东师实验4谷丙转氨酶活性的鉴定及活力单位的测定

综合研究性实验四：

谷丙转氨酶活性的鉴定及活力单位的测定

一.实验目的

1.用纸层折法观察肝脏丙转氨酶ALT的转氨作用；

2.用分光光度法测定血清丙转氨酶的活力；

3.学习治疗检测SGPT的方法及原理；

4.了解检测肝损伤模型的制备及SGPT在科研中的应用。

二.实验材料与试剂

[一]实验材料

动物肝脏

[二]实验试剂

1.9%NaCl溶液

2.海砂

3.1%谷氨酸溶液（1%KOH溶液中和）

4.%丙酮酸钠溶液（用1%KOH溶液中和）

5.0.1%KHCO3溶液

6.0.025%一溴乙酸溶液（用1%KOH中和）

7.2%乙酸溶液

8.酚的饱和水溶液

将2份酚和2份水（按重量计算）混合后，放入分液漏斗中，振荡。静止24h以后分层，将下部酚层放入瓶中备用。新配制的酚展层剂可以反复使用1周。

9.0.1%水合茚三酮的正丁醇溶液

10.0.1%标准谷氨酸溶液

11.0.1%标准丙氨酸溶液

12.1%KOH溶液

二.谷丙转氨酶活性的鉴定（纸层析法）

[一]实验原理

观察肌肉糜中谷丙转氨酶所催化的氨基移换反应。通过纸层析法检查底物谷氨酸的减少和产物丙氨酸的生成。为防止丙酮酸被肌肉糜中的其它酶所氧化或还原，在反应系统中加入了抑制剂溴乙酸。

[二]实验操作

（一）谷丙转氨酶提取液制备

谷丙转氨酶提取液制备方法

2g肝脏+0.9%NaCl6mL+海砂200mg

在低温下，研磨成浆

用脱脂棉过滤，得提取液（滤液不清）

（二）转氨作用

试剂对照管测试管

0.1moL/L谷氨酸0.500.50

0.1moL/L丙酮酸钠0.500.50

0.1%KHCO30.500.50

0.025%一溴乙酸0.250.25

煮沸的酶液0.50—

酶液—0.50

加脱脂棉塞，45℃水浴，1.5h，时时振荡内容物

2%乙酸6滴6滴

沸水浴2min，使蛋白质完全沉下，过滤，作层析

（三）纸层析

1.方法

纸层析方法

取圆形层析滤纸1张，在圆心处用圆规绘出直径为3cm的同心圆

通过中心将滤纸绘成四等分扇形，用毛细管点样2-4次（直径不超过2mm）

在滤纸的圆心上剪一小孔，直径约1-2mm

取一小滤纸条，将下端剪成刷状，在卷成灯芯插入圆形小孔，不能使灯芯突出纸面

将圆形滤纸平放在盛有层析液（水饱和酚）培养皿上，使灯芯向下与溶剂接触

用大小相同的培养皿盖在滤纸上

溶剂通过灯芯上升到滤纸上向四周展层，直到溶剂前沿移至距滤纸边缘约1cm处时停止（展层时间为1h）

80-100℃烘箱干燥，喷洒水合茚三酮的正丁醇溶液，80-100℃显色

2.实验结果

三.血清谷丙转氨酶活力单位测定

[一]实验原理

本实验用丙氨酸和α-酮戊二酸为底物，经转氨作用生成谷氨酸和丙酮酸。丙酮酸与2，4-二硝基苯肼作用生成2，4-二硝基

苯腙，此物质碱性条件下呈棕红色，其颜色的深浅与丙酮酸的含量成正比，可用比色法进行定量测定。通过与标准溶液的比较，即可计算出酶的活力单位数。

[二]实验操作

（一）标准曲线的绘制

1.试剂

（1）1/15 mol/LpH=7.4的磷酸缓冲液

取1/15 mol/L磷酸氢二钠（称取Na2HPO4 9.47g或Na2HPO4·12H2O23.87g，溶于蒸馏水中定容至1000mL）825mL；1/15 mol/L 磷酸二氢钾（称取KH2PO4 9.078g溶于蒸馏水中定容1000mL）175mL混合。

（2）GPT基质液

称α-酮戊二酸，29.2mg（2 mmol/L）及α-L-丙氨酸1.78g（200mmol/L）溶于50mL，pH=7.4的磷酸缓冲液中，加0.1mol/L NaOH 溶液0.5mL，调pH为7.4，然后加磷酸缓冲液定溶至100mL，加少许氯仿防腐，置冰箱中可保存一周。

（3）1mmol/L2，4-二硝基苯肼

称取2，4-二硝基苯肼20mg，溶解于10mL浓盐酸中，以蒸馏水定容至100mL。

（4）2μmol/mL丙酮酸钠标准液

精确称取丙酮酸钠22mg，加磷酸缓冲液溶解后，定容至100mL。临用前配制。

（5）0.4mol/LNaOH溶液

2.方法

对照管测定管

试剂

012345

丙酮酸钠标准液（mL）—0.050.100.150.200.25

GPT基质液（mL）0.500.450.400.350.300.25

pH7.4磷酸缓冲液（mL）0.100.100.100.100.100.10

充分摇匀后，置于37℃水浴，保温10min

2，4-二硝基苯肼（mL）0.500.500.500.500.500.50

充分摇匀后，置于37℃水浴，保温20min

0.4mol/LNaOH（mL） 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00

充分摇匀后，室温静置30min后，520nm波长下比色

A520nm值

相当丙酮酸含量（mol）—0.100.200.300.400.50

相当GPT单位（100mL）—100200300400500

以酶的活力单位数为横坐标，以光吸收值为纵坐标，绘制A520nm与对应的酶活力单位数的标准曲线。

（1）丙酮酸钠标准液mL数×摩尔浓度（2μmol/mL）；

（2）GPT活力单位为：每mL血清在37℃与pH=7.4的基质液作用60min，生成1

μmol丙酮酸为一个单位（U）。本实验（临床检验）取血清量为0.1mL，报告数

据以100mL血清计算，因此将实际测得结果×1000即可。

（二）酶活力的测定

对照管测定管

试剂

01

GPT基质液（mL）0.500.50

37℃水浴，预温10min

血清（mL）—0.10

PH=7.4磷酸缓冲液（mL）0.100.00

充分摇匀后，置于37℃水浴，保温60min

2，4-二硝基苯肼（mL）0.500.50