淋巴细胞亚群检测方案

目和相对比例都在一定的范围内。那么临床常见的淋巴细胞亚群包括哪些项

目？

一、淋巴细胞亚群

二、抗体组合方案

联合CD45的三色方案主要是有四种不同的试剂。

1.CD45/CD3/CD4

这个抗体组合主要用来检测T3细胞和T4细胞。

2.CD45/CD3/CD8

用来检测T3细胞和T8细胞。

3.CD45/CD3/CD19

用来检测T3细胞和B细胞。

4.CD45/CD3/CD16和/或CD56

用来检测T3细胞和NK细胞。

（三）双色方案

如果实验室在边远的地区，条件不足，只能做双色方案，但是在双色方案中建议要把CD3加进来，因为CD45能很好地将白细胞和其他的干扰细胞，尤其是红细胞进行区分。如果不能用CD45，最好能用到

CD3，CD3可以特异的标记T淋巴细胞，T淋巴细胞和CD4做双标可以克服单一的CD4抗体。为此，双色方案中也分为四管，每管当中建议都包含有CD3。

1.CD3/CD4

用来检测T3细胞和T4细胞。

2.CD3/CD8

用来检测T3细胞和T8细胞。

3.CD3/CD19

用来检测T3细胞和B细胞。

4.CD3/CD16和/或CD56

用来检测T3细胞和NK细胞。

尽管检测条件不允许做四色或三色的分析，但也至少要用CD3和其他的直标抗体进行双免疫荧光染色方案，不建议采用单色方案进行淋巴细胞亚群分析。

（四）7-氨基放线菌素D(7-AAD)联合CD45方案

1．目的

对于超过24小时的标本或肉眼观察发现已经变质的标本，需使用7-氨基放线菌素D（7-AAD）结合

CD45（评估淋巴细胞、单核细胞和粒细胞死亡）复染评估细胞活力。

2.判定

7-AAD荧光染料主要染活细胞，主要用来鉴定细胞活性。

（1）7-AAD阴性者是活细胞群。

（2）7-AAD阳性者为细胞膜不完整的死细胞群。

（3）7-AAD阴性细胞群阴性细胞群计数为75%时为最低细胞活力。

（4）对于细胞活力低于75%的标本，建议采用7-AAD结合CD45的方案，包括①～③的组合方案。

三、数据采集和分析

（一）联合CD45和SSC设门确定淋巴细胞群

方案1和方案2都存在CD45，首先建议采用联合CD45和侧向散射光SSC设门来确定淋巴细胞群。它是准确分析淋巴细胞亚群的第一步，可以用于来定位淋巴细胞群，把淋巴细胞群找到，排除标本中非淋巴细胞或细胞碎片的干扰。

首先在CD45/SSC散点图中，调整SSC，使所有白细胞群均可见。第二步是根据CD45强阳性细胞群设门或者划定区域。因为在CD45染色细胞中，淋巴细胞群呈现CD45强阳性和SSC弱表达。设门时尽可能包括所有淋巴细胞，仪器会给一个提示，一共是包括了多少淋巴细胞数。一般门内淋巴细胞数不低于95%，而且要排除单核细胞和嗜碱细胞的感染，因为单核和嗜碱在周围，很容易对淋巴细胞进行干扰。单核细胞的CD45呈弱表达，而SSC呈中等强度表达。嗜碱性粒细胞的CD45和SSC均为低表达。

如果不能确定标记的淋巴细胞群是否被设门设的比较准确，里面是否含有其他细胞的干扰，还有一个办法就是将CD3/SSC、CD19/SSC以及 CD56或CD（16+56）/SSC中T细胞、B细胞和NK细胞的分布特征筛选出来，并在CD45/SSC双参数散点图中显示，以监测设门的准确性。当设门准确了，准确的找到淋巴细胞后，才能采集细胞数。第三步，采集细胞数。非设门荧光散点图中，每一荧光通道至少收集5000个淋巴细胞，以确保对数量较少的淋巴细胞亚群（如占总淋巴细胞数的10%）提供足够量的细胞。

从上面的图片上可以看到，图形中画黑框、标记是紫色的细胞是淋巴细胞群，在它的上方是单核细胞，用红颜色标记，嗜碱性细胞CD45和SSC的表达较低，用粉颜色标记的。

（二）淋巴细胞亚群分析和相对计数

首先在亚群分析时设置几个散点图：CD3/CD4散点图、CD3/CD8散点图、CD3/CD19散点图、CD3/CD56或CD（16+56）散点图。散点图设置完后，在每一个荧光散点图中再设一个四象限门，将CD45/SSC散点图中

选定的淋巴细胞群中的表达该抗原的阴性细胞群和阳性细胞群区分开来。

第三步，进行淋巴细胞亚群计数。T4细胞的计数，一般先得到一

个相对计数，也称为百分比，比如CD3/CD4散点图中CD3+CD4+细胞群占

CD45/SSC散点图中选定淋巴细胞群的百分比，这叫做T4细胞的相对计

数百分率。它占的是前一个散点图，在第一次设门的散定图中淋巴细

胞的百分率。T8细胞相对计数是CD3/CD8散点图中CD3+CD8+细胞群占

CD45/SSC散点图中选定淋巴细胞群的百分比。B淋巴细胞计数是

CD3/CD19散点图中CD3-CD19+细胞群占CD45/SSC散点图中选定淋巴细胞

群的百分比。NK细胞相对计数是为CD3/CD56或CD（16+56）散点图中

CD3-CD56+细胞群或CD3-CD（16+56） +占CD45/SSC散点图中选定淋巴细

胞群的百分比。

T3细胞的百分率在四个散点图中都可以计数，因为每一个散点图中都含有CD3的标记。在CD3/CD4散点图中，计数为CD3+CD4-单阳性细胞群百分比和CD3+CD4+双阳性细胞群百分比的总和。在CD3/CD8散点图中也一样，计数为CD3+CD8-单阳性细胞群百分比和CD3+CD8+双阳性细胞群百分比的总和。在CD3/CD19散点图中，计数为CD3+CD19-细胞群百分比。在CD3/CD56或CD3/CD（16+56）散点图中，计数为CD3+CD56-或

CD3-CD（16+56）-百分比和CD3+CD56+或CD3+CD（16+56）+百分比的总和。

（三）淋巴细胞亚群的绝对计数

根据淋巴细胞亚群相对计数结果，对于绝对计数来讲，通常有两种绝对计数的方法，一个是单平台法，一个是双平台法。单平台方法是采用了一个内部的计数，计数的微球。所有的数据都可以从流式细胞仪这一台仪器检测到，由专用软件直接计算生成，具体操作可以试剂操作说明书。

双平台方法，白细胞计数需要与亚群分析使用同一标本进行测试，并在6个小时内完成。当白细胞计数不能准确获得时，不能用DP方法进行淋巴细胞绝对计数，只能采用SP方法。

不能采用淋巴细胞计数来计算淋巴细胞亚群绝对计数。因为淋巴细胞计数在血细胞分析仪上表现出更大变异度，白细胞计数作为分母比淋巴细胞计数更为稳定。

（四）数据分析可靠性的验证

1. CD45

在有些验证中要采用CD45，CD45在三色和四色抗体组合方案的每一标本管中均存在，这样它既可以对淋巴细胞群进行设门，因为它在每一管中都存在，也可以根据CD45表达情况和图形分布情况检测和评估样本管间的变异，所以这是一个很好的一个验证方法。