution 2/3室温10 ml第一次使用前加入42ml无水乙醇RNase-free H2O室温10 ml吸附柱RA和收集管室温50套microRNA吸附柱MA和收集管室温50套本试剂盒按照指示储存6个月不影响使用效果。
储存事项1.Wash Solution 1和Wash Solution 2/3加入无水乙醇后，可以在常温保存。
2.Wash Solution 2/3可能加入乙醇使用几天后出现沉淀晶体，并不影响使用，直接不吸晶体，吸上清使用就可以。
3.运输在常温下进行，不影响使用效果。
4.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。
❖注意事项1.第一次使用前请先在70%乙醇、Wash Solution 1瓶和Wash Solution 2/3瓶中加入指定量乙醇，加入后请及时打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!2.所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13，000 rpm的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。
3.需要自备乙醇，氯仿，一次性注射器，研钵。
4.Lysis/Binding buffer 和Wash Solution 1含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。
若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。
5.预防RNase 污染，应注意以下几方面：1)经常更换新手套。
pMXs-miR-GFP Puro 微RNA表达向量说明书
Product Data SheetpMXs-miR-GFP/Puro Retroviral Expression VectorCATALOG NUMBER: RTV-017 STORAGE: -20ºCQUANTITY AND CONCENTRATION: 10 µg at 0.25 µg/µL in TEBackgroundMicroRNAs (miRNAs) are 18–24 nucleotide RNA molecules that regulate the stability or translational efficiency of target mRNAs. These regulatory RNAs function by acting as sequence-specific guides which recruit a large protein complex known as the RNA-induced silencing complex (RISC) to target mRNAs which are subsequently silenced. Diverse functions have been attributed to miRNAs including the regulation of cellular differentiation, proliferation, and apoptosis. Moreover, significant evidence has accumulated implicating a fundamental role for miRNAs in the development of cancer.miRNAs are initially transcribed as long precursor transcripts known as primary microRNAs (pri-miRNAs). Within these transcripts, the mature miRNA sequences are found in ~60–80 nucleotide hairpin structures. Mature miRNAs are generated from pri-miRNAs by sequential processing (Figure 1). Pri-miRNAs are initially recognized in the nucleus by the microprocessor complex which includes as core components the RNase-III enzyme Drosha and its obligate partner DGCR8. This complex excises the hairpin structure containing the mature miRNA sequence. The liberated hairpins, referred to as precursor miRNAs (pre-miRNAs), are recognized by the nuclear export factor exportin 5 which transports them to the cytoplasm. There, the RNase-III enzyme Dicer performs a second cleavage to generate a double-stranded 18–24 nucleotide RNA molecule. The RISC then associates with this RNA duplex and unwinds it. Generally, only one strand is stably incorporated into the RISC; the other is discarded and rapidly degraded. miRNAs guide the RISC to target messages that are subsequently cleaved or translationally silenced.Figure 1. miRNA Biogenesis and functionRetroviruses are efficient tools for delivering heritable genes into the genome of dividing cells. Cell Biolabs’ pMXs retroviral vector is based on Moloney murine leukemia virus (MMLV). The vector provides the viral package signal, transcription and processing elements, and MCS for cloning of a target gene. The viral env gene, produced by the package cell line, encodes the envelope protein, which determines the viral infectivity range. Transfection into a package cell line produces high-titer, replication-incompetent viruses. In addition to transfer and expression of exogenous genes in mammalian cells, recently, retroviruses have been used to express silencing RNAs (siRNA) to decrease the expression of target genes both in vitro and in vivo.Cell Biolabs’ pMXs-miR-GFP/Puro Retroviral Expression Vector is designed to clone and express an individual miRNA precursor in its native context while preserving putative hairpin structures to ensure biologically relevant interactions with endogenous processing machinery and regulatory partners, leading to properly cleaved microRNAs. Individual miRNA precursor from any species can be cloned between Xho I sites (Figure 2).The pMXs-miR-GFP/Puro retroviral expression vector contains the following features: •miRNA Processing– miRNA stem loop precursor in its native context is cloned between Xho I sites. To preserve the putative hairpin structure and proper endogenous processing, miRNA stem loop sequence is flanked by its native intron sequence.•EF-1α Promoter - ensures a high level of expression in mammalian cells•GFP-Puro Fusion Marker - to monitor cells positive for expression and stable selection with either GFP or puromycin resistance.•pUC Origin - for high copy replication and maintenance of the plasmid in E. coli•Ampicillin Resistance Gene - for selection in E. coliRelated Products1.RV-101: Platinum-E Retroviral Packaging Cell Line, Ecotropic2.RV-102: Platinum-A Retroviral Packaging Cell Line, Amphotropic3.RV-103: Platinum-GP Retroviral Packaging Cell Line, Pantropic4.VPK-120: QuickTiter™ Retrovirus Quantitation Kit5.RV-200: ViraDuctin™ Retrovirus Transduction KitSafety ConsiderationRemember that you will be working with samples containing infectious virus. Follow the recommended NIH guidelines for all materials containing BSL-2 organisms. Always wear gloves, use filtered tips and work under a biosafety hood.pMXs-miR-GFP/Puro Retroviral Expression VectorMCS: GATTAGTT CTCGAG GATCCGACTGAAGTCGCTAG CTCGAG CTTTTGGAXhoI XhoIFigure 2: pMXs-miR-GFP/Puro Retroviral Expression Vector (7001 bp, Ampicillin-resistant). miRNA Precursor CloningAll of our premade human amd mouse miRNA precursor clones in pEP-miR and pEGP-miR vectors are based on the following design, and the resulting overexpression of the mature miRNA is confirmed by Northern blot or Real Time PCR. Here we use human let-7a-2 miRNA as an example:1. Download desired miRNA stem loop sequence from Sanger’s miRNA database:/sequences/Homo sapiens let-7a-2 stem-loop structureu u g u uagaa ua aagg gag uag agguuguauaguu u c u||| ||| ||| ||||||||||||| | | cucc uuc auc uccgacaugucaa a g a-u g c --uag gg aHomo sapiens let-7a-2 stem-loop sequence AGGUUGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUAGAAUUACAUCAAGGGAGAUAACUGUACAGCCUCCUAGCUUUCCU2. Blast search miRNA stem loop sequence:/Blast.cgi>ref|NT_033899.7|Hs11_34054 Homo sapiens chromosome 11 genomic contig, reference assemblyLength=38509590Query 1 AGGTTGAGGTAGTAGGTTGTATAGTTTAGAATTACATCAAGGGAGATAACTGTACAGCCT 60 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 25579717 AGGTTGAGGTAGTAGGTTGTATAGTTTAGAATTACATCAAGGGAGATAACTGTACAGCCT 25579658Query 61 CCTAGCTTTCCT 72||||||||||||Sbjct 25579657 CCTAGCTTTCCT 255796463. PCR and Cloning:1)Add 100 base native flank sequence to both upstream and downstream of the miRNA stem loop.Human let-7a-2 miRNA precursor sequence including the 100 base flank sequences on bothends of the stem loop: let-7a-2 stem-loop sequence is underlined.GCCCAAATAGGTGACAGCACGATGAATCATTATAAGACTAACTTGTAATTTCCCTGCTTAAGAAATGGTAGTTTTCCAGCCATTGTGACTGCATGCTCCCAGGTTGAGGTAGTAGGTTGTATAGTTTAGAATTACATCAAGGGAGATAACTGTACAGCCTCCTAGCTTTCCTTGGGTCTTGCACTAAACAACATGGTGAGAACGATCATGATTCCTCCAGGCCTTTTCTCCCTATGAAAGGTAAGATTGGGTACGATTATTTTATGGTATTT2)Design PCR primers including Xho I site with four extra bases.Forward PCR Primer: tcga-ctcgag (XhoI)-21 ntReverse PCR Primer: tcga-ctcgag (XhoI)-21 ntFor human let-7a-2 miRNA precursor:Forward PCR Primer: tcga-ctcgag-gcccaaataggtgacagcacgReverse PCR Primer: tcga-ctcgag-aaataccataaaataatcgta3)PCR the miRNA precursor from genomic DNA and clone into the XhoI sites of the expressionvector.PCR Product of let-7a-2 precursor: let-7a-2 stem-loop sequence is underlined.1 tcga ctcgag gcccaaatag gtgacagcac gatgaatcat tataagacta acttgtaatt61 tccctgctta agaaatggta gttttccagc cattgtgact gcatgctccc aggttgaggt121 agtaggttgt atagtttaga attacatcaa gggagataac tgtacagcct cctagctttc181 cttgggtctt gcactaaaca acatggtgag aacgatcatg attcctccag gccttttctc241 cctatgaaag gtaagattgg gtacgattat tttatggtat tt ctcgag tc ga4)Validate the insert by DNA sequencing.Forward Sequencing Primer: TTTGCACCATTCTAAAGAATReverse Sequencing Primer: AAACCTCTTACATCAGTTACReferences1.microRNA sequences listed in Sanger’s miRBase (/sequences/).2.John, B., C. Sander and D. S. Marks (2006) Methods Mol Biol342: 101-13.3.Kitamura T., et al., (2003) Exp. Hematol.31, 1007-1014.Recent Product Citations1.Bergamini, C. et al. (2023). MiR-494 induces metabolic changes through G6pc targeting andmodulates sorafenib response in hepatocellular carcinoma. J Exp Clin Cancer Res. 42(1):145. doi:10.1186/s13046-023-02718-w.2.Kariba, Y. et al. (2020). Brown adipocyte-derived exosomal miR-132-3p suppress hepatic Srebf1expression and thereby attenuate expression of lipogenic genes. Biochem Biophys Res Commun.S0006-291X(20)31011-1. doi: 10.1016/j.bbrc.2020.05.090.3.Pollutri, D. et al. (2018). The epigenetically regulated miR-494 associates with stem-cell phenotypeand induces sorafenib resistance in hepatocellular carcinoma. Cell Death Dis. 9(1):4. doi:10.1038/s41419-017-0076-6.4.Ribecco-Lutkiewicz, M. et al. (2016). MicroRNA expression in amniotic fluid cells. Fetal Stem Cellsin Regenerative Medicine. doi:10.1007/978-1-4939-3483-6_11.5.Mansour, M. et al. (2013). The TAL1 complex targets the FBXW7 tumor suppressor by activatingmiR-223 in human T cell acute lymphoblastic leukemia. J. Exp. Med. 210:1545-1557.License InformationpMXs vector is licensed from the University of Tokyo.WarrantyThese products are warranted to perform as described in their labeling and in Cell Biolabs literature when used in accordance with their instructions. THERE ARE NO WARRANTIES THAT EXTEND BEYOND THIS EXPRESSED WARRANTY AND CELL BIOLABS DISCLAIMS ANY IMPLIED WARRANTY OF MERCHANTABILITY OR WARRANTY OF FITNESS FOR PARTICULAR PURPOSE. CELL BIOLABS’s sole obligation and purchaser’s exclusive remedy for breach of this warranty shall be, at the option of CELL BIOLABS, to repair or replace the products. In no event shall CELL BIOLABS be liable for any proximate, incidental or consequential damages in connection with the products.This product is for RESEARCH USE ONLY; not for use in diagnostic procedures.Contact InformationCell Biolabs, Inc.7758 Arjons DriveSan Diego, CA 92126Worldwide: +1 858-271-6500USA Toll-Free: 1-888-CBL-0505E-mail: ********************©2012-2023: Cell Biolabs, Inc. - All rights reserved. No part of these works may be reproduced in any form without permissions in writing.。
microRNA正向引物设计及实验操作
microRNA正向引物设计及实验操作一、原理：二、设计过程:已拥有引物：茎环引物（红）、逆向引物（紫）详细过程：1、安装Primer5.0（软件中的复制只能Ctrl+C）2、File—new—DNA sequence，在空白框中输入A（图1）（图1）3、复制要设计的microRNA（let7b：tgaggtagtaggttgtgtggtt），跳出一个选择框，选择Reverse Complemented（图2）（图3）4、在输入的序列后输入几个G，为正链（橙）5’端突出的互补链（图4）5、点击Primer，跳出图5（图5）6、选择Edit Primers，跳出图6（图6）7、删去空白框中的引物，键盘输入Ctrl+C（即复制要设计的microRNA 序列），在跳出的对话框中选择Reversed，随即在False Priming框下出现红色的Found，点击Found，再点击对话框靠右的Primer，出现图7图7 8、在出现的空白框中调节引物的长度和Tm温度：长度通过删除3’端的碱基控制在15-18个，但其Tm值不得少于35度；Tm温度通过5’端加入G或C来调节，尽量控制在56-59度。
9、调节好后的引物点击对话框中的Analyze，分析修改后的引物。
尽量避免引物二聚体（dimer）的3’端的互补。
10、将修改好的引物复制到目标文档中时，注意引物的方向，一般默认为5’端在前，3’端在后。
三、实验操作1、引物原液稀释：（1）拿到引物原液后，先点离，将引物管中的干粉贴到管壁上。
（2）加入相当于引物管中的nmol值的10倍的水（ddH2O或去离子水），例如nmol=24.456，则加入245ul的水。
（3）在引物管上标记引物的名称和稀释后的浓度，按以上方法稀释后的浓度为100umol。
（4）将稀释好的引物储存液混匀，放置一个上午或颠倒混匀一个小时，再将储存液稀释100倍到1umol，即取1ul的储存液加入到99ul 的ddH2O或去离子水中，并做好引物的标记。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
产品手册│MirAd TM MicroRNA前体腺病毒表达系统本产品仅限用于研究，严禁用于任何动物或人类疾病诊断。
本产品仅供购买方内部研究使用，未经ViGene生物科技有限公司书面许可，严禁转售。
目录│产品简介 4 产品组成 5 保存条件 5 使用安全注意事项 6 pMirAd 载体图谱 6 质粒扩增 6 病毒载体扩增 7 常见问题解答 8产品有限责任担保Vigene生物保证您收到的产品符合产品目录上的规格。
本担保规定了Vigene 更换产品的责任。
Vigene生物不提供其他任何形式的对于产品商业或健康用途的保证。
Vigene生物不对任何由于使用或不正确使用本公司产品造成的直接、间接的、衍生的或偶然的损害所产生的后果负责。
产品订购和技术支持山东维真生物科技有限公司暨美国ViGene Biosciences公司中国办事处美国地址：12111 Parklawn Dr. Rockville, MD 20852 US北京办事处：北京市海淀区北三环西路43号青云里满庭芳园D座1206室上海办事处：上海市徐汇区肇家浜路201弄11号602室广州办事处：广州市天河区骏景花园骏景路棋乐街33号404室山东办事处：济南市高新区开拓路2350号留学人员创业园717室Email: service@Phone: 400-077-2566(美国) （中国）欢迎您致电或发邮件，咨询产品技术信息。
产品简介MicroRNAs（miRNAs）是一类长度为18-24个核苷酸的非编码RNA分子。
MiRNA通过与靶基因mRNA上的互补序列结合，降解mRNA或抑制mRNA的翻译。
MiRNAs在细胞分化、增殖、凋亡和癌细胞发生中发挥重要的调控作用。
MiRNAs来源于具有60-80个核苷酸茎环结构的microRNA前体（premir）和序列更长一些的microRNA初级转录产物（primir）。
MiRNA在核内由RNA聚合酶II（polII）转录生成，最初产物primir具有帽子结构和多聚腺苷酸尾巴。
ViGene生物的mirAD-腺病毒microRNA前体表达系统包括三个相关产品：microRNA前体穿梭载体、microRNA前体腺病毒载体和预制microRNA前体腺病毒。
重组腺病毒是进行基因转移和表达的工具，功能强大且易于操作。
腺病毒独特的生物学特征使它成为“载体的首选”，被科研工作者广泛应用。
首先，它能够感染包括分裂、非分裂细胞和干细胞在内的多种细胞。
第二，病毒滴度高。
第三，高滴度的病毒可获得高感染效率和高表达量。
第四，病毒进入细胞后，病毒基因组不整合到细胞染色体上，因此瞬时表达外源基因的重组腺病毒不会诱导宿主细胞中染色体的变化。
ViGene生物选用的是应用最广泛的复制缺陷型的人类血清5型腺病毒，该腺病毒载体缺失E1和E3基因。
E1基因在组装感染性病毒颗粒时必不可少，可在HEK293T细胞病毒包装过程中得到补充，而E3基因可有可无。
由于E1和E3基因的缺失，腺病毒载体可插入高达7.5kb的外源基因。
pMir-microRNA precursor是基于microRNA前体表达系统的质粒。
microRNA前体天然的茎环结构被克隆到质粒的SgfI和MluI双酶切位点。
为了保持推测的发卡结构和诱导正确的内源性反应，miRNA茎环结构的两侧具有它的150-200bp的天然序列。
MicroRNA前体在CMV启动子启动下表达，其上游有GFP荧光标记，并具有SV40 poly（A）加尾信号。
穿梭载体含有SV40启动子启动的puromycin嘌呤霉素标记，可以用来进行稳转细胞株的筛选。
穿梭载体还含有两个腺病毒ITR序列和两个与腺病毒Ad5同源的序列，可用于将microRNA前体同源重组到腺病毒载体。
microRNA前体腺病毒载体通过在大肠杆菌中同源重组，将microRNA序列从pEnter和除慢病毒、腺相关病毒之外的大部分的目的载体转移至pAD腺病毒载体。
pAD是最常用的人类腺病毒载体，是人类腺病毒血清5型，E1和E3基因的缺失。
pAD-ORF质粒可用于在HEK293细胞中包装重组腺病毒。
microRNA前体腺病毒是microRNA前体的重组腺病毒表达系统。
ViGene的预制microRNA腺病毒能够最有效地传递microRNA前体，可应用于microRNA 体外和体内的功能研究。
产品组成产品主要包括以下部分:1. pMir-microRNA 前体甘油菌液。
100ul.2. pAD-microRNA前体甘油菌液。
100ul.3. MirAd-microRNA 前体腺病毒。
每100ul含有10 8个病毒颗粒*根据特定订购要求，产品组成可能有所调整。
保存条件收到产品后，请将所有产品-80ºC保存安全注意事项请按照美国国立卫生研究院NIH推荐的方法处理包括生物安全二级（BSL_2）的所有样品。
请小心操作具有传染性的病毒样品。
pMir载体图谱pMir8356bp质粒扩增pMir-microRNA前体或pAD-microRNA前体的甘油菌液在含30ug／ml卡那霉素LB 固体培养基上活化并37℃培养过夜。
第二天，至少挑取3个克隆进行质粒小提。
用引物GFP-F对pMir-microRNA前体或pAD-microRNA前体进行5’端测序，测序位点位于接头上游 85 nt。
病毒载体扩增用包括MicroRNA前体腺病毒在内的病毒感染HEK293细胞，对病毒进行扩增。
每轮扩增可使病毒滴度增加10倍。
注：以下步骤建议使用T75培养瓶，可根据实际情况优化具体参数。
1. 转染前一天，在T75培养瓶中接种3-5×106 HEK293T细胞。
2. 取1/2体积的粗提病毒裂解液至培养细胞中。
建议使用PFU（空斑形成单位）> 0.5 或足够在48 h内产生病毒细胞病变效应（CPE）的病毒量。
3. 感染后24-48 h，每天显微镜下镜检两次，检查单层细胞是否出现细胞病变效应CPE。
当CPE接近完成（即大多数细胞圆形但尚未从瓶上脱落），用移液管将瓶上的细胞吹洗至培养液中。
4. 收集细胞和培养液。
1000 g离心5 min收集细胞。
除去上清液，悬浮细胞用10 mM Tris，pH值8.0，NaCl 100 mM重悬。
（T75培养瓶0.25-0.5ml/瓶）。
5. 反复冻融细胞3次释放病毒颗粒。
3000g 离心10 min，除去细胞碎片。
弃沉淀，保存上清液中的病毒。
6. 病毒上清-80°C冻存或立即进行纯化和滴度测定。
常见问题解答1. 在使用和操作腺病毒载体时应注意哪些安全性问题？mirAd腺病毒载体是复制缺陷型的人类血清5型腺病毒，E1和E3基因缺失。
使用腺病毒载体前请向您所在机构的生物安全部门征得许可和指令。
应在BL2生物安全二级实验室操作病毒粒子。
使用新鲜配制的10％漂白粉进行消毒操作。
操作腺病毒和转染细胞时应始终佩戴手套。
2. 在什么情况下我该选用腺病毒载体作为将microRNA前体导入细胞的工具？您应先考虑以下几点：1. 外源基因需要瞬时表达还是稳定的基因表达？2. 需转染分裂细胞还是非分裂的细胞？3.对于靶细胞的潜在免疫原性4.病毒用来进行体内还是体外基因传递？腺病毒载体能感染分裂和非分裂细胞。
它适用于体内和体外基因传递，转染效率高，对外源基因瞬时表达量高。
但相对于其他病毒载体系统，腺病毒载体在靶细胞中具有相对较高的免疫原性。
3. VP，PFU，IFU的区别是什么？我设计的实验该选用哪个指标？VP(Viral particles) 反映了病毒颗粒的总数（包括活病毒和死病毒）。
由于在病毒制备过程中，每次死病毒的比率各不相同，VP并不能真实反映有活性的病毒数量。
PFU（plaque formation unit）代表具有感染活性的病毒数量。
通常情况下，VP/PFU比值为20:1至50:1。
IFU（infectious unit）相当于PFU。
我们建议您选用PFU或IFU作为病毒滴度单位，可获得较为一致的实验结果。
4. 病毒滴度如何测定?测定腺病毒的滴度有三种常用的方法：（1）空斑形成实验（2）终点稀释实验（3）BAC法空斑形成实验是一种检测有感染能力的病毒（PFU）的生物学方法。
通常是用一系列病毒稀释液感染单层HEK293细胞，病毒在感染的细胞中繁殖，最终导致细胞毒性效应并被释放出来。
释放的病毒将感染邻近的细胞，这整个过程将被不断重复，最终导致空斑的形成。
为了阻止病毒扩散并形成新的空斑，在完成最初感染后，要将一层0.5%的琼脂铺在细胞表面上。
病毒滴度（PFU/ml）可通过统计空斑数目获得。
空斑的形成需3周时间。
终点稀释实验类似于空斑形成实验，但更为复杂。
病毒滴度的计算公式也较为复杂。
BAC法是检测蛋白浓度，仅适用于纯化后的腺病毒。
通常1 ug蛋白=1X109 VP。
5. 通过CsCl双重梯度法纯化和浓缩病毒有必要吗？如果病毒被用于体外细胞实验，不需要进行CsCl双重梯度法纯化。
由于未纯化病毒液中含有的细胞碎片和少量培养基成分易诱导显著的免疫学反应，用于体内实验或动物实验的病毒需通过CsCl双重梯度法纯化和浓缩病毒液，从而除去有缺陷的病毒颗粒和其他培养基中的成分。
6. 如何保存重组腺病毒?腺病毒可在-80°C条件下，稳定保存6个月至一年。
7. mirAd是什么血清型的腺病毒?MirAd 腺病毒是E1/E3基因缺失的人类血清5型腺病毒。
8. 什么是RCAs？如何检测 RCAs?HEK293细胞中存在与血清5型腺病毒相同的序列，重组腺病毒与293细胞的重叠序列交叉重组，可产生复制能力的腺病毒（Replication Competent Adenoviruses：RCAs），RCAs发生的几率较小。
RCA可使用非辅助细胞，如HeLa进行检测。
将梯度稀释的病毒液感染HeLa细胞，并培养8天。
8天后，若没有空斑产生，重组的腺病毒则不是有复制能力的腺病毒。
9. MirAd microRNA前体的序列是什么?mirAd microRNA前体序列是由primirs（60-80 nts）和150-200 nts的两侧基因组序列组成。
两侧基因序列应至少75nts，才能保证primir和miRNA的正确表达。
10. 如何检测miRNA?从转染的细胞中提取包括小RNAs的总RNA，用适当的接头和microRNA特异性引物进行RT-qPCR，扩增并检测microRNA的表达。
11. 每个质粒只表达一个microRNA吗？是的，每个microRNA前体只表达一个microRNA的发夹序列。