淋巴细胞亚群检测方案
淋巴细胞亚群测定
1检验目的检测机体细胞免疫功能的重要指标，且对某些疾病（如自身免疫病、免疫缺陷病、恶性肿瘤、血液病、变态反应性疾病等）的辅助诊断，分析发病机制，观察疗效及监测预后有重要意义。
2 检验方法和原理2.1 方法：流式细胞术2.2 原理：在含有准确数量荧光计数微球的试管(如BD TruCount)中，加入一定体积的抗凝血液和六色荧光素标记的单克隆抗体进行免疫荧光染色，按溶血／免洗方法进行流式细胞仪检测，以CD45／SSC设定淋巴细胞门，应用FACS Canto软件自动进行多重逻辑设门和统计分析数据，可以准确计数血液中淋巴细胞亚群的绝对数量。
3 原始样本种类3.1 样本类型：KEDTA抗凝静脉血样本。
2EDTA或肝素抗3.2 样本容器：盛放样本的容器为洁净的一次性真空采血管（K2凝）。
3.3 样本保存：抽取样本后置于加有抗凝剂（一般选择EDTA或肝素）的试管中，室温（20-25℃）保存，尽量于采血后48小时内处理样本；标记后的样本最好在24小时内完成上机检测。
4设备和试剂4.1 设备名称：BD FACS Canto II流式细胞仪型号：Canto II厂家：美国BD公司4.2 试剂4.2.1 主要试剂本实验采用BD公司的试剂。
4.2.1.1 BD MultiTEST 6-color TBNK Reagent货号：337166规格：1ml厂家：美国BD公司储存条件：2-8℃避光保存，在试剂盒标识的有效期前使用。
只有相同批号的各种成分才能相互混用。
4.2.1.2 绝对计数管（TruCOUNT Tubes）货号：340334规格：25tubes/盒厂家：美国BD公司储存条件：2-25℃避光保存，在试剂盒标识的有效期前使用。
TruCOUNT Tubes 从冰箱拿出后需平衡至室温，方可打开包装袋。
每次用前，需要检查包装袋内的干燥剂，如果由蓝色变成粉色，则TruCOUNT Tubes不能继续使用。
4.2.1.3 溶血素Lysing Solution（10X Concentrate）货号：349202规格：100mL厂家：美国BD公司储存条件：2-8℃避光保存，在试剂盒标识的有效期前使用。
细胞亚群检测实验报告
1. 了解淋巴细胞亚群检测的基本原理和方法。
2. 掌握流式细胞术在淋巴细胞亚群检测中的应用。
3. 分析实验结果，了解淋巴细胞亚群在免疫调节中的作用。
二、实验原理淋巴细胞亚群检测是利用流式细胞术对淋巴细胞进行分类、计数和功能分析的一种技术。
通过特异性抗体标记，检测淋巴细胞表面标志物，实现对不同亚群的识别。
本实验主要检测T细胞、B细胞和NK细胞亚群。
三、实验材料1. 实验试剂：抗CD3、抗CD4、抗CD8、抗CD19、抗CD16、抗CD56单克隆抗体。
2. 实验仪器：流式细胞仪、细胞培养箱、离心机、移液器等。
3. 实验样本：新鲜血液。
四、实验步骤1. 样本采集：采集受试者新鲜血液，分离外周血单个核细胞（PBMCs）。
2. 抗体标记：将分离的PBMCs与抗CD3、抗CD4、抗CD8、抗CD19、抗CD16、抗CD56单克隆抗体混合，室温孵育30分钟。
3. 洗涤：将标记好的细胞用磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）洗涤两次。
4. 流式细胞术检测：将洗涤后的细胞上流式细胞仪，进行检测和分析。
5. 数据分析：使用流式细胞术分析软件对实验数据进行处理，计算各亚群细胞比例。
五、实验结果1. T细胞亚群：CD3+T细胞占外周血淋巴细胞的50-70%，其中CD4+T细胞占CD3+T 细胞的30-45%，CD8+T细胞占CD3+T细胞的30-45%。
2. B细胞亚群：CD19+B细胞占外周血淋巴细胞的10-20%。
3. NK细胞亚群：CD16+/CD56+细胞占外周血淋巴细胞的5-15%。
1. 实验结果表明，本实验成功检测了T细胞、B细胞和NK细胞亚群，验证了流式细胞术在淋巴细胞亚群检测中的应用价值。
2. 淋巴细胞亚群在免疫调节中发挥重要作用。
CD4+T细胞具有辅助功能，参与细胞免疫和体液免疫；CD8+T细胞具有杀伤功能，直接杀伤病毒感染细胞和肿瘤细胞；B细胞产生抗体，参与体液免疫；NK细胞具有天然杀伤功能，对病毒感染细胞和肿瘤细胞具有杀伤作用。
淋巴细胞亚群检测方案
目和相对比例都在一定的范围内。
那么临床常见的淋巴细胞亚群包括哪些项目？一、淋巴细胞亚群二、抗体组合方案联合CD45的三色方案主要是有四种不同的试剂。
1.CD45/CD3/CD4这个抗体组合主要用来检测T3细胞和T4细胞。
2.CD45/CD3/CD8用来检测T3细胞和T8细胞。
3.CD45/CD3/CD19用来检测T3细胞和B细胞。
4.CD45/CD3/CD16和/或CD56用来检测T3细胞和NK细胞。
（三）双色方案如果实验室在边远的地区，条件不足，只能做双色方案，但是在双色方案中建议要把CD3加进来，因为CD45能很好地将白细胞和其他的干扰细胞，尤其是红细胞进行区分。
如果不能用CD45，最好能用到CD3，CD3可以特异的标记T淋巴细胞，T淋巴细胞和CD4做双标可以克服单一的CD4抗体。
为此，双色方案中也分为四管，每管当中建议都包含有CD3。
1.CD3/CD4用来检测T3细胞和T4细胞。
2.CD3/CD8用来检测T3细胞和T8细胞。
3.CD3/CD19用来检测T3细胞和B细胞。
4.CD3/CD16和/或CD56用来检测T3细胞和NK细胞。
尽管检测条件不允许做四色或三色的分析，但也至少要用CD3和其他的直标抗体进行双免疫荧光染色方案，不建议采用单色方案进行淋巴细胞亚群分析。
（四）7-氨基放线菌素D(7-AAD)联合CD45方案1．目的对于超过24小时的标本或肉眼观察发现已经变质的标本，需使用7-氨基放线菌素D（7-AAD）结合CD45（评估淋巴细胞、单核细胞和粒细胞死亡）复染评估细胞活力。
2.判定7-AAD荧光染料主要染活细胞，主要用来鉴定细胞活性。
（1）7-AAD阴性者是活细胞群。
（2）7-AAD阳性者为细胞膜不完整的死细胞群。
（3）7-AAD阴性细胞群阴性细胞群计数为75%时为最低细胞活力。
（4）对于细胞活力低于75%的标本，建议采用7-AAD结合CD45的方案，包括①～③的组合方案。
三、数据采集和分析（一）联合CD45和SSC设门确定淋巴细胞群方案1和方案2都存在CD45，首先建议采用联合CD45和侧向散射光SSC设门来确定淋巴细胞群。
淋巴细胞亚群检测及临床应用
一、概述
二、淋巴细胞亚群检测
1、检测原理
• 把全血加入到试剂中时，荧光标记的抗体会和白细胞表面抗原特异性结合，在采集 时，细胞通过激光束使激光散射。被染色的细胞就会发出荧光。这些被仪器检测到 的散射光和荧光信号提供了关于细胞大小、内部复杂度和相关荧光强度等信息。 BD Multitest检测试剂采用了荧光触发技术，能够直接对淋巴细胞群进行荧光设门， 以减少门中的未裂解细胞或有核红细胞带来的污染。
射光照射。于室温下(20-25℃)进行此程序操作 • 盖上管盖并轻轻混匀振荡进行混匀。室温(20-25℃)环境下避光孵育15min上
机检测。
二、淋巴细胞亚群检测
3、操作步骤-品牌B（六色淋巴细胞亚群试剂）
• 取一支 Trucounttube。用反向加样法加入50μl充分混匀的抗凝全血。注意血 不要碰到试管底部的微球( Beads)。
液时，将按钮按至第二个刻度点。释放按钮时，过量样本将被吸入吸头中。 将按钮按至第一个刻度点排出精确体积的样本，将过量样本留在吸头中。
二、淋巴细胞亚群检测
3、操作步骤-品牌B（四色淋巴细胞亚群试剂）
• 盖上管盖并轻轻混匀振荡进行混匀。在室温(20~25℃)环境下避光孵育 • 向各管中添加450μl 1× Multitest溶血素，注意：小心保护样本管，免受直
不能使用。室温保存的抗凝全血，可稳定48h;染色固定后的样本在2~8℃条 件下可稳定24h。 • 患者准备：无须特殊准备，检查对象生活饮食处于日常状态，空腹为宜， 静脉采血。
二、淋巴细胞亚群检测
3、操作步骤-品牌A
流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群指南
488nm的 激 发 光 源 激 发 ,最 大 发 射 波 长 分 别 为
525nm、 575nm、 670nm、
675nm和
613nm。
别 藻 青 蛋 白 (APC)的 激 发 光 源 为 630nm,最 大 发 射 波 长 为 660nm。
3.2
溶血素 使 用 与 仪 器 相 匹 配 的溶 血 素 (内 含 固定 液 ),并 严 格 按 照 使 用 说 明 和 注 意 事 项 进 行 操 作 。 如 果 使 用
FCSC Count StandardtM(Flow C~vt° metry Standards Corporaton)和
TruCountTM(Becton Ekkns° ω 等 。
4
标 本 采集 和 处理 生物 安 全 血 液 和体 液 标 本 中可 能存 在致 病 性 甚 至致 死 性 的活 体 病 原 微 生 物 ,所 有 标 本 都 应 当作 潜 在 传 染 源
3.1.2
单抗对 细胞 的反应 性
CD45表 达 于 所 有 白细 胞 ;CD3表 达 于 T淋 巴细 胞 ;CD4表 达 于 T辅 助 /诱 导 淋 巴细 胞 (CD4+T细 胞 )和 单 核 细 胞 ;CD8表 达 于 细 胞 毒 T细 胞 (CD8・ T)和 NK细 胞 ;CD19表 达 于 B淋 巴 细 胞 ;CD16表 达 于 NK细 胞 、 核 巨 噬 细 胞 、 细 胞 和 树 突 状 细 胞 等 ;CD56表 达 于 NK细 胞 和 细 胞 毒 T细 胞 。 单 粒
2
术语和定 义 下 列 术 语 和定 义适 用 于 本 文 件 。
2.1
分 化 抗 原 cIuster of differentiation,CD 活 成 不 同谱 系 细 胞 在 分 化 、 熟 、 化 过 程 中 ,出 现 或 消 失 的 细 胞 表 面 标 志 。 细 胞 表 面 标 志 通 常 用 单 克 隆抗 体 来 识 别 。每 个 抗 体 都 有 指 定 的 CD编 号 ,能 被 特 定 抗 体 识 别 的特 定 抗 原 通 常 具 有 相 同 的 编 号 ,例 ” “ ” “ 如 ,被 CD1抗 体 识 别 的抗 原 称 为 tlDl抗 原 。
淋巴细胞亚群
NK自然杀伤细胞：是一类独立的淋巴细胞群， 不表达特异性抗原识别受体。无需抗原预先致 敏即可直接杀伤某些靶细胞，包括病毒感染细 胞和突变的肿瘤细胞。 NK细胞表面标志物：CD3-/CD16+CD56+
淋 巴 细 胞 亚 群 意 义
CD3+T细胞：反映机体细胞免疫应答的能力。 CD3+CD4+T细胞：1.针对胞内寄生的病原体；2.辅 助体液免疫应答。 CD3+CD8+T细胞：主要杀伤病毒、某些胞内寄生菌 的宿主细胞、肿瘤细胞等。 CD19+B细胞：反应机体体液免疫应答的能力。 NK细胞：非特异性杀伤肿瘤细胞、病毒或细菌感染的 细胞。
T淋巴细胞亚群临床意义
CD3+降低：见于自身免疫性疾病，如SLE、类风湿关节炎 等。 CD3+增高：T系淋巴细胞白血病，重症肌无力，慢性活动性 肝炎等 。 CD4+降低：见于恶性肿瘤、遗传性免疫缺陷症、艾滋病、 应用免疫抑制剂者。 CD8+降低：见于自身免疫性疾病或变态反应性疾病。 CD8+增高：多见于病毒感染，如HBV、HCMV、EB等。 CD4+/CD8+比值增高：自身免疫性疾病、病毒性感染、变 态反应等。 CD4+/CD8+比值减低：见于艾滋病(常<0.5)，恶性肿瘤进行 期和复发时。
TH1和TH2细胞之间相互牵制，各自分泌的细 胞因子可对对方起负反馈调节作用。
Th1细胞介导的细胞免疫效应
Th2辅助体液免疫应答的机制
CD3+CD8+杀伤T细胞
CD8+T细胞又称细胞毒性T细胞，Tc或CTL，它在T 细胞免疫应答中发挥重要功能。 CTL主要杀伤胞内寄生病原体（病毒、某些胞内寄生 菌等）的宿主细胞、肿瘤细胞。
淋巴细胞亚群检测五项解读
淋巴细胞亚群检测五项解读
淋巴细胞亚群检测，是一种检测人体免疫系统活动的实验方法，主要用于诊断感染性疾病，判断炎症反应和抗原抗体的变化情况。
检测时，将血液样本中的淋巴细胞按照不同形态特征进行分类，如：B细胞、T细胞、自然杀伤细胞、单核细胞等，从而了解患者的免疫状态，进而更好地诊断和治疗疾病。
淋巴细胞亚群检测五项解读：
1）B细胞比例：B细胞是淋巴细胞的主要组成部分，可以产生抗原抗体，从而帮助抗击外界病原体的侵袭。
正常情况下，B细胞比例多在20%~30%之间。
2）T细胞比例：T细胞主要负责维持人体的免疫平衡，其中CD4+T细胞和CD8+T细胞是T细胞的重要组成部分，正常情况下，CD4+T细胞比例在40%~50%之间，CD8+T 细胞比例在20%~30%之间。
3）自然杀伤细胞比例：自然杀伤细胞（NK细胞）是免疫系统的重要组成部分，可以有效抑制病毒感染和恶性肿瘤的生长。
正常情况下，NK细胞比例多在15%~20%之间。
4）单核细胞比例：单核细胞也是淋巴细胞的一种，可以促进炎症反应，也可以抑制炎症反应。
正常情况下，单核细胞比例多在3%~7%之间。
5）淋巴细胞比例：淋巴细胞比例反映着人体免疫系统的活动情况，正常情况下，淋巴细胞比例多在25%~45%之间。
淋巴细胞亚群流式
淋巴细胞亚群流式
淋巴细胞亚群流式是一种通过流式细胞术检测淋巴细胞亚群的方法。
流式细胞术是一种用于分析细胞特性和功能的生物技术，通过将单个细胞与特异性抗体结合，对细胞表面和内部标记物进行定量和定性分析。
在淋巴细胞亚群流式中，通过使用特异性抗体标记不同的淋巴细胞亚群，如T细胞、B细胞、NK细胞等，然后利用流式细胞仪对标记后的细胞进行快速分析和计数。
这种方法可以获得淋巴细胞亚群的相对百分比和绝对值，从而评估机体的免疫状态。
淋巴细胞亚群流式在临床诊治中发挥了重要作用。
例如，在白血病诊断和治疗中，通过监测异常淋巴细胞亚群及绝对计数结果，可以为临床初步判断信息提供依据。
同时，在诊疗阶段，更为明确的白血病分型及MRD监测有助于为治疗方案选择、临床疗效分析、预后判断、复发监测等方面提供更加精准的医学决策支持。
此外，在免疫重建过程中，多参数流式细胞术结果对于及时评价患者的细胞免疫功能，指导免疫抑制剂等药品的使用种类和剂量等方面均具有重要价值。
需要注意的是，临床检测都有标准化的检测方案，可以直接上机调用建立好的内置模板，使用比较方便。
流式细胞术检测淋巴细胞亚群的原理及注意事项
流式细胞术（flow cytometry）是一种广泛应用于生物医学领域的技术，它通过检测细胞表面和内部分子的存在和数量，从而可以对细胞进行高度特异性的分析和分类。
在临床诊断、生物医学研究以及药物开发等方面都有着重要的应用。
其中，流式细胞术检测淋巴细胞亚群，可以帮助我们更好地了解免疫系统的功能状态，对于免疫相关疾病的诊断和治疗具有重要意义。
本文将从原理和注意事项两个方面，深入探讨流式细胞术检测淋巴细胞亚群的相关知识。
**一、流式细胞术检测淋巴细胞亚群的原理**1. 标本处理流式细胞术检测淋巴细胞亚群的首要步骤是标本处理。
通常情况下，我们会收集外周血进行检测。
在实际操作中，需要抗凝剂进行处理，避免血液凝固，从而保证细胞的完整性。
2. 抗体染色标本处理完成后，接下来是抗体染色。
我们会选择特定的单克隆或多克隆抗体，将其与待检测的淋巴细胞结合。
这些抗体会携带着荧光标记，通过激光的激发，可以将淋巴细胞亚群进行精准识别。
3. 流式细胞分析染色完成后，样本会被注入到流式细胞仪中，通过激光的激发和散射光的检测，可以将不同淋巴细胞亚群进行高效、高速的分析。
在这一步骤中，流式细胞仪会根据荧光信号的强度和特异性来对淋巴细胞进行分类和计数。
4. 数据分析通过计算机对流式细胞仪获取的数据进行分析和解读，我们可以得到淋巴细胞亚群的比例、数量和表达特征等信息，从而更好地了解免疫系统的状态和功能。
**二、流式细胞术检测淋巴细胞亚群的注意事项**1. 样本保存在进行流式细胞术之前，我们需要认真保存样本，避免细胞的损伤和变性。
通常情况下，标本需要在4摄氏度下保存，并尽快进行检测，避免细胞的失活和降解。
2. 抗体选择在进行抗体染色时，需要根据实际情况选择合适的抗体，保证其对于待检测的淋巴细胞具有高度的特异性和亲和性。
还需要注意避免抗体的交叉反应，以免对结果的准确性造成影响。
3. 仪器校准流式细胞仪作为检测设备，需要定期进行校准和质控。
淋巴细胞亚群检测操作程序
一、目的：保证流式细胞仪检测外周血中淋巴细胞亚群检验的工作质量，旨在保证淋巴细胞亚群检测的标准操作程序和控制检测结果的精确度与准确度。
二、修改程序：本标准操作程序的改动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：质量主管、授权人（科主任），方可改动。
三、适用范围：外周血中淋巴细胞亚群检测。
四、溯源：MultiTEST IMK Kit(美国BD Biosciences公司；CAT:340503)。
五、实验原理：人的淋巴细胞根据其生物功能和细胞表面抗原的表达可分为三大类：T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK自然杀伤细胞。
T淋巴细胞表达CD3；B淋巴细胞表达CD19；NK自然杀伤细胞表达CD56或CD16，并且不表达CD3。
利用各种单克隆抗体与淋巴细胞表面抗原结合，再配多色荧光染料，即可以把淋巴细胞区分为各种亚型。
进面得到各亚群的比例。
六、主要试剂：MultiTEST IMK Kit(美国BD Biosciences公司；CAT:340503)，其中包括：1、CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PreCP/CD4-APC2、CD3-FITC/CD16+56-PE/CD45-PreCP/CD19-APC3、FACSLysing Solution七、实验操作：抗凝真空采血管，抽取静脉血2ml。
1、标本采集：使用EDTA-K22、染色和固定细胞：（1）标本管编号A，取两只流式专用管A1、A2。
（2） A1管加入CD3-FITC/CD16+56-PE/CD45-PreCP/CD19-APC 20uL；A2管加入CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PreCP/CD4-APC 20Ul。
（3） A1、A2管中分别再加入全血100Ul，混均。
（4）置室温，避光孵育15min。
（5）加入FACSLysing溶血液2.0ml，置室温，避光孵育10min。
（6） 300g离心5min，弃上清液。
（7） PBS洗涤细胞两次，300g离心5min，弃上清液。
新版流式淋巴细胞亚群检测技术原理
B 细胞
GM-CSF, TGF-
CD8+ 抗原肽+ 感染病毒的 FasL 穿孔素, 粒酶，IFN-, -细胞免疫
CTL I 类分子 靶细胞
TNF-, TNF-
T4细胞增高
提醒体内存在细菌等病原微生物感染，主要见于临床多种 细菌性感染性疾病。
器官移植发生排斥反应 支气管哮喘 SLE活动期 某些免疫增强药物旳有效成果 注意:昼夜变化（傍晚旳峰值可为上午旳两倍）
常用荧光素
荧光素分子 FITC PE PerCP APC PE-Cy5 PE-Cy7
激发光波长 （nm）
488 488 490 633 488 488
发射光波长 （nm）
525 575 675 660 670 755
中文名 异硫氰酸荧光素 藻红蛋白 多甲藻叶绿素蛋白 别藻青蛋白 藻红蛋白-花青素5 藻红蛋白-花青素7
药物/放化疗等） 急慢性肝炎患者 呼吸道感染患者 胰岛素依赖型糖尿病患者
谢谢大家！
免疫荧光染色
FCM可检测下列细胞成份： 表面标识物 胞浆标识物 核内标识物 可溶性成份
联合CD45旳四色方案
第一种是用CD45/CD3/CD4/CD8做四色标识，主要能够检测 T3细胞、T4细胞、T8细胞这三种不同旳亚群
CD45-FITC CD4-RD1 CD8-ECD CD3-PC5
T4/T8细胞比值与肿瘤
恶性肿瘤患者术前T4/T8细胞比值低，手术后比值恢复正 常
当发生癌转移时,T3、T4细胞数明显降低旳同步T8细胞数 明显增多
T4/T8比值明显降低,提醒恶性肿瘤患者晚期细胞免疫功能 更低,预后更差
B细胞旳功能
①产生抗体
②提呈抗原 ③免疫调整
B细胞增高
T细胞亚群
T细胞亚群
静脉血2ml,肝素抗凝，20min内送检。
成熟的T淋巴细胞表面均可表达CD3分子，而CD4、CD8不能同时表达于成熟的T 淋巴细胞表面，故可将成熟的T淋巴细胞分为CD4+T细胞和CD8+T细胞二个亚群。
血液中T淋巴细胞亚群的检测是观察机体细胞免疫水平的重要方法，对恶性肿瘤、自身免疫性疾病、免疫缺陷病、血液系统疾病的诊断、治疗及预后判断有重要作用。
【正常参考值】
CD3 65.3～77.7 %
CD4 40.4～51.0 %
CD8 22.9～32.9 %
CD4/CD8 1.33～1.99 %
【异常结果分析】
CD3下降常见于①恶性肿瘤；②自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎等；③先天性免疫缺陷病,艾滋病；④接受放疗、化疗或者使用肾上腺皮质激素等免疫抑制剂。
CD3上升则见于慢性活动性肝炎、重症肌无力等。
CD4／CD8的比值做为免疫调节的一项指标，正常值约1.4～2.0，若其比值＞2. 0或＜1.4，表明细胞免疫功能紊乱。
CD4／CD8＜1．4常见于①免疫缺陷病，如艾滋病的比值常小于0.5；②恶性肿瘤；③再生障碍性贫血，某些白血病；④某些病毒感染。
CD4／CD8＞2.0常见于自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎等。
淋巴细胞亚群分析方案及其正常值
淋巴细胞亚群分析方案及其正常值CD45FITC/CD14PECD3TC-CD4PE-CD8FITCCD3FITC/CD16+56PECD19TC淋巴细胞亚群三色分析方案：管A：CD45/CD14确定FS vs SS中淋巴细胞门位置（详见下），此管对于自配溶血剂用户必做此质控管。
管B：阴性对照管，用来设置各PMT电压和阴性区域。
管C：CD3/CD4/CD8三色检测管，监调节荧光补偿之用。
管D：CD3/CD16+56/CD19三色检测管。
一个适当的分型方案应能够提供最精确地、明确地区分出各类细胞亚群。
方案中所选抗体应能够最大限度地反应出整个标本中细胞的信息，提供样本管之间的对比质控来保证各个测定管之间的结果的一致性。
方案设计中不仅要检测阳性标本，还要包括阴性群体来作阳性标本荧光强度的对照。
美国疾病控制中心制定了一套检测T淋巴细胞亚群的方案，可作为参照来检测样本。
双色法Tube Number FITC PE Use1CD45CD14光散射坐标设门2CD3CD19总T和B淋巴细胞3CD3CD4总T和CD4阳性T淋巴细胞4CD3CD8总T和CD8阳性T淋巴细胞5CD3CD16and CD56总T和NK细胞三色法Tube Number FITC PE PE-Cy5Usage 1CD45CD14X光散射坐标设门2CD8CD4CD3T细胞及其亚群3CD3CD16and CD56CD19NK细胞及B细胞CD45和CD14在白细胞上有着不同的表达，固它们可用来在光散射坐标上区分淋巴细胞群体或其他细胞。
（a）所有的白细胞都表达CD45，它是一个白细胞共同抗原又名T200。
淋巴细胞表达最高，单核细胞其次，中等表达CD45；粒细胞CD45表达最弱；红细胞、血小板和非血液细胞都不表达CD45。
（b）因为所有的白细胞都表达CD45，所以不能运用一固定的阴性标准来区分淋巴细胞、单核细胞和粒细胞。
（c）CD14在单核细胞上高表达并弱表达于成熟粒细胞。
淋巴细胞亚群检测操作方法
淋巴细胞亚群检测操作方法
淋巴细胞亚群检测是通过流式细胞术来进行的。
下面是其操作方法的一般步骤：
1. 预处理样本：收集新鲜的全血样本，并将其分成多个试管。
每个试管中的样本应含有适当的抗凝剂（例如EDTA），以防止血液凝固。
2. 样本染色：将每个试管中的全血样本分成不同的管中，每个管中加入不同的单克隆抗体染色。
根据实验需要，可以选择染色CD3、CD4、CD8、CD19等表面标记物来区分不同的淋巴细胞亚群。
染色时间和温度根据抗体厂商的建议进行。
3. 洗涤：将染色后的细胞悬液用PBS或其他适当的缓冲液洗涤，以去除未结合的抗体。
每个管中的细胞可用700 rpm离心3-5分钟，将上清液倒掉。
4. 固定：将细胞悬液溶入适当量的荧光素（如二甲亚基绿），用PBS稀释至适当浓度，静置固定30分钟。
固定之后，可以继续离心去除上清液。
5. 流式细胞术：将固定的细胞悬液在流式细胞仪中进行检测。
根据实验需要，设置适当的流速和激发波长来检测不同染色的细胞。
通过检测细胞表面荧光素的强度，可以确定不同淋巴细胞亚群的百分比和数量。
需要注意的是，以上是一般的操作方法，具体的步骤可能会因实验目的、试剂和仪器的不同而有所变化。
因此，在进行实验之前，最好参考实验方案和相关的文献资料，以确保操作的准确性和可靠性。
四色淋巴细胞亚群分析实验快速指南
用 MultiSET 分析以前的数据：
1. 同上机检测的 1、2 步，第 3 步 Set Up 界面下，数据来源选择 From Data Files. 2. 进入 Test Prefs 界面，同上机检测步骤 5。 3. 进入 Samples 界面，点击 Add Sample 按键加入数据。 4. 点击 Run tests 键进入获取界面，无需任何调整，自动进入 Analysis 界面，同
样检查自动设门情况，适当调整。 5. 其它同上机检测。
-2-
11. 生成并打印各种报告。
注：在 Multi-tube QC 中，第一项 Lymphosum 的值在 95-105%范围内可以接 受；第二项 CD3% Lymph Difference 的值一般 1-2%，但不能超过 5%；Th/Ts 的比值范围 0.7~2.87。
12. 如果有多个样本，将回到 Acquisition 界面重复，全部结束后，生成 Summary Report。
7. 点击菜单栏中的 Cytometer， （1） 在下拉菜单中依次选择 1、2、3、4。 （2） 在下拉菜单中选择 Instrument Setting 项，调出机器设置条件，用 FACSComp 自 动 校 准 的 条 件 存 于 BD Files/Instrument Setting Files/Calib File.LNW，Open-Set-Done。
Report”三个选项，软件会自动生成文件，存储在设置文件夹中，单击 Location 可以选选择“Until‘Next’Button Pressed”。 4. 单击 Accept，进入 FACSComp 界面，根据需要选择 Launch FACSComp，进 入 FACSComp 进行仪器设置调整，或者 Skip FACSComp 跳过这一步。 5. 进入 Test Prefs 界面确定报告内容， （1） 在 Physicians Report Choices 中，全选，其它默认选项。 （2） 在界面下方，进入 Panel Tools，在 Panels 中选择“4 Color TBNK”，
淋巴细胞亚群检测操作方法
淋巴细胞亚群检测操作方法淋巴细胞是免疫系统中一种重要的细胞类型，负责识别和清除体内的病原体。
淋巴细胞可以分为不同的亚群，包括T细胞、B细胞和自然杀伤细胞等。
淋巴细胞亚群检测可以帮助了解患者的免疫系统状态，判断免疫功能的异常情况，临床应用广泛。
1.检测前的准备工作：a.检测设备：流式细胞仪b.试剂：荧光标记的单克隆抗体c.样本：外周血（或其它体液）2.样本的预处理：a.收集外周血样本b.加入抗凝剂（如EDTA）稀释血液c.转移稀释后的血液到离心管中d.进行离心，使细胞沉淀在离心管底部e.弃去上清液，保留沉淀细胞3.细胞的染色：a.加入洗涤缓冲液洗涤沉淀细胞b.弃去洗涤缓冲液，在室温下重悬细胞4.荧光标记的抗体的加入：a.根据需要检测的细胞亚群选择相应的抗体b.添加荧光标记的抗体到细胞悬液中c.充分混匀细胞和抗体的混合物d.增加透明覆膜，避免光照射5.细胞的分析：a.打开流式细胞仪，设置相应的参数和通道b.将细胞悬液转移至流式细胞仪的样品管中c.启动细胞仪的运行d.分析获得的数据6.数据的解读：a.根据荧光标记抗体的特异性，将细胞亚群进行分类和计数b.根据不同细胞亚群的含量比例，判断免疫功能状态需要注意的是，淋巴细胞亚群检测需要流式细胞仪等高级设备，且操作需要一定的专业知识和技能。
在实际应用中，建议由有经验的专业人员进行操作和解读结果。
另外，不同的抗体组合可以用于检测不同的细胞亚群，应根据具体需要选择适当的抗体。
总结起来，淋巴细胞亚群检测操作方法主要包括样本的收集和预处理、细胞的染色、荧光标记抗体的加入、细胞的分析和数据的解读等步骤。
这些步骤需要严格操作和准确的仪器设备来保证数据的准确性和可靠性。
通过淋巴细胞亚群的检测，可以了解患者的免疫系统情况，为临床诊断和治疗提供重要的信息。
T淋巴细胞亚群检测操作程序
一、目的：保证流式细胞仪检测外周血中T淋巴细胞亚群检验的工作质量，旨在保证正确的T淋巴细胞亚群检测标准操作程序和控制检测结果的精确度与准确度。
二、修改程序：本标准操作程序的改动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：质量主管、授权人（科主任），方可改动。
三、适用范围：外周血中T淋巴细胞亚群的绝对计数检测。
四、实验原理：人的T淋巴细胞根据其生物功能和细胞表面抗原的表达可分为二大类：辅助/诱导T细胞和抑制/细胞毒T细胞。
辅助/诱导T淋巴细胞表达CD3和CD4；抑制/细胞毒T细胞表达CD3和CD8。
利用各种单克隆抗体与淋巴细胞表面抗原结合，再配多色荧光染料以及绝对计数管，即可以把T淋巴细胞区分为两种亚型，进面得到各亚群的绝对值。
六、主要试剂：CD4-FITC／CD8-PE／CD3-APC／CD45-PC7 (美国BCs公司；CAT:IM3548)，七、实验操作：抗凝真空采血管，抽取静脉血2ml。
1、标本采集：使用EDTA-K22、染色和固定细胞：（1）标本管编号A，取一只流式专用管A1。
（2） A1管加入CD4-FITC／CD8-PE／CD3-APC／CD45-PC7 20ul。
（3） A1管中再加入全血100ul，混均。
（4）置室温，避光孵育15min。
（5）加入FACSLysing溶血液2.0ml，置室温，避光孵育10min。
（6） 300g离心5min，弃上清液。
（7） PBS洗涤细胞两次，300g离心5min，弃上清液。
3、上机检测；分析结果；打印实验报告。
八、参考值：总T细胞（CD3+）： 59.4-84.6辅助/诱导T细胞(CD3+CD4+): 28.5-60.5抑制/细胞毒T细胞(CD3+CD8+): 11.1-38.3Th/Ts: 0.9-3.6九、临床意义：T淋巴细胞可以分为辅助/诱导T细胞和抑制/细胞毒T细胞。
测定CD4和CD8可用于化疗、自身免疫病的免疫监视。
t淋巴细胞亚群检测 标准
t淋巴细胞亚群检测标准一、样本采集1.采样时间：在早晨未接受任何其他处理之前，空腹状态下进行。
2.采样量：2-3ml外周血3.采样方式：静脉采血，使用EDTA抗凝管4.样本处理：采血后立即轻轻摇动抗凝管，使血液与抗凝剂充分混合，避免形成血块。
5.样本保存：采集后的样本应立即送检，或在4℃下冷藏保存，但不得超过48小时。
二、检测方法1.检测原理：采用流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）进行T 淋巴细胞亚群的检测。
通过荧光标记的单克隆抗体特异性识别淋巴细胞表面的标志物，将T淋巴细胞分为CD4+和CD8+两个亚群。
2.检测流程：a)预处理样本：将EDTA抗凝的全血样本进行涡旋混合，使红细胞和白细胞充分裂解。
b)抗体标记：向预处理后的样本中加入荧光标记的单克隆抗体，孵育一定时间后洗涤并固定细胞。
c)流式细胞术检测：将标记好的样本通过流式细胞仪进行检测，获取每个淋巴细胞的荧光信号。
d)数据处理与分析：使用软件对获取的荧光信号进行数据处理和分析，得到CD4+和CD8+两个亚群的细胞比例。
三、正常参考值根据正常参考值数据库的数据，正常成年人外周血中T淋巴细胞亚群的正常参考值范围如下：CD4+T细胞：40%-65%CD8+T细胞：20%-40%四、T细胞亚群的识别和计数1.CD4+T细胞的识别：通过流式细胞术检测样本中表达CD4分子的T细胞，以识别CD4+T细胞。
2.CD8+T细胞的识别：通过流式细胞术检测样本中表达CD8分子的T细胞，以识别CD8+T细胞。
3.计数方法：采用绝对计数方法，计算每微升血液中CD4+和CD8+T细胞的个数。
每微升血液中含有多少个淋巴细胞，其中有多少个是CD4+或CD8+T细胞。
五、质量控制1.仪器校准：使用流式细胞仪前必须对仪器进行校准，确保数据的准确性和可重复性。
2.试剂质量控制：采用高质量的抗体试剂和荧光标准品，确保检测结果的可靠性。
同时，对抗体试剂进行质量检测和控制，以确保其特异性和灵敏度。
淋巴细胞亚群绝对计数操作流程
淋巴细胞亚群绝对计数操作流程英文回答：Lymphocyte Subset Absolute Count Protocol.Principle:Lymphocyte subset absolute count is a quantitative analysis of lymphocyte subpopulations, such as CD3+, CD4+, CD8+, and CD19+ cells, in a blood sample. This procedure is used to assess the immune system's composition and function, particularly in conditions involving immune dysregulationor infection.Materials:Blood sample.Flow cytometry analyzer.Fluorochrome-conjugated antibodies specific for lymphocyte subpopulations.Lysis buffer.Wash buffer.Absolute counting beads.Procedure:1. Sample Preparation:Collect a blood sample into a tube containing an anticoagulant.Centrifuge the blood sample at 300 x g for 10 minutes.Remove the plasma and wash the cells with PBS.Lyse the red blood cells with lysis buffer.Centrifuge the cells and resuspend them in wash buffer.2. Antibody Staining:Aliquot the cells into tubes.Add fluorochrome-conjugated antibodies specificfor each lymphocyte subpopulation.Incubate the cells at room temperature in the dark for 15-30 minutes.3. Washing:Wash the cells twice with wash buffer.Centrifuge the cells and resuspend them in wash buffer.4. Absolute Count:Add absolute counting beads to the cell suspension.Acquire a flow cytometry data file.Gate on the lymphocyte population using forwardand side scatter.Use the absolute counting beads to calculate the absolute count of each lymphocyte subpopulation.Calculation:The absolute count of each lymphocyte subpopulation is calculated using the following formula:Absolute Count = (Event Count / Number of Beads) x (Bead Concentration)。
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目和相对比例都在一定的范围内。
那么临床常见的淋巴细胞亚群包括哪些项
目？
一、淋巴细胞亚群
二、抗体组合方案
联合CD45的三色方案主要是有四种不同的试剂。
1.CD45/CD3/CD4
这个抗体组合主要用来检测T3细胞和T4细胞。
2.CD45/CD3/CD8
用来检测T3细胞和T8细胞。
3.CD45/CD3/CD19
用来检测T3细胞和B细胞。
4.CD45/CD3/CD16和/或CD56
用来检测T3细胞和NK细胞。
（三）双色方案
如果实验室在边远的地区，条件不足，只能做双色方案，但是在双色方案中建议要把CD3加进来，因为CD45能很好地将白细胞和其他的干扰细胞，尤其是红细胞进行区分。
如果不能用CD45，最好能用到
CD3，CD3可以特异的标记T淋巴细胞，T淋巴细胞和CD4做双标可以克服单一的CD4抗体。
为此，双色方案中也分为四管，每管当中建议都包含有CD3。
1.CD3/CD4
用来检测T3细胞和T4细胞。
2.CD3/CD8
用来检测T3细胞和T8细胞。
3.CD3/CD19
用来检测T3细胞和B细胞。
4.CD3/CD16和/或CD56
用来检测T3细胞和NK细胞。
尽管检测条件不允许做四色或三色的分析，但也至少要用CD3和其他的直标抗体进行双免疫荧光染色方案，不建议采用单色方案进行淋巴细胞亚群分析。
（四）7-氨基放线菌素D(7-AAD)联合CD45方案
1．目的
对于超过24小时的标本或肉眼观察发现已经变质的标本，需使用7-氨基放线菌素D（7-AAD）结合
CD45（评估淋巴细胞、单核细胞和粒细胞死亡）复染评估细胞活力。
2.判定
7-AAD荧光染料主要染活细胞，主要用来鉴定细胞活性。
（1）7-AAD阴性者是活细胞群。
（2）7-AAD阳性者为细胞膜不完整的死细胞群。
（3）7-AAD阴性细胞群阴性细胞群计数为75%时为最低细胞活力。
（4）对于细胞活力低于75%的标本，建议采用7-AAD结合CD45的方案，包括①～③的组合方案。
三、数据采集和分析
（一）联合CD45和SSC设门确定淋巴细胞群
方案1和方案2都存在CD45，首先建议采用联合CD45和侧向散射光SSC设门来确定淋巴细胞群。
它是准确分析淋巴细胞亚群的第一步，可以用于来定位淋巴细胞群，把淋巴细胞群找到，排除标本中非淋巴细胞或细胞碎片的干扰。
首先在CD45/SSC散点图中，调整SSC，使所有白细胞群均可见。
第二步是根据CD45强阳性细胞群设门或者划定区域。
因为在CD45染色细胞中，淋巴细胞群呈现CD45强阳性和SSC弱表达。
设门时尽可能包括所有淋巴细胞，仪器会给一个提示，一共是包括了多少淋巴细胞数。
一般门内淋巴细胞数不低于95%，而且要排除单核细胞和嗜碱细胞的感染，因为单核和嗜碱在周围，很容易对淋巴细胞进行干扰。
单核细胞的CD45呈弱表达，而SSC呈中等强度表达。
嗜碱性粒细胞的CD45和SSC均为低表达。
如果不能确定标记的淋巴细胞群是否被设门设的比较准确，里面是否含有其他细胞的干扰，还有一个办法就是将CD3/SSC、CD19/SSC以及 CD56或CD（16+56）/SSC中T细胞、B细胞和NK细胞的分布特征筛选出来，并在CD45/SSC双参数散点图中显示，以监测设门的准确性。
当设门准确了，准确的找到淋巴细胞后，才能采集细胞数。
第三步，采集细胞数。
非设门荧光散点图中，每一荧光通道至少收集5000个淋巴细胞，以确保对数量较少的淋巴细胞亚群（如占总淋巴细胞数的10%）提供足够量的细胞。
从上面的图片上可以看到，图形中画黑框、标记是紫色的细胞是淋巴细胞群，在它的上方是单核细胞，用红颜色标记，嗜碱性细胞CD45和SSC的表达较低，用粉颜色标记的。
（二）淋巴细胞亚群分析和相对计数
首先在亚群分析时设置几个散点图：CD3/CD4散点图、CD3/CD8散点图、CD3/CD19散点图、CD3/CD56或CD（16+56）散点图。
散点图设置完后，在每一个荧光散点图中再设一个四象限门，将CD45/SSC散点图中
选定的淋巴细胞群中的表达该抗原的阴性细胞群和阳性细胞群区分开来。
第三步，进行淋巴细胞亚群计数。
T4细胞的计数，一般先得到一
个相对计数，也称为百分比，比如CD3/CD4散点图中CD3+CD4+细胞群占
CD45/SSC散点图中选定淋巴细胞群的百分比，这叫做T4细胞的相对计
数百分率。
它占的是前一个散点图，在第一次设门的散定图中淋巴细
胞的百分率。
T8细胞相对计数是CD3/CD8散点图中CD3+CD8+细胞群占
CD45/SSC散点图中选定淋巴细胞群的百分比。
B淋巴细胞计数是
CD3/CD19散点图中CD3-CD19+细胞群占CD45/SSC散点图中选定淋巴细胞
群的百分比。
NK细胞相对计数是为CD3/CD56或CD（16+56）散点图中
CD3-CD56+细胞群或CD3-CD（16+56） +占CD45/SSC散点图中选定淋巴细
胞群的百分比。
T3细胞的百分率在四个散点图中都可以计数，因为每一个散点图中都含有CD3的标记。
在CD3/CD4散点图中，计数为CD3+CD4-单阳性细胞群百分比和CD3+CD4+双阳性细胞群百分比的总和。
在CD3/CD8散点图中也一样，计数为CD3+CD8-单阳性细胞群百分比和CD3+CD8+双阳性细胞群百分比的总和。
在CD3/CD19散点图中，计数为CD3+CD19-细胞群百分比。
在CD3/CD56或CD3/CD（16+56）散点图中，计数为CD3+CD56-或
CD3-CD（16+56）-百分比和CD3+CD56+或CD3+CD（16+56）+百分比的总和。
（三）淋巴细胞亚群的绝对计数
根据淋巴细胞亚群相对计数结果，对于绝对计数来讲，通常有两种绝对计数的方法，一个是单平台法，一个是双平台法。
单平台方法是采用了一个内部的计数，计数的微球。
所有的数据都可以从流式细胞仪这一台仪器检测到，由专用软件直接计算生成，具体操作可以试剂操作说明书。
双平台方法，白细胞计数需要与亚群分析使用同一标本进行测试，并在6个小时内完成。
当白细胞计数不能准确获得时，不能用DP方法进行淋巴细胞绝对计数，只能采用SP方法。
不能采用淋巴细胞计数来计算淋巴细胞亚群绝对计数。
因为淋巴细胞计数在血细胞分析仪上表现出更大变异度，白细胞计数作为分母比淋巴细胞计数更为稳定。
（四）数据分析可靠性的验证
1. CD45
在有些验证中要采用CD45，CD45在三色和四色抗体组合方案的每一标本管中均存在，这样它既可以对淋巴细胞群进行设门，因为它在每一管中都存在，也可以根据CD45表达情况和图形分布情况检测和评估样本管间的变异，所以这是一个很好的一个验证方法。
重复结果间的差异如果大于（ ）说明样本管间的变异较大四、对照
那么为什么需要进行调整荧光补偿？
五、调整荧光补偿
调整的方式有手工的方式，还有软件自动补偿方式。
（三）补偿试剂的选择
1.一般选择与最强荧光信号相匹配的补偿试剂。
2. 三色抗体组合分析
三色抗体组合分析时要通过含有荧光微球或细胞补偿颗粒的4个单标记样本管来调整补偿。
第一管是无直标抗体标本管，只有标本没有抗体。
第二管是仅含有FITC直标抗体的阳性标本管。
第三管是仅含PE直标抗体的阳性标本管。
第四管是仅含第三种直标抗体的阳性标本管。
3.四色抗体组合分析
可以在三色抗体组合的基础上再加上一管，也就是第五个管子，第五管是仅含有第四种直标抗体阳性标本管。
（四）荧光补偿顺序
1.三色组合方案
依次是FITC、PE和第三种荧光。
先做FITC，然后PE，再做第三种荧光。
补偿达到一个理想状态是将不应该是两种荧光抗体双阳性的细胞群调整到相应的直角荧光象限中，使双阳象限中无荧光重叠。
要避免过度补偿，以防将双阳性细胞错误地识别为单阳性细胞。
2.四色组合方案
一般试剂说明书有一个很好的说明，可以按照说明书进行执行，要注意避免过度补偿。
六、结果报告和审核
（一）临床报告的内容
对于淋巴细胞亚群所出的临床报告，一般有以下几个内容：T3细胞相对计数(百分比)/绝对计数(绝对值)、T4细胞相对计数(百分比)/绝对计数(绝对值)、T8细胞相对计数(百分比)/绝对计数(绝对值)、B细胞相对计数(百分比)/绝对计数(绝对值)、NK细胞相对计数(百分比)/绝对计数(绝对值) 、T4/T8比值、参考范围、必要的解释和分析。
（二）审核内容
审核的内容包括有数据采集阈值的设定、采集细胞数和微粒数、散射光模式、抗体组合方案，与试剂结果相关的所有设门。
在发出报告之前，要把这些方面的内容都进行一个审核，审核确认无误后才能将结果发放给临床。
七、储存
（一）采用列表模式储存标本数据
数据在储存方面也有一定的要求，要把所有的原始数据进行储存，所以一般采用的是列表模式，储存标本数据，以确保对原始数据进行全面分析。
八、质量控制
胞和CD8。