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一、立项依据与研究内容

（一）项目的立项依据

DNA错配修复(mismatch repair, MMR)系统广泛存在于生物体中，它是细胞复制后的一种修复机制[1-3]。其功能是在含有错配碱基的DNA分子中切除配对错误的片段，然后通过DNA聚合酶和DNA连接酶等的作用，重新合成配对正确的片段，使DNA恢复正常的核苷酸序列。因此，它起着增强DNA复制保真度、修复DNA错配、降低基因变异和维持基因组稳定性的作用[4-5]。近来，MMR系统的研究越来越受重视，对MMR作用机制及该系统的组成结构与功能分析方面的研究正不断深入[6-8]。由于在越来越多的肿瘤(如卵巢癌、肠癌、肾癌、乳腺癌、膀胱癌、肝癌、胰腺癌、胆囊癌、甲状腺肿瘤等)细胞中找到DNA MMR基因突变或缺陷的痕迹[9-11]。MMR系统与肿瘤的发生与恶化的关系成为近十年来的研究热点，MMR基因也成为继癌基因与抑癌基因之后被确认的第三类肿瘤相关基因[4]。

外源性的持续刺激是细胞复制出现DNA错配的重要原因之一，而日益严重的化学污染又使生物受到的外源毒素刺激与日俱增，生物细胞内DNA损伤与错配几率因而也急剧增加[12-15]。错配的DNA序列如果不能得到修复，将导致突变频率增加，基因突变事件放大，最终会引起肿瘤等相关疾病的发生发展。事实上，人类MMR系统不仅能识别多种需要进行核苷酸切除与重新合成的DNA错配，还能参与如O6-甲基鸟嘌呤和UV诱导的光产物等造成的DNA损伤的修复[16-19]。这说明MMR系统极可能参与了暴毒后DNA损伤的修复。另有研究显示，毒物暴露不但会使DNA错配概率显著提高而增加MMR系统的负荷，而且有些致癌物可能会直接损害MMR基因，使MMR活性降低甚至丧失。其中，Feitsma等

通过使用强致癌物乙基亚硝基脲来诱变获得MSH2、MLH1、MSH6和PMS2等MMR基因缺陷型斑马鱼就是一个重要的例证[20-26]。因此，日益严重的环境污染对生物及人类构成的健康风险之一可能就是阻断或干扰细胞的DNA MMR活性。然而，目前将DNA MMR活性分析与环境毒理学相结合的研究在国际上仍为空白，这与当前DNA MMR活性分析方法较为繁琐及环境毒理研究对所需的异源核酸分子的质与量要求很高有关。

除了本课题拟开展的活细胞DNA MMR活性分析技术以外，生物体MMR 功能的主要分析方法还有两种。第一种是以噬菌体M13mp2及其衍生株为材料[27-30]，该法利用噬菌体M13mp2及其一种衍生株作为材料，各自提供一条正链ssDNA和一条负链ssDNA，这两条ssDNA退火杂交后可形成一个带预设错配位点的环状异源dsDNA。将这种含错配碱基的异源dsDNA转入自身错配修复功能缺失的宿主菌E.coli(NR9160)，在培养平板上就会出现混合噬斑。若将这种异源dsDNA与样本细胞提取物在体外作用后再次转化NR9162，样本细胞的MMR系统对错配位点的修复情况可通过指示板上的混合噬斑比率的变化来指示，进而分析样本的DNA MMR活性。第二种以寡聚核苷酸为材料[31]，该法采用人工合成的寡聚核苷酸来制备含有错配碱基的异源dsDNA，在错配碱基处预设特异性限制性内酶切位点．如果待测样本的MMR功能完整，其提取物在体外与这种异源dsDNA作用后，在错配碱基得到修后异源dsDNA即变为同源dsDNA,预设的酶切位点也就同步恢复。通过电泳检测修复后的dsDNA的限制性酶切产物的有无和多少来对样本MMR功能做定性或初步的定量分析。

这两种方法自建立后，在一定程度上促进了对DNA MMR功能活性研究的发展，但也都存较大的局限性。首先，这三种方法均为体外法，不能准确反应生

物体内的真实状况。其次，分析过程复杂，需要多个步骤，而且指标参数的灵敏度和准确度都较低。由于这些方法仅限于特定生物体MMR活性的体外分析，很难在实际研究中广泛推广，这在一定程度上导致了国内在该研究领域力量比较薄弱的局面。但是，复旦大学的王怡等[32]曾运用上述第一个方法建立了一个类似的DNA MMR活性体外分析模型，用以对淋巴瘤细胞的DNA MMR活性进行分析。

为了克服突破这些限制，美国得州大学孙鲁浙教授领衔的研究团队于2004年提出了一种利用绿色荧光蛋白

(enhanced green fluorescent

protein，EGFP)基因作为报告基因

直接对活细胞DNA MMR活性进

行定量分析的模型[33]。该模型的原

理是构建一对EGFP基因真核表达

双链核酸分子，其中一个为碱基序

列正确的同源双链核酸分子，可以

在细胞中正常地表达EGFP；另一

个为带一个错配碱基的异源双链

核酸分子，这个错配碱基设计在EGFP基因的起始密码子处。将异源双链核酸分子导入活细胞，如果错配没有修复，细胞就不能表达EGFP。因此，把这对EGFP 双链核酸分子平行地导入细胞中，并检测其组间的EGFP表达率与表达强度，就可以评估该细胞株DNA MMR活性的强弱。绿色荧光蛋白的发明及其在生物学研究中的应用获得2008年度诺贝尔奖，将其用于DNA MMR活性的定量检测具

有显著的创新意念。但在随后的应用中，人们发现该模型的异源双链核酸分子存在一定的EGFP本底表达(即错配未修复也有一定量的绿色荧光蛋白表达)，原因是细胞内基因的表达并不完全依赖于起始密码子。此外，如何大量得到高纯度核酸分子也是制约该技术应用的一个瓶颈。近来，本课题组通过与孙教授的合作而引入此项技术。目前，本课题组已在此项技术的应用上获得了两项突破：(1)采取无义突变策略(在EGFP基因合适位置引入终止密码子)，建立了一种新的突变型EGFP表达质粒p189，运用质粒p111和p189所获得的异源双链核酸分子彻底消除了该模型EGFP的本底值问题[34]，达到了能精确区分MMR活性缺失的细胞株和正常的细胞株(见插图)；(2)开发出了一种为该模型大量制备高纯度ssDNA 的技术[详见前期基础]，为此项技术在毒理学及其它领域的推广应用提供了技术保障。

本项目拟在前期研究的基础上，为该EGFP双链核酸模型再引入一个红色荧光蛋白(red fluorescent protein, RFP)基因作为报告基因，构建一个全新的双荧光蛋白基因双链核酸分子(含有同时可表达绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的基因)。该模型的技术改进特点是：⑴让双链核酸分子自身多带了一个RFP报告基因，可直接定量指示转染效率，而当前技术需要采用与RFP表达质粒共转染的方法；

⑵只需要制备一种带错配的异源核酸底物，无需再制备一种无错配的同源核酸底物；⑶检测过程只需将异源核酸底物导入活细胞中，无需再设空白对照组和同源核酸底物组。由此可见，新模型的思路是将所有参数在一组细胞中同时获得，而原方法的不同参数需要在不同的细胞组中获得。因此，新模型由于所有参数完全同步而具更的精确度与灵敏度，而且还可起到简化分析和提高效率的作用。但是，